PLoS ONE: kræft i skjoldbruskkirtlen Imaging in vivo ved Målretning af antiapoptotiske Molecule galectin-3

Abstrakt

Baggrund

Forekomsten af ​​skjoldbruskkirtlen knuder stiger med alderen, gennemsnitlig 4-7% for USA voksne befolkning, men det er meget højere (19-67%), når sub -clinical knuder betragtes. Omkring 90% af disse læsioner er godartede og en pålidelig tilgang til deres præoperativ karakterisering er nødvendig. Desværre konventionel skjoldbruskkirtlen scintigrafi tillader ikke sondringen mellem benigne og maligne thyreoidea proliferationer men det giver kun funktionel information (

kolde eller varme knuder

).

udtryk for den anti-apoptotiske molekyle galectin- 3 er begrænset til kræftceller og denne funktion har potentielle diagnostiske og terapeutiske implikationer. Vi viser her mulighed for at få kræft i skjoldbruskkirtlen imaging

in vivo

ved at målrette galectin-3.

Metoder

galectin-3 baseret skjoldbruskkirtel immuno-scintigrafi bruger som radiotracer en specifik

99mTc-radioaktivt mærket mAb. En position-sensitive høj opløsning mini-gamma-kamera blev anvendt som billeddannelse capture enhed. Humane galectin-3 positive kræft i skjoldbruskkirtlen xenografter (ARO) og galectin-3 knockout tumorer blev brugt som mål i forskellige eksperimenter

in vivo

. 38 mus med tumormasse på cirka 1 g blev injiceret i halevenen med 100 uCi

99mTc-mærket mAb til galectin-3 (30 ug protein /i 100 pi saltvandsopløsning). Tumor billeder blev erhvervet til 1 time, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 24 timer efter injektion ved hjælp af mini-gamma-kamera.

Resultater

Resultater fra forskellige på hinanden følgende forsøg viser et optimalt visualisering af kræft i skjoldbruskkirtlen implanteret mellem 6 og 9 timer fra injektion af radiotraceren. Galectin-3 negative tumorer blev ikke detekteret overhovedet. Efter 6 timer efter injektion galectin-3 udtrykkende tumorer blev korrekt visualiseret, medens hele kroppen aktivitet i det væsentlige havde ryddet.

Konklusioner Salg

Disse resultater demonstrerer muligheden for at skelne præoperativt godartet fra maligne thyreoidea knuder ved hjælp af en specifik galectin-3 radio-immunotargeting.

In vivo

billeddannelse af kræft i skjoldbruskkirtlen kan give en bedre udvælgelse af patienter henvist til operation. Muligheden for at anvende denne metode til billeddannelse og behandling af andre galectin-3 udtrykker tumorer diskuteres også

Henvisning:. Bartolazzi A, D’Alessandria C, Parisella MG, Signore A, Del Prete F, Lavra L, et al. (2008) kræft i skjoldbruskkirtlen Imaging

In Vivo

ved Målretning af antiapoptotiske Molecule galectin-3. PLoS ONE 3 (11): e3768. doi: 10,1371 /journal.pone.0003768

Redaktør: Andrew Boswell, Genentech, USA

Modtaget: Juni 23, 2008; Accepteret: November 2, 2008; Udgivet: 20. november 2008

Copyright: © 2008 Bartolazzi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af AIRC (italiensk Association for Cancer Research). Ingen andre sponsorer spillet en rolle i dette papir

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den høje forekomst af godartede skjoldbruskkirtlen knuder i voksne befolkning gør den præoperative påvisning af kræft i skjoldbruskkirtlen sammenlignes med ‘lede efter en nål i en høstak «. Forekomsten af ​​skjoldbruskkirtlen knuder stiger med alderen, gennemsnit 4-7% for U.S.A. voksne befolkning [1], men det er meget højere (19-67%), når subkliniske knuder betragtes også [2]. Heldigvis omkring 90% af disse læsioner er godartede og af denne grund er nødvendig [1], [3].

