PLoS ONE: Proteomics-Based Identifikation og analyse af proteiner associeret med Helicobacter pylori i Gastric Cancer

Abstrakt

Helicobacter pylori

(

H

.

pylori

) er en spiralformet Gram-negativ bakterie, der forårsager den mest almindelige kroniske infektion i den menneskelige mave. Ca. 1% -3% af inficerede individer udvikler mavekræft. Men de mekanismer, hvormed

H

.

pylori

inducerer mavekræft er ikke helt forstået. De foreliggende data viser en stærk forbindelse mellem virulens faktor

H

.

pylori

, cytotoksin-associeret gen A (CagA), og gastrisk cancer. For yderligere at karakterisere

H

.

pylori

virulens, etablerede vi tre cellelinier ved at inficere de gastriske kræftceller SGC-7901 og AGS med

CagA

+

H

.

pylori

og transfektion af SGC-7901 med en vektor, der bærer den fulde længde

CagA

gen. Vi har registreret 135 forskelligt udtrykte proteiner fra de tre cellelinjer under anvendelse proteom teknologi, og 10 differentielle proteiner er fælles for de tre cellelinier blev udvalgt og identificeret ved LC-MS /MS samt verificeret ved Western blot: p-actin, L-lactat (LDH), dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD), præ-mRNA-behandling faktor 19 homolog (PRPF19), ATP syntase, calmodulin (CAM), P64 CLCP, Ran-specifikke GTPase-aktiverende protein (RanGAP), P43 og calreticulin. Påvisning af ekspressionen af ​​disse proteiner og gener, der koder disse proteiner i humane gastriske cancer væv ved realtids-PCR (RT-qPCR) og western blot afslørede, at ekspressionen af ​​

β-actin-

,

LDH

,

DLD

,

PRPF19

og

CAM-gener blev opreguleret og

RanGAP

blev nedreguleret i mavekræft væv og /eller metastatisk lymfeknuder i forhold til peri-kræft væv. Høj genekspression blev observeret for

H

.

pylori

infektion i mavekræft væv. Desuden

LDH

,

DLD

og

CAM-gener blev demethyleret ved promotoren -2325, -1885 og -276 lokaliteter, henholdsvis og

RanGAP

genet blev meget methyleret ved promotor -570 og -170 steder i

H

.

pylori

inficerede og

CagA

-overexpressing celler. Disse resultater giver ny indsigt i de molekylære patogenese og behandling mål for mavekræft med

H

.

pylori

infektion

Henvisning:. Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, Chen X, Xu W, et al. (2016) Proteomics-Based Identifikation og analyse af proteiner associeret med

Helicobacter pylori

i Gastric Cancer. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10,1371 /journal.pone.0146521

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: September 15, 2015; Accepteret: December 19, 2015; Udgivet: 8. januar 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. arbejdet blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326), Guizhou provinsen fundament (QianJiaoHe [2014] 06) og Key Projekt for Videnskab og Teknologi i Guizhou provinsen (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). I den oprindelige version blev arbejdet støttet af National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326) og Key Projekt for Videnskab og Teknologi i Guizhou-provinsen (QianKeHe SY (2011) 3067)

Konkurrerende interesser:. Det forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Helicobacter pylori

(

H

.

pylori

) får mest almindelige kroniske mave infektion hos mennesker over hele verden. Omkring halvdelen af ​​verdens befolkning er inficeret med

H

.

pylori

, og størstedelen af ​​koloniserede individer udvikler asymptomatisk gastritis. Blandt inficerede individer, ca. 10% -20% af individer udvikler peptiske mavesår og 1% -3% udvikler mavekræft [1,2]. I 1994

H

.

pylori

blev klassificeret som en type I kræftfremkaldende stof for mavekræft af Verdenssundhedsorganisationens Internationale agentur for kræftforskning.

mavekræft er en af ​​de mest almindelige typer af kræft, og mere end 70% af nye tilfælde og dødsfald sker i udviklingslande [3]. Selv om den globale forekomst har været faldende i flere årtier, mavekræft forbliver udbredt i de fleste udviklingslande, herunder Japan, Korea og Kina [4-6]. I 2012 den kinesiske Cancerregisteret årsberetning anførte, at mavekræft sygelighed og dødelighed er anden og tredje blandt alle maligne tumorer, hhv.

