PLoS ONE: kliniske betydning af MLH1 Methylering og CpG Island Methylator Fænotype som prognostiske markører i patienter med gastrisk Cancer

Abstrakt

Baggrund

For at forbedre resultatet af patienter, der lider af mavekræft, en bedre forståelse af de underliggende genetiske og epigenetiske begivenheder i denne malignitet er påkrævet. Selvom CpG ø methylator fænotype (CIMP) og mikrosatellit instabilitet (MSI) har vist sig at spille afgørende roller i mavekræft patogenese, den kliniske betydning af disse begivenheder på overlevelse udfald hos patienter med mavekræft er fortsat ukendt.

Metoder

Denne undersøgelse omfattede en patient kohorte med patologisk bekræftet mavekræft, som havde kirurgiske resektioner. En kohorte af 68 gastrisk kræft blev analyseret. CIMP og MSI statusser blev bestemt ved at analysere promotor CpG ø methylering status for 28 gener /loci, og genomisk ustabilitet på 10 mikrosatellitmarkører hhv. En Cox ‘proportionale farer model blev udført for multivariat analyse, herunder alder, scene, tumor differentiering,

KRAS

mutation status, og kombineret CIMP /

MLH1

methylering status i forhold til samlet overlevelse (OS).

Resultater

Ved multivariat analyse blev længere OS signifikant korreleret med lavere patologisk stadium (

P

= 0,0088), bedre tumor differentiering (

P

= 0,0267) og CIMP-høj og

MLH1 3 ‘

methylerede status (

P

= 0,0312). Stratificering af CIMP status med hensyn til

MLH1

methylering status yderligere aktiveret forudsigelse af mavekræft prognose.

Konklusioner

CIMP og /eller

MLH1

status methylering kan have et potentiale for at være prognostiske biomarkører for patienter med mavekræft

Henvisning:. Shigeyasu K, Nagasaka T, Mori Y, Yokomichi N, Kawai T, Fuji T, et al. (2015) kliniske betydning af MLH1 Methylering og CpG Island Methylator Fænotype som prognostiske markører i patienter med gastrisk kræft. PLoS ONE 10 (6): e0130409. doi: 10,1371 /journal.pone.0130409

Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, UNITED STATES

Modtaget: Februar 18, 2015; Accepteret: 20 maj 2015; Udgivet: 29 juni 2015

Copyright: © 2015 Shigeyasu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af KAKENHI tilskud 19390351 og 20590572 til TN, og ved tilskud R01 CA72851 og 181.572 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, og midler fra Baylor Research Institute til AG

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gastrisk kræft er den anden hyppigste årsag til kræft. -relaterede dødsfald, med omkring 700.000 bekræftede dødelighed årligt på verdensplan, selvom forekomsten gradvist er faldet [1-3]. Mavekræft er generelt diagnosticeret på et fremskredent stadium, hvilket er den primære årsag til dens dårlig prognose [4]. At forbedre resultatet af gastrisk cancer, er identifikation af genetiske eller epigenetiske begivenheder i progressionen af ​​mavekræft påkrævet. Den vigtigste epigenetisk begivenhed i progressionen af ​​cancer er methylering af promotorelementer CpG regioner af centrale tumorsuppressorgener. CpG-øer er næsten 1-kb lange sekvenser af DNA med høj guanin-cytosin indhold i promotorregioner af [5] generne. I modsætning til normale celler, er CpG-øer i tumorsuppressorgener i cancerceller ofte hypermethyleret, hvilket fører til et CpG island methylator fænotype (CIMP) [6,7]. Epigenetisk inaktivering af tumor-relaterede gener som følge af CpG ø metylering er for nylig blevet rapporteret i gastrisk cancer. Afvigende CpG ø methylering af 100 vækst-regulatoriske gener i gastrisk kræft har hidtil været rapporteret [8-24], men den kliniske betydning af CIMP i mavekræft forbliver uudforsket og dårligt forstået

I modsætning. , mismatch repair (MMR) mangel i gastrisk cancer er også en vigtig genetisk hændelse. Genomisk instabilitet i antallet af mikrosatellitmarkørerne gentagelser (eller mikrosatellitter) betegnes mikrosatellit instabilitet (MSI). MSI er en funktion, forårsaget af et defekt DNA MMR-system. Funktionel inaktivering af MMR-gener, såsom

MLH1

eller

MSH2

ved promotor methylering er ansvarlig for MSI-høj (MSI-H) fænotype i mavekræft. I en tidligere undersøgelse, mavekræft med MSI-H viste en højere frekvens af antral beliggenhed, intestinal subtype, lavere forekomst af lymfeknudemetastase og forbedret overlevelse sammenlignet med mikrosatellit stabil (MSS) eller MSI-L gastriske cancere [17,25 -30]. Men den kliniske betydning af MMR-mangel i mavekræft er fortsat ukendt.