Ekspressionen af ​​natriumiodid symporteren (NIS) en pålidelig og systematisk tilgang til deres præoperativ karakterisering på membran af skjoldbruskkirtlen celler tillader skjoldbruskkirtlen at koncentrere iodid fra serummet. NIS-medieret iodid optagelse er nødvendig for de efterfølgende organificeringen og oxidationstrin, som er vigtige begivenheder til produktion af skjoldbruskkirtelhormoner. Denne ejendommelige egenskab af kirtel understøtter konventionelle skjoldbruskkirtlen scintigrafi, som bruger radiojod definere skjoldbruskkirtlen i både fysiologiske og patologiske tilstande [4]. Denne udbredte teknik betyder imidlertid ikke tillade sondringen mellem benigne og maligne thyreoidea proliferationer. Faktisk selvom kræft er usædvanligt i skjoldbruskkirtlen knuder med effektiv iodid optagelse (formuleret

hot knuder

), det store flertal af skjoldbruskkirtlen proliferationer, der undlader at koncentrere iodid (

kolde knuder

) er biologisk godartet [ ,,,0],4].

Normalt skjoldbruskkirtlen celler udtrykker ikke galectin-3. En tvungen udtryk for galectin-3

via

specifik cDNA transfektion genererer en transformerede fænotype, blokerer apoptotiske program, en funktion, der fremmer udviklingen af ​​kræft [5] – [9]. Interessant, som tidligere rapporteret i et stort multicenter retrospektiv undersøgelse om histologisk materiale, vel-opdelte skjoldbruskkirtlen karcinomer næsten altid udtrykke galectin-3 ( 94% af alle typer kræft i skjoldbruskkirtlen, med udelukkelse af medullært), mens godartede skjoldbruskkirtlen proliferationer gøre ikke (kun 2% af de godartede knuder, oftest repræsenteret af adenomer, var galectin-3 positiv) [10]. Dette resultat blev bekræftet af flere undersøgelser rapporteret i litteraturen [11] – [14] og galectin-3 immunfarvning anvendes allerede i den kliniske praksis, ved immuno-cytologisk niveau, for en bedre udvælgelse af patienter henvist til thyroidektomi [10], [15] – [17]. I denne undersøgelse, ved at bruge

in vivo

ex vivo

forsøgsmodeller af kræft i skjoldbruskkirtlen viser vi mulighed for at få en pålidelig kræft i skjoldbruskkirtlen imaging

in vivo

ved at målrette den galectin-3 lectin molekyle. Denne diagnostiske fremgangsmåde kan også bruges til billeddannelse forskellige galectin-3 udtrykker tumorer

in vivo

.

Materialer og metoder

cellelinjer og galectin-3 mRNA interferens

Thyroid carcinoma cellelinier ARO, venligst stillet til rådighed af Dr. Silvia Soddu (National Cancer Institute Regina Elena i Rom, Italien) er tidligere beskrevet [18] – [19]. Selvom skjoldbruskkirtlen oprindelsen af ​​ARO celler er blevet afhørt for nylig [20], denne galectin-3 positiv cellelinie vokser meget effektivt

in vivo

og giver en nyttig model til indstilling eksperimenter af galectin-3 immunotargeting med og uden galectin -3 mRNA indblanding. Celler blev dyrket i standardbetingelser ved 37 ° C og 5% CO

2 atmosfære i RPMI-1640 medium suppleret med 2 mM glutamin, 10% FCS, penicillin og streptomycin (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).

i galectin-3 mRNA interferens tre forskellige sekvenser blev identificeret og testet som tidligere [21] rapporterede. De to følgende sekvenser, som kraftigt og ligeledes ned regulerede galectin-3-ekspression i ARO-celler blev sub-klonet ind pSUPER vektor og anvendes i flæng (konserverede motiver er understreget): 5′-GATCCCCCAACAGGAGAGTCATTGTTTTCAAGAGAAACAATGACTCTCCTGTTGTTTTTGGAAA-3 ‘(Gal3-551, sense); 5’-AGCTTTTCCAAAAA CAACAGGAGAGT-CATTGTTTCTCTTGAAAACAATGACTCTCCTGTTGGGG-3 ‘(Gal3-551, antisense); GATCCCCACCTTACATGTGTAAAGGTTTCAAGAGAACCTTTACACATGTAA-GGTTTTTTGGAAA-3 ‘(Gal3-845, fornuft); og 5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTTAC-ATGTG TAAAGGTTCTCTTGAAACCTTTACACATGTAAGGTGGG-3 ‘(gal3-845, antisense).

