PLoS ONE: Målretning Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor Forhindrer kræft i bugspytkirtlen Vækst og metastase

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest dødelige kræftformer. Stigende forekomst og dødelighed indikerer, at der stadig er meget mangler i påvisning og behandling af sygdommen. Dette skyldes til dels mangel på specifikke symptomer på tidlige stadier af sygdommen. Adskillige vækstfaktorreceptorer er blevet forbundet med kræft i bugspytkirtlen. Her har vi undersøgt, om et RNA-interferens tilgang målrettet til IGF-IR kunne være effektiv mod pancreas cancervækst og metastase. Til det, vi evaluerede effekten af ​​IGF-1R hæmning ved hjælp små interfererende RNA (siRNA) på tumorvækst og metastase i HPAC og PANC-1 bugspytkirtelkræft cellelinjer. Vi fandt, at lyddæmpende IGF-1R inhiberer pancreas cancervækst og metastase ved at blokere centrale signalveje sådan AKT /PI3K, MAPK, JAK /STAT og EMT. Silencing IGF-1R resulterede i en antiproliferativ virkning i Panc-1 og HPAC pancreatisk cancercellelinier. Matrigel invasion, transwell migration og sårheling analyser afslørede også en rolle for IGF-1R i metastatiske egenskaber af kræft i bugspytkirtlen. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved hjælp af Western blotting analyse af de vigtigste mellemprodukter involveret i proliferation, epitelial mesenkymale overgang, migration og invasion. Desuden blød agar-assays viste, at lyddæmpende IGF-1R også blokerer kolonidannende kapacitet bugspytkirtelkræftceller

in vitro.

Western blots, såvel som, flowcytometrisk analyse afslørede induktion af apoptose i IGF-1R lyddæmpede celler. Interessant silencing IGF-1R undertrykt også ekspressionen af ​​insulin receptor β. Alle disse virkninger sammen signifikant styre pankreatisk vækst cancercellen og metastase. Afslutningsvis vores resultater viser betydningen af ​​IGF-1R i bugspytkirtelkræft

Henvisning:. Subramani R, Lopez-Valdez R, Arumugam A, Nandy S, Boopalan T, Lakshmanaswamy R (2014) Målretning Insulin-Like vækstfaktor 1 receptor Forhindrer kræft i bugspytkirtlen vækst og metastase. PLoS ONE 9 (5): e97016. doi: 10,1371 /journal.pone.0097016

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: Januar 6, 2014 Accepteret: April 15, 2014; Udgivet: 8. maj 2014

Copyright: © 2014 Subramani et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af Texas Tech University Health Sciences center-Paul L. Foster School of Medicine midler. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bugspytkirtelkræft er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald, selv om det kun den trettende mest almindelige malignitet i verden [1]. 5 års overlevelsesrate for patienter med kræft i bugspytkirtlen er den laveste rapporteres for enhver kræft, som er mindre end 1 [2]%. Det er primært fordi kræft i bugspytkirtlen er vanskelig at opdage på tidlige stadier grund af mangel på tidlige advarselstegn eller symptomer [1]. Pankreatisk duktalt adenokarcinom (PDAC), som er den mest almindelige form for denne ekstremt aggressive cancer, er stærkt invasive og metastatiske og er meget modstandsdygtig over for alle former for eksisterende behandlinger [3]. Patienter, der er diagnosticeret med PDAC på fremskredne stadier har ringe håb om effektiv kirurgisk resektion [1] og andre behandlinger som stråling, kemoterapi (Gemcitabin, 5-fluoruracil, cisplatin, paclitaxel, docetaxel, etc.) eller målrettede behandlinger (Erlotinib-Tarceva) [4] i øjeblikket ikke tilbyder meget gavn enten. Den asymptomatisk sygdommens art i sin vorden har sikret, at PDAC stadig en dødelig og næsten uhelbredelige kræft på trods af flere forsøg på at finde bedre behandlingsstrategier [5]. Ifølge den seneste rapport, er cirka 280.000 nye kræfttilfælde pancreas diagnosticeret globalt og forekomsten af ​​kræft i bugspytkirtlen fortsætter med at stige [6], [7]. Stigende forekomst og dødelighed indikerer, at der stadig er meget mangler i påvisning og behandling af sygdommen. Det er derfor absolut nødvendigt at finde bedre diagnostiske og terapeutiske strategier til behandling af denne sygdom.