På baggrund af dette hul i viden, i denne undersøgelse, vi undersøgt betydningen af ​​CIMP og MMR-mangel i mavekræft og bestemt deres bidrag som prognostiske markører hos patienter med mavekræft.

Materialer og metoder

Vævsprøver

Denne undersøgelse omfattede en kohorte af patienter med patologisk bekræftet gastrisk cancer, som havde gennemgået kirurgisk resektion ved Okayama University Hospital (Okayama, Japan) 1998-2004. blev analyseret i alt 68 mavekræft væv og deres matchede normale gastriske slimhinde. Alle normale maveslimhinden væv blev opnået fra steder grænsende til, men mindst 5 cm fra den oprindelige tumor. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Okayama Universitetshospital. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke til brug af deres data for fremtidige analyser. Alle gastriske cancere og normal gastrisk mucosa var frisk-frosset vævsprøver, hvorfra DNA blev ekstraheret under anvendelse af et QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN).

MSI analyse

MSI-analyse blev udført ved undersøgelse af 2 mononukleotid gentagelser (BAT25 og BAT26), 12 dinukleotid gentagelser (D17S250, D18S35, D18S58, D18S69, D2S123, D4S1559, D4S2381, D4S470, D5S107, D5S346, og D8S87, TP53), og én tetranukleotid gentagelser, MYCL, som tidligere beskrevet [ ,,,0],31]. Tumorer, der viser allele skift i ≥5 af 15 markører blev klassificeret som MSI-H (herefter kaldet “MSI”), og resten blev klassificeret som mikrosatellit stabil (MSS).

Natriumbisulfit modifikation og CIMP analyser

Da hyppig hypermethylering af flere gener er en af ​​de karakteristiske træk ved tumorer med CIMP, vi undersøgte status for 28 promoter CpG ø-relaterede loci methylering (

APC

,

CACNA1G

,

CHFR

,

COX2

,

DAPK

,

DCC

,

HPP1

,

MGMT-Mp region

,

MGMT-Eh omegn,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3 ‘

,

P14

,

p16

,

RASSF1A

,

RASSF2A-regionen1

,

RASSF2A-region2

,

RASSF3

,

RASSF5

,

RASSF6

,

RUNX3

,

SFRP2-regionen1

,

SFRP2- region2

,

UNC5C

,

3OST2

,

FOXL2

), og de tilsvarende primersekvenserne er anført i S1 tabel. Genomisk DNA blev bisulfit modificeret til at konvertere alle ikke-methylerede cytosinrester til uraciler. Kort fortalt 0,5-2,0 pg DNA blev denatureret i NaOH, behandlet med natriumbisulfit, og oprenset ved anvendelse af Wizard DNA Clean-up system (Promega). status methylering af hver CIMP-relateret locus blev evalueret ved kombineret bisulfit restriktionsanalyse (COBRA). Polymerasekædereaktion (PCR) for COBRA blev udført på et bisulfit-modificerede template-DNA i et 25-pi PCR-blanding indeholdende 12,5 pi HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 0,5 mmol /l af hver PCR-primer, og ca. 25 ng bisulfit-modificeret DNA. PCR-produkter blev fordøjet ved tilsætning af restriktionsenzym ved 37 ° C i 12 timer. Det spaltede DNA blev separeret på 3% agarosegeler i 1 × Tris-acetat-EDTA-buffer og farvet med ethidiumbromid. Humant normalt colon-DNA behandlet med SSSI methylase (New England Biolabs) blev anvendt som en positiv kontrol for methylerede alleler, og DNA fra normale lymfocytter blev anvendt som en kontrol for ikke-methylerede alleler. Vand blev anvendt som en negativ PCR-kontrol til overvågning PCR kontaminering. CIMP-high blev defineret som mindst 10 af methylering af disse loci.

KRAS

mutation analyser

Direkte sekventering blev udført for at identificere

KRAS

exon 2 (codon 12/13) mutationer. PCR for

KRAS

genet blev udført i en 25-pi PCR-blanding indeholdende 12,5 pi HotStarTaq Master Mix kit med primere. QIAquick PCR Purification kit blev anvendt til at oprense PCR-produkter, og de blev direkte sekventeret på en ABI 310 DNA sequencer [32].