I eksperimentet vist i figur 1 (felt B) ARO-celler blev stabilt transficeret med pSUPER-Gal3-551 (aro- gal-3i) vektor og mock transficeret med pSUPER vektor som kontrol (ARO-ctr). Valg af stabilt transficerede celler blev udført ved behandling med puromycin 2 mg /ml (Sigma) 72 timer efter transfektion.

A) Billede erhvervet med en høj opløsning mini gammakamera i en mus bærende ARO (Gal3 +) xenograft efter 6 timer fra iv injektion af 100 uCi

99mTc-mærket mAb mod galectin-3. Pilen viser tumormassen åbenbaret i venstre ben. En konsekvent akkumulering af radioen sporstof observeres i leveren efter afslutning af exogent mAb (panel 1A); Morfologisk og immunhistokemisk evaluering af de udskårne tumor xenograft viser en dårligt differentieret thyreoideacancer med en variabel ekspression af galectin-3, som afsløret ved en galectin-3-specifikke mAb og en direkte immunperoxidasefarvning metode (panel 2A); Tabellen viser den kinetiske af tumor /normal muskel-forhold på radioen sporstof på forskellige tidspunkter (panel 3A). B) Billede erhvervet med en høj opløsning mini gammakamera i en mus der bærer galectin-3 blandede ARO xenograft (Gal3-) efter 6 timer fra i.v. injektion af 100 uCi

99mTc-mærket mAb til galectin-3 (panel 1B); Immunhistokemisk evaluering af den udskårne tumor viser en konsekvent nedregulering af galectin-3-ekspression (panel 2B); Effektiviteten af ​​stabile galectin-3 RNA-interferens i nedregulering galectin-3-ekspression påvises i immunblotting. ARO-celler mock-transficeret med pSUPER vektor blev anvendt som kontrol (CTR); galectin-3 blandede ARO celler blev stabilt transficeret med pSUPER-Gal3-551 vektor (Gal3i); α-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. Den densitometrianalyse af de molekylære arter visualiseret i gelen er også vist (panel 3B). Resultater udtrykkes som relative densitometridata enheder (RDU), målt normaliserende Gal-3 signal med den tilsvarende α-tubulin båndintensitet.

nedregulering af galectin-3-ekspression blev kontrolleret i Western blot-analyse ved forskellige tidspunkter (12-72 timer efter transfektion og tumorceller injektion i mus).

monoklonale antistoffer og immunhistokemi

A oprenset peberrod-peroxidasekonjugeret (HRP-konjugeret) monoklonalt rotte antistof mod galectin -3 (SPACE srl, Milano, Italien) blev anvendt i immunohistokemisk-cytokemi ifølge producentens instruktioner som tidligere beskrevet [13]. Kort fortalt, antigen-hentning mikrobølgebehandling af væv objektglassene i 0,01 mol /l citratbuffer, pH 6,0 blev anvendt i tre cyklusser af 3 minutter hver ved 750 W. Oprenset rotte-mAb rettet mod galectin-3 blev anvendt ved en koncentration intervallet 5-10 ug /ml. Den enzymatiske aktivitet blev visualiseret med 3, 3′-diamino-benzidin (Dako, Glostrup, Danmark).

Western Blot-analyse

Total celleekstrakter (TCES) blev opnået under anvendelse af en lysisbuffer sammensat af: Tris-HCI 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 1%, PMSF 1 mM og 1 tablet af komplet protein inhibitor cocktail (Roche). En alikvot af TCE (30-70 ug) blev separeret i 10% SDS-PAGE og derefter blottet på nitrocellulosemembran (Bio-Rad). Følgende antistoffer blev anvendt i immunblotting: et oprenset rotte-mAb til galectin-3 (Mabtech AB, Nacka Strand, Sverige), et muse-mAb-anti-α-tubulin (TU-02, Santa Cruz Biotechnology) og HRP-konjugeret anti-muse IgG og anti-rotte IgG specifikke antisera (Sigma). Immunreaktivitet blev påvist ved hjælp af kemo-luminescens analyse (ECL kit, Amersham Corporation). De molekylære arter løst på western blotting blev endeligt analyseret ved densitometri under anvendelse af en dedikere software (NIH ImageJ, udgave 1.32j).