Adskillige vækstfaktorreceptorer, såsom insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF-1R), epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) etc., udtrykkes afvigende i mange typer cancer, herunder pancreascancer [8]. Øget IGF-1R ekspressionsniveauer er forbundet med højere risiko for at udvikle forskellige neoplasmer [9]. IGF-1R signalering akse er stærkt aktiveret under de tidlige stadier af lunge carcinogenese, hvor en rolle for IGF-1R signalering blev vist ikke kun i primær tumordannelse, men også i progression til mere aggressiv lunge adenocarcinom [10]. Jie Tang et al., 2013 rapporterede høje ekspressionsniveauer af IGF-1R i tumorvæv prøver fra 25 af 36 patienter med epitelial ovariecancer. De rapporterede også konsekvent højere niveauer af IGF-1 i primær cancer cellekulturer (230 ng /ml) sammenlignet med normale ovarievæv cellekulturer (101,9 ng /ml) [11]. IGF-1R signalering aktiverer intracellulære signalering kaskader, der omfatter phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), AKT, Rac og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) [12], [13]. Disse veje regulerer centrale gener involveret i forskellige cellulære funktioner, såsom proliferation, overlevelse, differentiering, transformation og apoptose [10]. Endvidere IGF-1R målretter 70 til 100% af de centrale metaboliske veje, der ofte ændres i PDAC patogenese [14]. Målretning IGF-1R er allerede blevet vist at forbedre de terapeutiske virkninger af mTOR inhibitorer i metastatisk renalcellekarcinom, [15]. Ligeledes i human epithelial ovariecancer, målretning IGF-1R af antisense nukleotid reduceret proliferation med 70% og clonogenicity med 10 gange [11]. I både in vitro og in vivo systemer, blev et IGF-1R-antagonist (monoklonalt antistof MK-0646) vist signifikant nedregulere X-bundet inhibitor af apoptose (XIAP) protein, som er blevet vist at være involveret i celle overlevelse og hæmning af celledød i kolorektal cancer [16]. Desuden har IGF-1R målrettede behandlinger allerede flyttet frem i kliniske fase I forsøg for prostata, bryst, kolorektal, lever, synovial sarkom, osv, [12], [17] – [19] med lovende første resultater. Men den potentielle fordel ved at bruge IGF-1R målrettet, terapi i bugspytkirtelkræft er ikke fuldt udforsket. Endvidere er der stadig mangel på detaljeret viden om de nøjagtige molekylære mekanismer, som IGF-1R regulerer bugspytkirtlen carcinogenese.

Derfor er baseret på stærke beviser for effekten af ​​at målrette IGF-1R i et bredt spektrum af kræft har vi fastslået effekten af ​​at målrette IGF-1R i bugspytkirtelkræft i denne undersøgelse. Det ultimative mål med denne undersøgelse er at identificere, om IGF-1R signalering er en effektiv terapeutisk mål for bugspytkirtelkræft med potentiale til at oversætte hurtigt til klinisk brug. Her har vi klart viser, at blokering af IGF-1R udtryk øger apoptose og undertrykker celle invasion, migration og metastase via modulering af PI3K /AKT, MAPK og JAK /STAT signalveje i bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle eksperimenter udført, blev godkendt af og udføres efter retningslinjerne fra Institutional biosikkerhed udvalg Texas Tech University Health Sciences center.