De fleste af

H

.

pylori

stammer bærer

KAG

patogenicitet ø (

KAG

PAI), som indeholder 27 til 31 gener, der koder en bakteriel type 4 sekretion systemet (T4SS) [7] . Cytotoksinet-associeret gen Et gen (

CagA

), som er placeret i 3′-enden af ​​

CAG

PAI, koder den eneste kendte bakterielle onkoprotein, CagA, som translokeres i værtsceller ved T4SS efter bakteriel fastgørelse til maven. Når inde værten celler, CagA er tyrosin phosphoryleres med medlemmer af Abl og Src kinase familier og interagerer med mange intracellulære effektorer, der fører til aktivering af downstream signalmolekyler [8]. I kliniske undersøgelser,

CagA

-positive stammer er blevet konsekvent forbundet med mere alvorlige gastrisk betændelse og sår, og en lille brøkdel af individer udvikler mavekræft [9]. Imidlertid har de mekanismer, der ligger til grund for sammenslutningen af ​​CagA med kræft ikke blevet belyst.

Proteomics er dukket op som en lovende teknologisk platform for rationel identifikation af biomarkører og nye terapeutiske mål for sygdomme og bestemmelse af de underliggende mekanismer for carcinogenese [10]. Men de fleste af de vigtige proteiner påvises ved proteomics in vitro er ikke blevet bekræftet in vivo i kliniske prøver.

DNA-methylering og demethylering spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​cancere ved at blokere bindingen af ​​transkriptionsfaktorer til DNA og er forekommer næsten udelukkende i genpromotor CpG-øer [11-13]. Blandt organer, maven udviser den højeste frekvens af unormal CpG ø methylering, muligvis

H

.

pylori

medieret [14-16]. Selvom undersøgelser af DNA methylering er stigende, de gen methylering induceret af

H

.

pylori

er endnu ikke klart.

I dette arbejde, vi havde til formål at identificere specifikke proteiner relateret til

H

.

pylori

infektion ved hjælp af sammenlignende proteomics og karakterisere genekspression og CpG ø methylering af disse proteiner i mavekræft væv og celler.

Materialer og metoder

humane væv

Humane væv blev opnået fra kirurgi prøver fra 30 mavecancerpatienter og matches tilstødende kræft væv og metastatiske lymfeknuder på Guiyang Medical Hospital, Guiyang Kina, mellem januar 2009 og juni 2010. De diagnoser blev bekræftet af to patologer. Blandt patienterne, var 23 mænd, og 7 var kvinder. Patienterne var i alderen fra 38 til 77 år. Tyve-to patienter havde tarm-typen adenocarcinom, og 8 havde diffus-typen adenocarcinom. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité i Guiyang Medical Hospital, og alle emner, der er fastsat skriftligt informeret samtykke.

Cell kultur

Den menneskelige gastrisk karcinom cellelinje AGS (ATCC CRL-1739TM) og SGC-7901 celler blev købt direkte fra American Type Culture Collection (ATCC) og Cell Bank of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), henholdsvis og passeret i mindre end 3 måneder i vores laboratorium efter modtagelsen. Celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2.

H

.

pylori

kultur

H

.

pylori

stammen NCTC11637 (ATCC 43504, en gave fra den kinesiske center for

Helicobacter pylori

stammen Ledelse og Preservation, Beijing, Kina), som er

CagA

positiv, blev dyrket i selektivt medium på en Columbia-agarplade indeholdende 10% føtalt kalveserum og

H

.

pylori

Selective Supplement (Oxoid Ltd., England) ved 37 ° C under mikroaerobe betingelser.

Cell infektion med

H

.

pylori

AGS og SGC-7901 celler (5 x 10

5) blev udsået i 6-brønds plader i 24 timer og inficeret med

H

.

pylori

i 6 timer og 12 timer ved en infektionsmultipliciteter (MOI) på 1: 100, 1: 500 og 1: 1000, hhv. Celler blev inficeret i 12 timer ved en MOI på 1: 1000 med

H

.

pylori

kogt i 15 min som kontroller.

Konstruktion af ekspressionsvektoren pcDNA3.1 /

CagA

DNA blev ekstraheret fra

H

.

pylori

, og fuldlængde

CagA

sekvens blev syntetiseret ved PCR og klonet i pMD18-T-plasmider til konstruktion pMD18-T /

CagA

.