Resultater udtrykkes som relativ densitometri (RDU) efter normalisering med densitometridata værdier af bandet opnået for α-tubulin.

murine modeller af kræft i skjoldbruskkirtlen implanteret

patogenfrie 4-5 uger gamle nøgne

(nu /nu)

mus (Charles River , USA) blev anvendt til oprettelse af kræft i skjoldbruskkirtlen implanteret

in vivo

. Musene blev holdt i bure af 4 dyr hver med vand og mad

ad libitum

. Galectin-3 udtrykke og meget tumorigen dårligt differentieret follikulært thyreoideakarcinom cellelinje (ARO), og de afledte galectin-3 knockout ARO celler (ARO-Gal3 negative) blev anset for disse eksperimenter.

Vild-type og blandede ARO celler blev holdt i standard dyrkningsbetingelser som førnævnte, løsrevet fra vævskulturplader med trypsin 0,05% EDTA 0,02% (Gibco), vasket i sterilt PBS og injiceret subkutant i nøgne mus ved en koncentration i intervallet fra 7 × 10

6 til 10

7 celler /0.2 ml saltopløsning, afhængigt af forsøget. Injektion af cellerne blev udført ved anvendelse af en standard insulin nål.

nr anæstesi var nødvendig. Halvtreds dyr blev anvendt i tre forskellige sæt eksperimenter for oprettelse tumor xenografs. Mus blev undersøgt tre gange om ugen for tegn på målbar tumorvækst.

Mus blev udvalgt til

in vivo

imaging eksperimenter, når tumor vægt var omkring 0,5-1 g. For at bestemme

in vivo

ekspression af galectin-3 i tumor-xenotransplantater blev nogle af tumorerne kirurgisk udskåret og anvendt til galectin-3-ekspression analyse som rapporteret ovenfor. Dette arbejde blev udført i henhold til de specifikke retningslinjer, som det italienske sundhedsministerium for dyreforsøg. Denne undersøgelse er blevet godkendt af Institutional Etisk udvalg for dyreforsøg på National Cancer Institute Regina Elena Rom. Dyret facilitet på NCI i Rom er certificeret af det italienske ministerium for Folkesundhed.

Radio mærkning af monoklonalt antistof til galectin-3

Affinity renset og stærkt koncentreret (5 mg /ml) monoklonalt antistof mod human galectin-3 (Mabtech, Nacka, Sverige) blev radioaktivt mærket ved anvendelse af fremgangsmåden tidligere rapporteret [22]. Kort fortalt blev antistof-disulfidbroer reduceres ved anvendelse af et molært overskud af 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af oprensning med en Sephadex G-25 søjle (Amersham Biosciences GmbH, UK) og nitrogen-gennemskyllet kold phosphatpuffer pH 7,4 som elueringsmiddel. Det reducerede antistof blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Aktiveret galectin-3 mAb (400 ug /200 pi volumen) blev mærket ved tilsætning af 7 pi af en methylen-diposphonate (MDP) knoglescanning kit (Medrotec®, Amersham Health, UK) som tidligere beskrevet [22] og 10 mCi (370 MBq) af

99mTcO

4

– frisk elueres fra (

99Mo /

99mTc) generator (GE-Healthcare, UK). Mærkningseffekt (LE) blev vurderet ved anvendelse af Instant Thin Layer Chromatography (ITLC-SG, VWR, Italien) med 0,9% NaCl som mobil fase.

Strimlerne blev analyseret ved et edb mini-radio scanner (Bioscan System , Italien). LE, var . 95% med en endelig specifik aktivitet på 70 uCi /ug (. Fig S1 online)

For at optimere effektiviteten af ​​antistof mærkning adskillige forsøg blev udført at variere molforholdet 2-mercaptoethanol /mAb (interval: 1.000:1 til 4.000:1) og forholdet mAb /

99mTc til mærkning (interval 250.000:1 til 4.500.000:1)

reduktionen af ​​disulfid broer på et. molforhold på 2145:1 (2-mercaptoethanol /mAb) og et molforhold på 1,500,000:1 for Ab /

99mTc gav den højeste LE af

99mTc-anti-galectin-3 og blev anvendt til alle yderligere eksperimenter (fig. S1 online).