cellelinier og reagenser

Humane pankreatiske duktale adenocarcinom cellelinier, PANC-1 (epithelioid carcinoma), MIA PaCa-2 (carcinom) og HPAC (adenocarcinom) blev erhvervet fra American Type Culture Collection, og blev opretholdt i RPMI-1640 medium suppleret med 10 % FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% carbondioxid.

transit- siQUEST transfektionsreagens blev indkøbt fra Mirus Bio (Madison, WI, USA). Den 6,5 mm Transwell med 8,0 um porestørrelse polycarbonatmembran inserter blev opnået fra Corning Incorporated (Corning, NY, USA). BD Matrigel (Bedford, MA, USA) og BD Pharmingen Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit I (San Diego, CA, USA) blev opnået fra BD Biosciences. BSA blev erhvervet fra Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, USA). siRNA targeting IGF-1R blev indkøbt fra Origene (Rockville, MD, USA). MTS-reagens [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium] blev opnået fra Promega (Madison, WI, USA). Pattedyrprotein udvinding reagens (mPER) blev købt fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)

Følgende primære antistoffer blev anvendt i denne undersøgelse:. Pakt (sc-101.629), AKT (5298), Bcl- 2 (sc-783), pERK, (sc-101.760), ERK (sc-94) og STAT3 (H-190) (sc-7179) (Santa Cruz, CA, USA); IGF-1R (3027), Notch 2 (4530P), snail (3879), E-cadherin (3195), N-cadherin (4061), Zeb (3396), vimentin (5741), Slug (9585), Bax (2772 ), Caspase3 (9661), PARP (9542), pPI3K p85 (4228), PI3K p85 (4292), IR-β (3024), PIRs-1 (2388), IRS-1 (2382), pSTAT3 (ser727) ( 4113), COX-2 (4842), pPTEN (9549), pmTOR (2974), mTOR (4517), p-p70s6kinase (9206) og p70s6kinase (9202) (Cell Signaling Technology, (Boston, MA); Caspase8 (ab 25901) (Abcam, Cambridge, MA, USA); β-actin (Sigma-Aldrich, (St.Louis, MO, USA).. passende sekundære antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)

pancreas adenocarcinom tissue Array

pancreas adenocarcinom væv microarray (TMA) blev opnået fra US Biomax, Inc, Rockville, MD TMA indeholdende formalin-fikserede paraffin indlejrede prøver af pancreas adenocarcinom og normale pancreas væv blev underkastet immunhistokemi (IHC) for at bestemme IGF-1R ekspressionsniveauerne. Institutional Review Board godkendelse var ikke nødvendig for at bruge TMAs.

immunhistokemi (IHC)

IHC for IGF-1R-antigen blev udført ved hjælp af bugspytkirtlen adenocarcionma TMA. TMA’erne blev først inkuberet i en ovn ved 58 ° C i 2 timer, der kan forbedre væv adhæsion til de ladede objektglas. Afparaffinering blev derefter udført for at fjerne indlejrede medium ved anvendelse xylen inkubation i 20 minutter. TMA’erne blev gradvist rehydreret i serielle alkohol bade (100, 95, 70, 50 og 30%) efterfulgt af en destilleret vand vask i 5 minutter. Heat epitopgenfinding med trilogi (Cell Marque, Rocklin, CA) blev derefter udført for at afsløre de antigene steder inden for vævssnit. TMA’erne blev blokeret i TBS indeholdende 1% føtalt kalveserum og 1% bovint serumalbumin i 15 minutter. Perox-free blokerende reagens (Cell Marque, Rocklin, CA) blev også tilsat i 10 minutter for at blokere ikke-specifik antistofbinding. TMA’erne blev inkuberet med IGF-1R-antistof (1:50 fortynding) natten over ved 4 ° C. Objektglas blev derefter vasket tre gange i PBS i 5 min og inkuberet med Ultra Marque PolyScan HRP Label (Cell Marque, Rocklin, CA) i 1 time ved stuetemperatur. TMA’erne blev derefter vasket tre gange i PBS og farvet med chromogen opløsning (Cell Marque, Rocklin, CA) i 20 min. Chromogen farvning Reaktionen blev standset ved skylning med destilleret vand. Cellekerner kontrastfarvning udførtes med hematoxylin inkubation i 40 sek. TMA’erne blev skyllet med destilleret vand og dehydreret med serielle ethanol bade (30, 50, 70, 95 og 100%) efterfulgt af en xylen bad. Endelig blev TMA’er dækglas med montering medier (Surgipath Medical Industries, Richmond, IL) og digitale billeder blev taget med et Nikon Microscope- ECLIPSE 50i.