CagA

genet blev identificeret ved sekventering (GQ161098). pMD18-T /

CagA

blev fordøjet med restriktionsenzymer

Pst

I og

Bam

HI, og

CagA

blev ligeret i pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, USA) til at konstruere den eukaryote ekspressionsvektor pcDNA3.1 /

CagA

. Sekvenserne af primerne er angivet i tabel 1.

Cell transfektion med pcDNA3.1 /

CagA

SGC-7901 celler blev inkuberet i 12 timer i 6-brønds plader for at opnå 80% konfluerende celler. Cellerne blev derefter transficeret i overensstemmelse med producentens anvisninger. Efter 48 timer blev cellerne opdelt 1:10 til nye plader med 6 brønde og inkuberet i yderligere 24 timer, og derefter holdes i selektiv zeocin-indeholdende (250 ug /ml) standard medium i 2 uger indtil klon formation. Celler transficeret med tom vektor pcDNA3.1 /Zeo (-) blev anvendt som kontroller

proteinekstraktion og western blot

Proteinekstrakter blev fremstillet ved resuspendering cellepellets i en RIPA buffer eller homogenisering 200. mg væv i en RIPA-buffer. I alt 30-50 ug protein ekstrakt blev underkastet SDS-PAGE-gelelektroforese, overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) -membran (Millipore, Billerica, MA, USA) og blottet natten over med monoklonalt muse-anti-CagA-antistof (1: 800, sc-28368), monoklonalt muse-anti-phosphotyrosin-antistof (PY99, 1: 300, sc-7020), kanin-polyklonalt anti-beta actin antistof (1: 500, ab189073), kanin polyklonalt anti-LDH-antistof (1: 350 , ab125683), monoklonalt muse-anti-DLD (1: 800, sc-376.890), kanin polyklonalt anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), monoklonalt muse-anti-ATP syntase antistof (1: 300, ab54880), kanin polyklonalt anti -calmodulin anbody (1: 250, ab208911), kanin polyklonalt anti-RanGAP antistof (1: 200, ab92360), kanin polyklonalt anti-p64CLCP antistof (1: 300, ab28722), kanin polyklonalt anti-calreticulin antistof (1: 350, AB4) og muse monoklonale anti-glyceraldehyd-3-phosphat -dehydrogenase antistof (GAPDH, 1: 8000) fra Santa Cruz (CA, USA), Abcam (Cambridge, UK) og CangChen (Shanghai, Kina) i henholdsvis 5% BSA i Tris-bufret saltvand og 0,01% Tween-20. Peroxidasekonjugerede sekundære antistoffer (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, Californien, USA) blev anvendt og udviklet med kemoluminescens reagens ECL Plus hjælp Hyperfilm (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Kvantificering af western blots blev udført ved hjælp Mængde One-software. Hvert eksperiment blev udført 3 gange, og et repræsentativt resultat er vist.

Protein ekstraktion og todimensional gelelektroforese

Cellepellets blev opløst i cellelyse-buffer natten over ved 4 ° C, og protein blev udfældet med tre volumener iskold acetone ved inkubering ved 4 ° C i 2 timer. Prøverne blev derefter centrifugeret ved 20.000 rpm i 30 min, og pelletene blev resuspenderet i cellelyse-buffer og opbevaret ved 4 ° C natten over.

I alt 800 ug protein blev justeret til et volumen på 250 pi med rehydrering opløsning og isoelektrisk fokusering (IEF) blev udført under anvendelse af en Ettan IPGphor II isoelektrisk fokusering (Amersham Biosciences) ifølge producentens instruktioner. Protokollen for IEF var 300 V for1 h, 500 V i 2,5 timer, 1000 V i 2 timer; 8.000 V i 8 timer, 60 Kvh (i alt).

Efter at have afsluttet IEF blev IPG-strimler (Amersham Biosciences) ækvilibreret i ækvilibreringsbuffer i 15 minutter og anbringes på en 12% SDS-PAGE-gel for to- dimensionel elektroforese ved 30 mA /gel. Den resulterende SDS-PAGE-gel blev fikseret i 20% TCA i 30 minutter og derefter farvet med kolloidt Coomassie G-250 [5].

protein pletter på gelen blev scannet og analyseret automatisk. Differentielt udtrykte protein pletter blev bekræftet med Imaging Master 2D 5,0 analytisk software (Amersham Biosciences). T-test blev udført for kvantitativ analyse af 2D-geler. Differentiel ekspression af et specifikt protein blev defineret som en ≥2-gange ændring i plet optisk tæthed mellem de to matchede sæt i dubletter. De differentielle pletter blev derpå udskåret fra SDS-PAGE-geler til yderligere identifikation ved LC-MS /MS.