Særlige stabilitetskrav blev udført inkubering frisk radio-mærket antistof i saltvand eller humant plasma ved 37 ° C i 24 timer og evaluering af den radiofarmaceutiske renhed ved ITLC-SG på forskellige tidspunkter (1 time, 3 timer, 6 timer og 24 timer). Stabiliteten i saltvand og plasma var høj i de første 6 timer ( 90% og 80% for saltvand og plasma, henholdsvis) med et mindre fald på 24 timer (. Fig S1 online)

. High resolution gamma Camera

High resolution gamma kamera (HRC) (Li-tech Srl, Italien), vist i figur S2 online består af en krystal-kollimator struktur koblet til en Hamamatsu H8500 (Hamamatsu, Japan) Position Sensitive Photo Multiplier Tube (PSPMT), opkræve udlæsning elektronik og et dataopsamlingssystem

Den patenterede parallel hul kollimator, der allerede er beskrevet [24] – [25]. er lavet af ren Wolfram med 200 um tyk membran. Den består af en 24 mm kollimator arrangeret over en supplerende 6 mm kollimator struktur, hvor krystallerne er integreret ind i hullerne. Den scintillation struktur er sammensat af 20 × 20 Csl (Tl) krystaller array (Spectra Physics-Hilger, UK) med et synsfelt (FOV) på 49,0 × 49,0 mm

2. Krystalformerne dimensioner er 2,05 × 2,05 × 5,0 mm

3, og hver krystal er dækket by100 um hvid reflekterende epoxy på sine fem blinde overflader. Krystalstrukturen-kollimator struktur er koblet til PSPMT via optisk fedt.

H8500 PSPMT har en ekstern størrelse på 52,0 x 52,0 x 18,0 mm

3 med et aktivt areal på 49,0 x 49,0 mm

2. Fotokatoden er bi-alkali og multiplikation systemet, komponeret af 12 metal kanal dynoder, giver en gevinst på 3 × 10

6 @ -1000 V.

multiplicerede ladning indsamles af en række af 8 × 8 anoder.

udlæsning er en miniaturiserede (52,0 × 52,0 × 5,0 mm

3) front-end elektronik, og signalerne samples med en dedikeret kompakt USB ADC bord. Købet system giver 4 kanaler på 20 M prøver /sek. erhvervelse og behandling af data foretages på en Linux Embedded System er udstyret med ARM CPU PXA255 med 10 “touch screen. Styresystemet og databehandling software er proprietære applikationer udviklet i C ++ sprog. Systemet tillader udførelse af en real-time erhvervelse med en refresh tid på 0,5 sek. Systemet er udformet til at være en batteridrevet bærbar enhed; som en konsekvens detektorhovedet vægte omkring 2 kg, mens den samlede vægt er omkring 4,5 kg.

HRC energi opløsning er omkring 20% ​​FWHM @ 140 keV (

99mTc) over hele FOV. Følsomheden er 210 cps /MBq og ensartethed er ± 5%, mens det giver 2,2 mm iboende rumlig opløsning egnet til vores billeddannelse eksperimenter

in vivo

med tumor xenotransplanterede mus, og

ex-vivo

med kirurgiske prøvemateriale fra humane patienter.

ex vivo imaging af menneskelig kræft i skjoldbruskkirtlen

Som en proof of concept for imaging differentieret thyreoideacancer i menneskelige, vi udførte

ex-vivo

bindingsundersøgelser ved anvendelse som målrette en frisk metastatisk cervical lymfeknude udskåret fra en patient, der bærer en papillær thyreoideakarcinom. Umiddelbart efter kirurgisk fjernelse lymfeknuderne blev skåret i halve på langs gennem kræft læsion og de to vævssnit blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer i en 50 ml opløsning indeholdende 2 uCi af

99mTc-anti-Gal-3 ( 0,1 ug protein) i saltvandsopløsning med 1% HSA i nærvær eller fravær af 100 ug ikke-mærket anti-Gal-3-antistof

Resultater Salg

for at vurdere bindingsspecificiteten af ​​et

99mTc-mærket mAb til galectin-3

in vivo

, seks dyr, der bærer galectin-3 positive carcinom xenografter (ARO-Gal-3

+) blev behandlet i et indledende forsøg.