Silencing af IGF-1R i PANC-1 og HPAC Cells

siRNA rettet mod IGF-1R blev forbigående transficeret ind Panc-1 og HPAC celler ved hjælp MIRUS bio transit siQUEST transfektion reagens. Scrambled siRNA (ikke-silencing sekvens) blev anvendt som kontrol. Kort beskrevet blev celler podet i 6-brønds plader ved en densitet på 2,5 x 10

5 celler /brønd. Celler blev transficeret med forskellige koncentrationer og forskellige undertyper (A, B og C) af siRNA spænder fra 10 til 50 nM i 48 timer eller 72 timer, ved hjælp Mirus siQUEST transfektionsreagens. Forholdet mellem siRNA til transfektionsreagens blev opretholdt som 1:0.5 til effektiv lyddæmpning uden toksicitet ifølge fabrikantens protokol. De endelige koncentrationer af siRNA blev valgt baseret på dosis-respons-undersøgelser. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne anvendt for protein isolation eller clonogenicity, invasion og migration, studier. Apoptose blev undersøgt ved 48 og 72 timer efter silencing af IGF-1R.

cellelevedygtighed Assay Salg

Panc-1 og HPAC celler blev podet i plader med 96 brønde med en tæthed på 0,3 x 10

4 celler /brønd og 0,5 × 10

4 celler /brønd, henholdsvis og transficeret med IGF-1R i en slutkoncentration på 30 nM, subtype “B” og 50 nM, subtype “a” i 48 timer sammen med scrambled kontrol. Efter 48 timers transfektion blev cellelevedygtighed målt ved anvendelse af MTS-assayet. Absorbansen blev aflæst ved 490 nm for at beregne de procentvise levedygtige celler.

Clonogenicity /kolonidannelse Assay i blød agar

Kolonidannelse assay blev udført for at måle in vitro overlevelse evne af en enkelt celle til at vokse til en koloni i en forankringsuafhængig vækst miljø. Kort fortalt, efter transfektion af Panc-1 og HPAC celler med IGF-1R siRNA eller krypteret kontrol i 48 timer, blev disse transficerede celler udsået i komplet medium ved en densitet på 2 x 10

4-celler i 60 mm skåle indeholdende en top lag af 0,7% agar og et bundlag på 1% agar. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 til 4 uger, og derefter farvet med 0,2% Crystal violet. Kolonier af mere end 20 celler blev talt manuelt.

Sårheling Assay

Cell migrerer evne af IGF-1R tavshed bugspytkirtelkræftceller blev målt under anvendelse af scratch-assay. Kort beskrevet blev celler podet i 6-brønds plader ved en densitet på 3,5 x 10

5 celler /brønd for IGF-1R transfektion. På denne tæthed, PANC-1 og HPAC cellerne nåede monolag sammenflydning efter 48 × timer. En lige sår eller ridse blev derefter forsigtigt skabt i cellemonolagene med en steril pipettespids. Celler tage af bunden blev vasket to gange med PBS og kulturer blev derefter suppleret med frisk medium og overvåges i 96 timer ved 37 ° C under anvendelse af Biostation CT (Nikon Instruments Inc. Melville, NY, USA) for kontinuerlig observation. Den Biostation blev automatisk programmeret til at indfange billeder på 2 timers intervaller op til 96 timer. Migration billeder blev taget til fange og dokumenteret på forskellige tidspunkter ved hjælp af NIS-Element AR software.