RNA-ekstraktion og kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra 50 mg væv og behandlet med DNase I (RNase-frit). Generne blev amplificeret med SYBR Green (Applied Biosystems, Australien). Hypoxanthin-guanin phosphoribosyltransferase (

HPRT

) blev anvendt som en normalisering kontrol, og relative mRNA-niveauer blev beregnet ved en sammenlignende C

t metode under anvendelse af trin-on software (Applied Biosystems, Australien) [8]. Hver prøve blev analyseret tredobbelt, og resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SD. De anvendte primere er anført i tabel 1.

DNA ekstraktion og metyleringsanalyse af CpG-øer

DNA blev isoleret fra celler og modificeret med natriumbisulfit ved anvendelse af en EZ DNA-methylering-Gold Kit

™ (Zymo Research, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Promotorsekvenser CpG-øer blev forudsagt under anvendelse af Methyl Primer Express software og amplificeret fra bisulfit modificerede DNA ved PCR under anvendelse af følgende procedurer: denaturering ved 96 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 94 ° C i 40 sek, annealing ved 60 ° C i 40 sek, og forlængelse ved 72 ° C i 40 sek, med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. De amplificerede PCR-produkter blev klonet ind pMD19-T vektorer og sekventeret. Desuden DNA isoleret fra tumorvæv anvendtes til påvisning

H

.

pylori

16S

rRNA

gen og

CagA

gen. Primersekvenserne er anført i tabel 2.

Statistisk analyse

Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD. Statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 15.0 software. Envejs variansanalyse (ANOVA) og t-test blev anvendt til analyse af dataene.

P

. 0,05 (tosidet) blev betragtet som signifikant

Resultater

Indførelse af CagA i gastriske kræftceller

Da CagA af

H

.

pylori

er en kritisk virulens faktor i udviklingen og progressionen af ​​mavekræft, blev CagA påvist i gastrisk cancer cellelinier ved RT-PCR og western blot efter infektion af SGC-7901 og AGS celler med

H

.

pylori

transfektion af SGC-7901 celler med

CagA

-vector. Den CagA-proteinet begyndte at dukke i et forhold på celler for bakterier fra 1: 500 i dyrkede celler ved 6 timer, og indholdet var højest i et forhold på 1: 1000 ved 6 timer (fig 1A og 1B). Imidlertid blev phosphoryleret CagA observeret i celler i et forhold på 1: 500 efter dyrkning i 12 timer, og det højeste indhold blev observeret i celler i et forhold på 1: 1000 efter 6 timer af kultur. CagA mRNA og protein blev også observeret i stabilt

CagA

-overexpressing SGC-7901-celler (Fig 1C og 1D). Disse data antyder, at CagA held blev indført i de tre cellelinier og phosphoryleret.

(A og B) Western blot-analyse af CagA og phosphoryleret CagA i

H

.

pylori

inficerede SGC-7901 (A) og AGS (B) celler. Cellerne inficeret med den angivne forhold mellem celler til

H

.

pylori

i den angivne tid blev opsamlet og lyseret, og proteinerne blev separeret ved SDS-PAGE. Celler inficeret med

H

.

pylori

kogt i 15 minutter ved en MOI på 1: 1000 blev anvendt som kontrol. (C og D) Påvisning af CagA mRNA og protein i

CagA

-overexpressing SGC-7901 celler ved RT-PCR (C) og western blot (D). GAPDH tjente som lastning kontrol. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Hp

,

H

.

pylori

; P-CagA, phosphoryleret CagA; GAPDH, glyceraldehyd-3-phosphat- dehydrogenase.