Mus med tumormasse på ca. 1 g blev injiceret i halevenen (iv) med 100 uCi

99mTc-mærket mAb til galectin-3 (30 ug protein /i 100 pi saltvandsopløsning). Billeder blev erhvervet efter 1 time, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 24 timer efter injektion ved hjælp af mini-gammakamera. Galectin-3 immunotargeting af ARO tumorer var meget effektiv i xenotransplanterede mus. Et centralt område af tumor nekrose (histologisk bekræftet) med nedsat binding af radiotracer var korrekt afbildet i et af de tilfælde (fig. S2 online). Indledende forsøg med forskellige galectin-3 positive tumorer, herunder melanomer, lymfomer og brystcarcinomer blev også overvejet til dette formål med overlappende resultater (data ikke vist). Som forventet blev størstedelen af ​​galectin-3 radio mærket antistof koncentreret i leveren efter clearance af exogene mAb’er fra blodet [26] (fig. S2 online). For at optimere den billeddannende opsamling og at demonstrere bindingsspecificiteten af ​​galectin-3 mAb større

in vivo

eksperiment (gentaget i tre eksemplarer) blev overvejet.

Forsøget omfattede 12 xenotransplanterede mus , to grupper af seks dyr i hver. Den første gruppe blev transplanteret med galectin-3 positive ARO-celler ved en koncentration på 5-8 x 10

6 celler /0,2 ml saltopløsning /mus; den anden gruppe mus blev transplanteret med galectin-3 knockout ARO celler (ARO-Gal3 negative) fremstillet ved anvendelse af en specifik galectin-3 RNA-interferens (IRNA) [20].

ARO-Gal3 negative celler injiceret subkutant i en koncentration på 10

7cells /0,2 ml saltopløsning /mus, for at fremme en hurtig vækst tumor

in vivo

i ca. 4 dage.

Det var påkrævet for at opretholde en effektiv nedregulering af galectin-3 ekspression i stabil blandede ARO celler, der vokser

in vivo

i fravær af puromycine som selektive antibiotikum. Galectin-3 nedregulering i stabil blandede ARO celler blev kontrolleret i western blot på forskellige tidspunkter (12-72 timer). Efter 4 dage fra celle injektion alle musene udviklede en synlig subkutan tumor med en størrelse på 0,5 cm median diameter. Dyrene blev derefter injiceret i halevenen med 100 uCi

99mTc-mærket mAb til galectin-3 (30 ug protein) og hele kroppen billeder blev erhvervet efter 1 time, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 24 timer ved hjælp af høj opløsning gammakamera.

Billeder blev analyseret tegning regionerne af interesse (ROI) over den implanterede tumor og i håndkøb laterale muskel taget som baggrund. Som forventet den optimale visualisering af ARO-Gal-3

+ xenotransplantater blev opnået mellem 6 og 9 timer fra injektion af radiotraceren, hvorimod galectin-3 negative tumorer blev ikke detekteret overhovedet (fig. 1 panel A og B) . Tumorer blev endelig eksplanteret til histologisk evaluering og immuno-fænotypisk analyse som vist i figur 1.

I et andet sæt eksperimenter blev 20 ARO xenotransplanterede mus injiceret med 100 uCi

99mTc-mærket mAb til galectin -3 (30 ug protein) og 5 grupper på 4 dyr hver blev aflivet ved 3 timer, 6 timer, 9 timer, 12 timer og 24 timer efter injektion hhv.

Vævsprøver fra blod, lever, milt, nyre, tyndtarm, tyktarm, muskel og ARO tumorxenografter blev fjernet, vejet og talt for tilstedeværelse af radioaktivitet. Alle dyr blev afbildet før aflivning med reproducerbare resultater (data ikke vist).

in vivo

bio-fordeling af radioaktivt mærket galectin-3 mAb udtrykt som procent af injiceret dosis pr gram væv (% ID /g), viste en hurtig blod clearance af radioaktive lægemiddel inden for 3 timer fra injektion. Det meste af radioaktiviteten blev fundet i lever og nyrer, der angiver en hurtig clearance af sporstoffet

via

lever- og urinveje (tabel 1).