Migration og Invasion Assay

Effekten af ​​IGF-1R siRNA på invasive egenskaber bugspytkirtelkræftceller blev evalueret ved hjælp af Transwell migration og invasion assays. Otteogfyrre timer efter transfektion blev PANC-1-celler og HPAC celler trypsiniseret og resuspenderet i FBS-frit RPMI-1640 medium. For migration assay, i alt 5 × 10

3 celler blev udpladet i det øverste kammer i Transwell med en noncoated polycarbonat membran (indsæt diameter 6,5 mm, 8,0 ìm porestørrelse, Corning Incorporated). For invasionen assayet blev 2 × 10

4 celler udpladet i det øverste kammer i Transwell med en Matrigelcoatede (1 mg /ml) polycarbonatmembran. RPMI-1640 medium med 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer som en kemoattraktant. Efter inkubation i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO

2 blev celler på den nedre overflade af membranen fikseret med 5% formalin og farvet med 0,2% krystalviolet. De ikke-migrerede celler på den øvre side af indsatsen blev tørret af med en vatpind. Billeder af celler, som migrerede til undersiden af ​​membranen blev fanget i en blindet måde ved 5 forskellige mikroskopiske felter med 20 ganges forstørrelse. Antallet af migrerede eller invaderede celler blev talt fra fem eller seks tilfældigt udvalgte felter i en blindet måde. Eksperimenter blev udført i triplikater for statistisk signifikans.

Analyse af celledød

Virkningen af ​​IGF-1R silencing på apoptose blev målt under anvendelse af Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit I. Celler blev høstet 48 timer og 72 timer efter transfektion og derefter farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid ifølge producentens anvisninger. Procentdelen af ​​celledød eller apoptose blev kvantificeret ved anvendelse af et flowcytometer (FACS Accuri C6) [20].

Western blotting-analyse

Panc-1 og HPAC celler blev transficeret med IGF-1R siRNA i 48 timer. Efter inkubationen blev protein ekstraheret fra transficerede celler ved at lysere cellemembranen ved hjælp pattedyrprotein Extraction Reagent (mPER) ifølge fabrikantens protokol. Proteinkoncentrationen blev kvantificeret under anvendelse af BSA standardmetode. Lige mængder af protein blev påsat og separeret ved SDS-polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membraner. Membranerne blev blokeret med 5% BSA i 1 X TBST i 1 time og probet med et panel af primære antistoffer mod Pakt, AKT, Bcl-2, pERK, ERK, STAT3, IGF-1R, Notch 2, snail, E-cadherin , N-cadherin, Zeb, vimentin, Slug, Bax, Caspase3, PARP, pPI3K p85, PI3K p85, IR-β, Pirs-1, IRS-1, pSTAT3, COX-2, pPTEN, pmTOR, mTOR, pp70s6kinase, p70s6kinase , Caspase8 eller β-actin. Efter vask med TBS-T, blev membranen inkuberet med sekundære peberrod peroxidase-koblede antistoffer og derefter positive bånd blev visualiseret under anvendelse af forøget kemiluminescens.

Statistical Analysis

Forskellene mellem grupperne blev analyseret ved uparret t-test. Den GraphPad Prism 5 softwarepakke udgave 5.03 blev brugt til at gøre alle de statistiske beregninger. Sandsynlighed værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

IGF-1R er overudtrykt i de pancreascancer

Vi undersøgte ekspressionsniveauerne af IGF-1R i. pankreatiske duktale adenocarcinom cellelinier (HPAC, MIA PaCa-2 og PANC-1) under anvendelse af western blot. Alle tre cellelinjer havde et højt niveau af ekspression af IGF-1R sammenlignet med normale pancreas. HPAC havde det højeste udtryk for IGF-1R blandt de tre pancreas cellelinjer vi analyserede mens PANC1 havde mindst udtryk. Så vi valgte at bruge HPAC og PANC1 celler for alle vores eksperimenter baseret på deres IGF-1R-ekspression (figur 1A). Immunohistokemisk analyse af IGF-1R i pancreas adenocarcinom væv microarray (TMA) blev udført for yderligere at bekræfte patofysiologisk rolle af IGF-1R i PDAC patogenese. PDAC tumorvæv på forskellige stadier viste øget ekspression af IGF-1R sammenlignet med normale pancreas væv (figur 1B).