Identifikation af differentierede proteiner i gastriske kræftceller

Efter celler blev inficeret med

H

.

pylori

i 6 timer ved en MOI på 1: 1000 eller transficeret med

CagA

-vector, en proteomik teknik blev brugt til at skabe seks todimensional elektroforese (2-dE) kort fra tre cellelinier og deres respektive kontroller (fig 2), 135 differentielle pletter blev detekteret, hvoraf 73 blev opreguleret og 62 blev nedreguleret. Ti forskellen blev fælles for alle tre cellelinier blev identificeret ved LC MS /MS og verificeret af western blot, herunder 6 opreguleret proteiner: p-actin, LDH, DLD, PRPF19 ATP syntase og calmodulin (CAM), og 4 down-regulerede proteiner såsom RanGAP, P64 CLCP, P43 og calreticulin (tabel 3 og figur 3A).

SGC-7901 og AGS celler inficeret med

H

.

pylori

i 6 timer ved en MOI på 1: 1000 (. Celle til

H

pylori

) og SGC-7901 celler transficeret med pcDNA3.1 /

CagA

i 48 timer blev opsamlet og lyseret, og proteinkoncentrationer blev bestemt ved anvendelse Bradford kolorimetrisk. I alt 800 ug protein blev påført for todimensional elektroforese. Celler inficeret med kogt

H

.

pylori

eller transfekteret med tom vektor tjente som kontrol for de inficerede eller transfekterede celler. (A) SGC-7901 celler inficeret med

H

.

pylori

. (B) AGS celler inficeret med

H

.

pylori

. (C) SGC-7901 celler transficeret med

CagA

-vector. (D) Forstørret billede af 10 differential pletter. B4, B11, C6, C7, C8 og C9 pletter var opreguleret, mens D12, D16, E2 og E11 pletter blev nedreguleret. Disse pletter er identificeret i tabel 3.

(A) Western blot analyse af de angivne proteiner i kontrol celler (1),

H

.

pylori

inficerede SGC-7901 celler (2) og

CagA

-overexpressed SGC-7901 celler (3). GAPDH tjente som lastning kontrol. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse af de angivne gener i 30 gastriske cancer væv. Værdier er repræsenteret som gennemsnittet Ct gange sammenlignet med peri-cancervæv, hvor peri-kræft væv blev sat til 1. (C) Western blot-analyse af de angivne proteiner i 30 gastriske cancer væv. 200 mg væv blev homogeniseret og totale proteiner blev opsamlet. I alt 50 ug protein ekstrakter blev underkastet SDS-PAGE-gelelektroforese. GAPDH tjente som lastning kontrol. (D) Påvisning af

H

.

pylori

16S

rRNA

gen og

CagA

gen i gastrisk cancer væv ved PCR (Øvre). M betegner DNA molekylvægtmarkør. Bane 1 er den positive kontrol. Bane 2 er den negative kontrol. Bane 3, 4 og 6 er positive prøver. Bane 5 er negative prøver. Kvantitativ RT-PCR-analyse af de angivne gener i mavekræft væv med og uden

H

.

pylori

infektion (Nedre). Værdier er præsenteret som den gennemsnitlige Ct gange sammenlignet med gruppen uden

H

.

pylori

infektion, der var sat til 1. Figuren viser gennemsnittet af 30 prøver. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser. LDH, L-lactat dehydrogenase. DLD, Dihydrolipoamide dehydrogenase. PRPF19, præ-mRNA-processering faktor 19 homolog. RanGAP, Ran-specifikke GTPase-aktiverende protein. CAM, calmodulin. P64 CLCP, nuklear chloridionkanalen protein. *,

P

0,05 sammenlignet med peri-kræft væv (B og C) og væv uden

H

.

pylori

infektion (D).

H

.

pylori

infektion fremmer ekspressionen af ​​differentierede proteiner i mavekræft væv

fordi

H

.

pylori

selektivt koloniserer den humane mave at aktivere et sæt af patologiske processer, blev genekspressionen af ​​10 differential proteiner i 30 humane gastriske cancer prøver bedømt ved kvantitativ RT-PCR. Af de 10 gener, udtryk for

β-actin

,

LDH

,

DLD

,

PRP19

og

CAM-i gastrisk kræft og /eller metastatisk lymfeknuder var opreguleret i forhold til peri-ondartede væv, mens ekspressionen af ​​

RanGAP

blev nedreguleret. Similarily blev de 6-proteiner også unormalt udtrykt i de samme væv (Fig 3B og 3C). Ingen signifikante forskelle i angivelsen af ​​de andre gener blev observeret.

H

.

pylori

kolonisering i mavekræft væv blev målt ved at registrere 16S

rRNA

gen og

CagA

gen af ​​

H

.

pylori

ved PCR.