Som forventet tumoren optagelse af den galectin-3 specifikt

99mTc-mærket mAb steg fra 3 til 9 timer efter injektion. På 6 timer efter injektion var målet tumorer klart synlige, mens hele kroppen aktivitet hovedsagelig havde ryddet (tabel 1 og fig. S2 online).

Selv oversættelse af disse fund i kliniske omgivelser kræver brug af humaniseret mAbs knyttet til forskellige radionuklider og mere omfattende prækliniske studier, vi har forsøgt at simulere en galectin-3-baserede billeddannelse af human cancer i skjoldbruskkirtlen

ex-vivo

. Til dette formål en frisk cervikal lymfeknude kirurgisk udskåret fra en patient, der bærer en papillær thyreoideakarcinom metastase (histologisk bekræftet) blev anvendt som mål for at studere bindingen effektiviteten af ​​Gal-3 specifikt radiotracer.

Umiddelbart efter kirurgisk fjernelse lymfeknuderne blev halveret gennem kræft læsion og blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer i 50 ml saltvandsopløsning indeholdende 2 uCi af

99mTc-mAb til galectin-3 (0,1 pg protein) og 1% humant serumalbumin, i nærvær eller fravær af 100 ug ikke-mærket (kold) anti-galectin-3 mAb (forskydning assay).

Efter omfattende vaskning i saltvandsopløsning en sammenlignende afbildning af de to vævspræparater blev udført. Resultaterne af dette forsøg er vist i figur 2.

Figuren viser lymfeknude prøve skåret i halve på langs og afbildes ved hjælp af mini gammakamera efter 1 time og 2 timers inkubering med 2 uCi

99mTc-mærket mAb til galectin-3 (0,1 ug protein) i saltvandsopløsning, i nærvær (panel B) eller ej (panel A) af et overskud (100 ug) af umærket galectin-3-specifikke mAb. Panel A viser tumor detektion af radiotracer efter 1 time og 2 timers inkubation. Panel B viser en konsekvent lavere optagelse af radiotracer i nærværelse af et overskud af umærket anti-gal3- mAb, som følge af den specifikke forskydning virkning.

Mini-gamma-kamera hurtigt afsløres skjoldbruskkirtlen kræftmetastase (panel a), hvorimod en sparsom tumoroptagelse af radiotracer var synlig i kontrolområdet, som følge af fortrængning virkning af kolde mAb i overskud (panel B).

Discussion

Helt disse resultater antyder muligheden for at detektere kræft i skjoldbruskkirtlen og andre galectin-3 udtrykkende tumorer

in vivo

ved anvendelse af en galectin-3 specifikke radioaktivitet immunoscintigrafi. Anvendelsen af ​​galectin-3 radiotracer til påvisning af cancer i skjoldbruskkirtlen

in vivo

understøttes af en fast molekylær rationale [5], [7] – [10]. Desuden er vi for nylig vist, at galectin-3 immunotargeting repræsenterer et nyttigt diagnostisk værktøj til at identificere præoperativt maligne thyreoidea proliferationer på immuno-cytologiske baser, selv om nogle skjoldbruskkirtlen karcinomer (ca. 10-15% afhængig af undersøgelserne) ikke udtrykker galectin-3 [10] – [14], [17]. Den galectin-3 baseret radio-immunoscintigrafi foreslået her, giver biologisk information om skjoldbruskkirtlen knuder og repræsenterer en nyttig vejledning for at identificere de skjoldbruskkirtlen proliferationer, der bør cytologisk evalueres og /eller omgående udtaget korrekt.