(A) Ekspressionsniveauer af IGF-1R i PANC-1, HPAC og MIA PaCa-2 var sammenlignet med normale pancreasceller fra rotte under anvendelse af western blot. (B) Repræsentant immunhistokemisk analyse af IGF-1R af tumor etape i pancreas adenocarcinom væv og normal bugspytkirtlen væv. (C) PANC-1 og HPAC celler blev transficeret med tre forhåndsudformede IGF-1R siRNAs (A, B og C) ved tre forskellige koncentrationer (10, 30 og 50 nM) sammen med scrambled kontrol siRNA. Silencing effekt af IGF-1R siRNA blev bestemt under anvendelse western blot i PANC-1 og HPAC celler. (D) Effekt af IGF-1R siRNA på celle levedygtighed PANC-1 og HPAC. Celler blev transficeret med 30 nM og 50 nM IGF-1R siRNA i PANC-1 og HPAC celler hhv. Cellelevedygtighed blev analyseret ved 48 timer efter transfektion under anvendelse af MTS-assay kit. Resultater repræsenteres som middelværdier ± standardafvigelse (n = 3). (E) Hæmning af IGF1R udtryk blokke kolonidannende kapaciteter bugspytkirtelkræftceller, PANC-1 og HPAC. En blød agar-assay blev anvendt til at undersøge kolonidannelse evne Panc-1 og HPAC celler. Otteogfyrre timer efter siRNA transfektion blev PANC-1 og HPAC cellerne lov til at vokse i 0,7% agarose i RPMI-1640-suppleret med 10% FBS i 16 og 22 dage henholdsvis. Vist her er repræsentative billeder af kolonidannelse fra to uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer. (F) Procent kolonier i både PANC-1 og HPAC celler blev beregnet med scrambled kontrol (SCR) tjener som baseline.

Silencing IGF-1R hjælp siRNA’er i bugspytkirtelkræft cellelinier

For at lukke munden på IGF-1R udtryk, vi brugte 3 forskellige siRNAs ved koncentrationer i området fra 10 til 50 nM. Scrambled siRNA der ikke er målrettet helst gen blev anvendt som en kontrol. siRNA transfektionseffektivitet varierede baseret på undertype og koncentrationen af ​​siRNA for begge cellelinier. Følgelig blev IGF-1R ekspressionsniveauer væsentligt reduceret ved en koncentration på 30 “B” nM og 50 nM “A” for Panc-1 og HPAC cancerceller, (figur 1C). Derfor blev disse to siRNA doser udvalgt til alle efterfølgende undersøgelser.

Silencing IGF-1R inducerer anti-proliferativ effekt i bugspytkirtelkræft cellelinier

Da IGF-1R er kendt for at stimulere celledeling, undersøgte vi effekten af ​​silencing IGF-1R på proliferation af pancreas adenocarcinom-celler. Silencing IGF-1R faldt levedygtighed bugspytkirtelkræftceller ved 48 timer efter transfektion sammenlignet med scrambled siRNA transficerede kontrolceller. Kun 45,24% 47,28% celler var levedygtige ved IGF-1R inhibering i PANC1 og HPAC celler, henholdsvis (figur 1D). Den anti-proliferative effekt af målretning IGF-1R er meget signifikant i begge de meget aggressive pancreatiske cancercellelinier. Disse resultater tyder på en central rolle for IGF-1R i spredning af aggressive bugspytkirtelkræftceller.