H

.

pylori

var til stede i 20 af de 30 prøver (positive sats 67%), og alle

H

.

pylori

stammer er

CagA

positiv. De mRNA niveauer af

β-actin

,

LDH

,

DLD

,

PRP19 og CAM-var højere i

H

.

pylori

-positive væv end i de negative prøver (figur 3D).

H

.

pylori

inducerer afvigende DNA methylering i gastriske kræftceller

I tre cellelinjer, PCR-produkter af CpG øer af ovennævnte gener lykkedes erhvervet efter bisulfitbehandling og sekventeret. I disse gener,

LDH

,

DLD

og

CAM-gener blev demethyleret ved promotoren -2325, -1885 og -276 lokaliteter, henholdsvis og

RanGAP

genet blev meget methyleret ved promotor -570 og -170 sites (fig 4).

(A) Elektroforetisk analyse af promotor CpG øer de angivne gener ved bisulfit modifikation-PCR. (B) methylering af CpG-øer i de angivne genpromotorer.

LDH

, L-lactat dehydrogenase.

DLD

, Dihydrolipoamide dehydrogenase.

RanGAP

, Ran-specifikke GTPase-aktiverende protein.

CAM-, Calmodulin. M, molekylvægtmarkør. 1, ubehandlede SGC-7901 celler; 2,

H

.

pylori

inficerede SGC-7901 celler; 3,

CagA

-overexpressing SGC-7901 celler. Pilene viser unormale methylering sites.

Diskussion

Akkumulerende evidens for, at

H

.

pylori

infektion er en vigtig faktor for

H

.

pylori

associeret gastrisk sygdomme, og at CagA er en fremmende faktor for mavekræft [17,18]. Vi bygget tre eksperimentelle cellelinier, herunder to mavekræft cellelinjer inficeret med

H

.

pylori

(

CagA

+) og en gastrisk cancer cellelinje overekspression

CagA

, og fastslået, at CagA begyndte at dukke op i cellerne 6 timer efter infektion og for op til 12 timer. Efterfølgende phosphoryleret CagA begyndte at dukke, i overensstemmelse med injektion og efterfølgende phosphorylering af CagA i gastriske epitelceller ved T4SS af

H

.

pylori

efter infektion af den humane gastriske mucosa. Phosphoryleret CagA aktiverer nedstrøms signalveje og spiller en patologisk rolle. Vi har også observeret CagA i celler stabilt transficeret med

CagA

-vector. Disse data bekræfter vellykket opførelse af de tre eksperimentelle cellelinier.

Proteomics er blevet anvendt til at undersøge forholdet mellem

H

.

pylori

infektion og gastriske sygdomme, og mange differentielt udtrykte proteiner er blevet identificeret [19-22]. Men foreningen af ​​disse proteiner med CagA og deres udtryk i humane mavekræft væv fortsat uklare. Vi opnåede i alt 135 differentierede pletter fra de tre cellelinjer, hvoraf 73 blev opreguleret og 62 blev nedreguleret. Ti differentielle pletter var fælles for alle tre cellelinier, herunder 6 opreguleret proteiner (β-actin, LDH, DLD, PRP19, ATP syntase, og CAM) og 4 nedreguleres proteiner (P64 CLCP, RanGAP, P43 og calreticulin) , og de 10 proteiner ‘udtryk blev verificeret ved western blot i disse cellelinjer. Disse proteiner er involveret i energistofskiftet, skelet omlejring, præ-mRNA-processering, signaltransduktion, og andre proteiner tæt forbundet med udviklingen og progressionen af ​​mange humane cancere [23,24]. Vi kvantitativt opdaget udtryk for de gener, der koder disse 10 proteiner i humane mavekræft væv, som afslørede, at

β-actin

,

LDH

,

DLD

,

PRP19

og

CAM-blev konsekvent højt udtrykt og

RanGAP

var dårligt udtrykt i både kræft væv og /eller metastatisk lymfeknuder i forhold til peri-kræft væv. Den afvigende ekspression af disse proteiner blev også bekræftet ved Western blot i gastrisk cancer og metastatiske lymfeknuder. Dernæst fandt vi, at

CagA

+

H

.

pylori

koloniseret i 20 af 30 mavekræft væv og fremmet eller hæmmet ekspression af disse gener in vivo.