Ved at kombinere galectin-3 billedbehandling med skjoldbruskkirtlen FNA-cytologi, i virkeligheden, kan tillade at skelne præoperativt godartet fra maligne thyreoidea proliferationer med høj effektivitet. Som en konsekvens mange unødvendige thyroidectomies kunne undgås, og den kliniske anvendelse af konventionel skjoldbruskkirtlen scintigrafi med radio iodid, som kun giver funktionel information om specifikke forhold vedrørende skjoldbruskkirtlen, kan begrænses til flere udvalgte kliniske spørgsmål. Yderligere undersøgelser, der anvender humaniserede galectin-3 specifikke mAb’er konjugeret til forskellige radionuklider vil være nødvendigt at bekræfte og validere disse resultater. Hvis den foreslåede diagnostiske tilgang vil lykkes en målrettet radio-ablation af galectin-3 udtrykker tumorer kan også undersøges ved hjælp galectin-3 specifikke mAbs konjugeret til forskellige radio-forbindelser (dvs.

186Re,

177Lu eller

90Y,

64Cu,

67Cu). En galectin-3 ‘stråling målrettet terapi’ leverer strålingsdosis specifikt til galectin-3 positive tumor med begrænset eksponering af normalt væv. Penetration af beta stråler i levende væv er af flere millimeter og kan også opnås den terapeutiske virkning i kræftceller, der ikke tager direkte det radiofarmaceutiske (cross-brand effekt). Denne fremgangsmåde kunne være nyttigt for både påvisning og behandling af mikro papillære thyreoidea carcinomer (læsioner mindre end 1 cm, almindeligvis formuleret ‘

okkulte PTC

‘), som i øjeblikket ikke kan påvises præoperativt.

Desuden muligheden for at behandle primære og metastatiske thyroidlidelser der er galectin-3 positive, men ikke-iod ivrig og af denne grund er de ikke reagerer på konventionel radio-metabolisk terapi med

131Iodine, er et vigtigt mål i onkologi, som vil være yderligere undersøgt.

Foreløbige data fra

in vivo

billeddannelse af galectin-3 positive melanomer, lymfomer og bryst karcinomer er også opnået åbner interessante muligheder for fremtiden at bruge radio-mærkede mAb’er at galectin- 3 for

in vivo

billeddannelse og behandling af forskellige typer af humane maligniteter [27] – [31]

Støtte oplysninger

Figur S1..

Stabilitet og mærkning effektivitet galectin-3 radiotracer. Stabiliteten af ​​radiotracer blev vurderet ved at inkubere en prøve af radioaktivt mærket mAb i saltvand og serum i 24 timer ved 37 ° C. Procentdelen af ​​technetium bundet til mAb blev vurderet ved Instant Thin Layer schromatografi Silica Gel baserede (ITLC-SG) strimler på forskellige tidspunkter. Grafen viser retention af technetium i området mellem 100% og 85% i de første seks timer (ca. 360 minutter) med et mindre fald fra 6 til 24 timer (øverste felt). Aktiviteten for radioaktiv mærkning mAb anti galectin-3 er blevet vurderet i en titrering eksperiment. Den bedste mAb /Tc-forholdet er beregnet ved at variere aktiviteten af ​​99mTc tilsat til en stabil volumen reduceret antistof. Effektiviteten mærkning (LE) blev evalueret ved ITLC-SG. Den optimale mAb /Tc-forholdet fundet var 1.200.000 /1, svarende til 30-40 mCi aktivitet og en mærkning effektivitet på op til 95%. En aktivitet der overstiger denne værdi ikke øge LE (nederste panel B)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0003768.s001

(8,52 MB DOC)

Figur S2.

tumorbilleddannelse in vivo ved hjælp af 99mTc-mærket mAb til galectin-3 og en høj opløsning bærbare mini gammakamera. A) med høj opløsning bærbare mini gammakamera anvendt i denne undersøgelse. B) Billede fanget af høj opløsning gammakamera i en mus bærer galectin-3 positive thyreoideakarcinom xenograft ARO, efter 6 timer fra i.v. injektion af 100 uCi 99mTc-mærket mAb til galectin-3. Tumoren blev bekræftet på histologi var 1,2 cm i diameter og viste et stort centralt nekrotisk areal svarende til lakune at mislykkedes at fastsætte radiotracer (pil)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0003768.s002

(10,39 MB DOC)

tak

Vi takker Marco Paolo Martegani til teknisk bistand i manuskriptet forberedelse.