Silencing IGF-1R Forhindrer Anchorage-uafhængig Vækst af bugspytkirtelkræftceller

Anchorage-uafhængig vækstpotentiale cancerceller er en af ​​de vigtige og velkendte karakteristiske træk af transformerede celler. Blød agar-assays i Panc-1 og HPAC-celler blev udført for at vurdere, om IGF-1R knockdown påvirket kolonidannende potentiale af disse celler. Silencing IGF-1R dramatisk reduceret den kolonidannende kapacitet i begge bugspytkirtelkræft cellelinier (figur 1E). Resultater fra tre uafhængige forsøg blev kvantificeret, der afslører 85% hæmning af kolonidannende kapacitet i IGF-1R tavshed bugspytkirtelkræftceller (figur 1F)

IGF-1R Silencing Undertrykt kræft i bugspytkirtlen Cell Migration /motilitet

(i) sårheling assay.

Reduceret kolonidannende evne er generelt forbundet med en tilsvarende tab af invaderende evner kræftceller [20]. Den klassiske sårhelende assay blev udført for at teste den rolle af IGF-1R i reguleringen af ​​migreringsevnen af ​​pankreatiske cancerceller. Cellemonolag ridset at skabe et sår til at overvåge det migrerende evne både kontrol- og IGF-1R undertrykt bugspytkirtelkræftceller. IGF-1R undertrykte Panc-1 og HPAC celler udviste reduceret migrerende kapacitet sammenlignet med scrambled kontroller. HPAC scrambled kontrolceller reformerede et komplet monolag inden for 48 timer og PANC-1 scramblet kontrolceller reformerede et komplet monolag inden 96 timer. I IGF-1R undertrykte Panc-1 og HPAC celler, blev et komplet monolag ikke reformeret selv efter 96 timer (figur 2A, B B). Taget sammen indikerer disse resultater, at lyddæmpende IGF-1R ikke kun nedsætter migration evne, men også de invasive egenskaber af pankreatiske duktale adenocarcinomceller.

(A) PANC-1 og HPAC celleinvasion blev vurderet i transwell kamre overtrukne med matrigel. Celler, der invaderede den Matrigelcoatede insert blev fikseret, farvet og erobrede på 20 × forstørrelse. (B) Antal besatte celler blev talt og udtrykt som procent invasion. Eksperimenter blev udført tre gange (C) IGF-1R nedregulering inhiberer ekspression af flere epitel-mesenchymale overgange markører. Total proteinlysater fra scrambled kontrol og IGF-1R tavshed PANC-1 og HPAC-celler blev analyseret for ekspression af Notch-2, snail, E-cadherin, N-Cadherin, Zeb, vimentin, og Slug sammen med intern kontrol β-actin. (D) Densitometic værdier af EMT-markører er vist som% ekspression. PS-PANC-1 Scrambled, PI-PANC-1 IGF-1R tavshed, HS-HPAC Scrambled, HI-HPAC IGF-1R tavshed.

Silencing IGF-1R Blocks Epithelial-mesenkymale Transition (EMT ) i bugspytkirtelkræftceller

processen med kræftcelle invasion er aktiveret af EMT, som er initiativtager til metastatisk kaskade [21]. Celler, som undergår EMT vil opnå stamcellelignende egenskaber, som øger celleproliferation, metastase, etc. [22]. EMT-relaterede faktorer såsom Notch-2, snail, N-cadherin, Zeb, vimentin og Slug blev reduceret signifikant ved silencing IGF-1R i Panc-1 og HPAC celler (figur 3C tab af denne celle-celleadhæsionsmolekyle antages at fremme invasion og metastase [23]. Disse data viser tydeligt, at lukke munden på IGF-1R i bugspytkirtelkræftceller resulterer i hæmning af proteiner, der fremmer kræft i bugspytkirtlen EMT.