LDH og DLD er tæt korreleret med energistofskiftet. Disorder af energistofskiftet betragtes som en vigtig faktor for udvikling og progression af cancer. I modsætning til normale celler, cancerceller udviser forøget afhængighed af glycolytiske vej med tilstrækkelig ilt, betegnet aerobe glycolyse. En stor mængde af pyrodruesyre, et slutprodukt af vejen, omdannes til mælkesyre ved LDH, fremme glycolytiske vej og energimetabolisme ubalance [25]. Mælkesyre kan også sænke pH af cellen mikromiljø, hvilket således forøger neovaskulær respons på angiogenesefaktorer at fremme tumorcellemetastase [26,27]. I overensstemmelse med vores resultater,

LDH

blev stærkt udtrykt i cancer væv i 61,8% af patienter med mavekræft; patienter med LDH overekspression havde kortere overlevelse sammenlignet med patienter med lavt udtryk [28]. Kim

et al

. [29] bemærkede, at

DLD

udtryk stiger med tumor progression, hvilket giver mere energi til tumorcellevækst. Derfor høj ekspression af LDH og DLD er en afgørende faktor for udviklingen og progressionen af ​​mavekræft, og

H

.

pylori

infektion fremmer ekspressionen af ​​disse to gener i mavekræft væv.

Beta-actin, en nøglekomponent i cytoskelettet, fastholder strukturen, bevægelse og deling af celler under normale forhold.

β-actin

er unormalt udtryk i mange sygdomme [30]. Den PRPF19 protein menes at fungere i præ-mRNA splejsning. Ubiquitinering af PRPF19 kunne føre til DNA-ødelæggelse, og unormal DNA-reparation er en vigtig årsag til tumorigenese [31]. Calmodulin er et calcium-bindende protein, der regulerer mange signalveje og dermed deltager i celleproliferation, mitose og gentranskription. Calmodulin fremmer celleproliferation i leverkarcinomer i kombination med PI3K og overgangen fra G1 til S-fasen i kombination med cyclin E [32]. En inhibitor af calmodulin anholdelser celler i G1-fasen for at inhibere celledeling [33]. I overensstemmelse med disse resultater, vi bestemt, at

H

.

pylori

kan deltage i kræft udvikling af gastrisk væv ved at inducere høj ekspression af disse tre proteiner.

Desuden observerede vi nedregulering af

RanGAP

gen i kræft væv med

H

.

pylori

infektion. RanGAP er et GTPase-aktiverende protein. Efter hydrolyse af GTP til BNP med en GTPase, aktiv RanGTP bliver inaktiv RanGDP, hvilket fører til blokaden af ​​celle signalering at hæmme kræft progression [34]. Ligeledes faldt RanGAP aktivitet induceret af ubiquitinering fremmer cancerudvikling [35].

DNA-methylering kan inducere unormal genekspression.

H

.

pylori

infektion øger methylering niveauer af visse gener og resulterer i carcinogenese af maveslimhinden [36,37]. DNA methylering normalt vises i CpG øer genpromotorer. Vi har detekteret status methylering af CpG øer af disse gener i de konstruerede cellelinier og bestemt, at

LDH

,

DLD

og

CAM-gener blev demethyleret ved promotor -2325, -1885 og -276 lokaliteter, henholdsvis og

RanGAP

gen var stærkt methyleret ved promotor -570 og -170 lokaliteter, i overensstemmelse med den høje udtryk for

LDH

,

DLD

og

CAM-gener og den lave udtryk for

RanGAP

gen i gastrisk kræft væv med

CagA

+

H

.

pylori

infektion.

Som konklusion disse resultater tyder på, at

H

.

pylori

infektion via CagA translokation, kan inducere afvigende methylering af disse gener føre til dysfunktionel genekspression i gastrisk cancer væv og celler. Vores resultater giver en ny forståelse af den molekylære patogenese mavekræft med

H

.

pylori

infektion. Fremtidige undersøgelser vil undersøge virkningerne af disse ændrede methylering mønstre på patogenesen af ​​mavekræft i kliniske prøver.

Tak

Vi takker den kinesiske center for

Helicobacter pylori

stammen Management og Preservation for at give

H

.

pylori

NCTC11637 og Dr. Yang Wenxiu og Wu Jiahong til teknisk bistand.