Silencing IGF-1R fremkalder apoptose

Regulering af apoptose i bugspytkirtelkræftceller blev analyseret ved IGF-1R lyddæmpning ved hjælp Annexin V-FITC apoptose Detektion Kit I. Flowcytometrisk analyse viste en udtalt induktion af apoptose /celledød ved IGF-1R silencing i bugspytkirtelkræftceller (45,4%, 55,4% i PANC-1 og 47,7%, 59,5% i HPAC blev observeret efter 48 timer og 72 timer post transfektion, henholdsvis) (figur 4A . B)

(A) IGF1R inhibering inducerer apoptose i PANC1 HPAC celler. Efter transfektion blev cellerne farvet med Annexin-V-FITC og propidiumiodid efterfulgt af flowcytometri. Procentdelen af ​​tidlige apoptotiske (nederst til højre kvadrant), apoptotiske (øverst til højre kvadrant), sene apoptotiske og nekrotiske celler (øverst til venstre kvadrant), og lever sunde celler (nederste venstre kvadrant) er vist. (B) Procentvis apoptose og celledød er sammenfattet i tre uafhængige forsøg i Panc-1 og HPAC celler. (C) IGF-1R-inhibering inducerer død receptor og mitokondrie-medieret apoptose i PANC1 HPAC celler. Bax, Bcl-2, caspase 8, caspase 3 og spaltes PARP og β-actin-ekspression blev analyseret under anvendelse af Western blot i IGF-1R siRNA-transficerede Panc-1 og HPAC celler. (D) repræsentant densitometrianalyse viser signifikant potentiering af apoptose via interne og eksterne reaktionsveje. PS-PANC-1 Scrambled, PI-PANC-1 IGF-1R tavshed, HS-HPAC Scrambled, HI-HPAC IGF-1R tavshed.

For at identificere den molekylære mekanisme er involveret i denne induktion af apoptose undersøgte vi ekspressionsmønsteret for flere apoptotiske signaleringsmolekyler i bugspytkirtelkræftceller. Celler transficeret med IGF-1R siRNA havde signifikant forøget ekspression af Bax, Caspase 8, Caspase3 og spaltes PARP i sammenligning med celler behandlet med scrambled siRNA (figur 4C & D). Silencing IGF-1R reducerede også anti-apoptotiske protein Bcl-2 i både PANC-1 og HPAC celler (figur 4C & D). Disse data viser, at IGF-1R siRNA inducerer apoptose via både død receptor og mitokondrie medierede veje for apoptose.

Silencing IGF-1R Alters Key signalmolekyler

Hæmning kun et enkelt medlem af en bestemt signalering sti eller målretning kun én bestemt cellulære funktion kan være utilstrækkelig til at behandle komplekse sygdomme som kræft. Derfor rettet mod molekyler med størst virkning på flere onkogene signalveje vil have større translationel potentiale for klinisk PDAC behandling. I den forbindelse valgte vi at udføre en endnu mere omfattende analyse af virkningerne af IGF-1R lyddæmpning i Panc-1 og HPAC celler og har bekræftet, at IGF-1R rent faktisk koordinere reguleringen af ​​flere cellulære involverede veje i overlevelse, spredning , metastase, EMT, apoptose og cellecyklus signalering (figur 5)

(A, C & E):. effekten af ​​IGF-1R undertrykkelse på AKT /PI3K signalering blev undersøgt i bugspytkirtelkræftceller. Panc-1 og HPAC celler blev behandlet med IGF-1R siRNA i 48 timer. Cellerne blev høstet, og ekspressionen af ​​phospho-AKT, AKT, phospho-PI3K, PI3K, phospho-PTEN, phospho-mTOR, mTOR, phospho-p70s6kinase, p70s6kinase og den interne kontrol β-actin blev målt ved Western blotting. (B, D & F): Densitometrisk analyse er også vist til højre for hvert repræsentativt billede

AKT er en af ​​de mest udtrykte konstitutivt molekyler i mange cancere og har vist sig at forbedre maligne. celleproliferation [24].