Statistiske analyser

JMP software (ver 10,0, SAS Institute Inc .) blev anvendt til statistisk analyse. T-test blev anvendt til sammenligning af kontinuerlige variabler, og Fishers eksakte test blev anvendt til at analysere kategoriske variable. Samlet overlevelse (OS) blev målt fra driften dato dødsdagen. statistik De Kaplan-Meier-metoden og log-rank for forskelle mellem de forskellige prognostiske faktorer blev anvendt til at estimere OS distributioner. Cox proportional hazard modeller blev anvendt til beregning af hazard ratio (HR) med tilsvarende 95% konfidensinterval (CI). Univariate eller multivariat logistisk regressionsanalyse blev udført for at bestemme forskellene i HR mellem hver gruppe. Alle indberettede

P

værdier er tosidet, og

P

0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.

Resultater

studiepopulation

I denne undersøgelse undersøgte vi 68 patienter med mavekræft. I promoter CpG’er i

MLH1

gen, spredning af CpG methylering inden sin 3′-regionen blev bestemt til at være en kritisk for MLH1 udtryk [33]. En beskrivelse af patientens kohorte og forskellige klinisk-patologiske funktioner baseret på køn, alder, scene, tumor differentiering, MSI-status,

KRAS

mutation, og

MLH1 3 ‘

methylering er vist i tabel 1. Disse statusser blev sammenlignet mellem CIMP-høje og CIMP-lave grupper. Af disse parametre, MSI status og

MLH1 3 ‘

methylering status viste bemærkelsesværdige forskelle mellem de 2 grupper (tabel 1).

Methylering status

28 CpG loci herunder

APC

,

CACNA1G

,

CHFR

,

COX2

,

DAPK

,

DCC

,

HPP1

,

MGMT-Mp omegn,

MGMT-Eh omegn,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3′

,

P14

,

p16

,

RASSF1A

,

RASSF2A-regionen1

,

RASSF2A-region2

,

RASSF3

,

RASSF5

,

RASSF6

,

RUNX3

,

SFRP2-regionen1

,

SFRP2-region2

,

UNC5C

,

3OST2

FOXL2

blev analyseret for at bestemme CIMP status hver gastrisk cancer. Methylering spektrum af disse loci er vist i flise kort (figur 1a). I disse loci,

CACNA1G

,

CHFR

,

DCC

,

HPP1

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3′

,

p16

,

RASSF2A-regionen1

,

RASSF2A-region2

,

RUNX3

,

SFRP2-region2

,

UNC5C

,

3OST2

, og

FOXL2

var signifikant methylerede i CIMP høje gruppe (tabel 2).

a) Tile kort der viser methylering mønster. Tyve otte loci (

APC

,

CACNA1G

,

CHFR

,

COX2

,

DAPK

,

DCC

,

HPP1

,

MGMT-Mp omegn,

MGMT-Eh omegn,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3′

,

P14

,

p16

,

RASSF1A

,

RASSF2A-regionen1

,

RASSF2A-region2

,

RASSF3

,

RASSF5

,

RASSF6

,

RUNX3

,

SFRP2-regionen1

,

SFRP2-region2

,

UNC5C

,

3OST2

,

FOXL2

) blev analyseret for at bestemme CIMP status. Tredive patienter med ikke mindre end ti methylerede loci blev identificeret som den CIMP høje gruppe. b) Venn diagram, der viser overlapningen af ​​

MLH1

3’methylering og CIMP status. Den overlappende forhold mellem

MLH1 3 ‘

methylering og CIMP status blev analyseret. 10 patienter var i den kombinerede i CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

methyleret (A), 1 patienter var i CIMP-lav /

MLH1 3′

methyleret (B), 20 patienter var i CIMP høj /

MLH1 3 ‘

ikke-methyleret (C), og 37 patienter var i CIMP-lav /

MLH1 3′

ikke-methylerede grupper (D). c) Kaplan-Meier estimat af OS hos patienter med

MLH1

3’methylerede eller ikke-methylerede gastriske cancere. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev frembragt ifølge

MLH1 3′

status for methylering. De 5-årige overlevelsesrater blev analyseret for

MLH1 3 ‘

methylerede og ikke-methylerede grupper. Overlevelsen var signifikant højere i

MLH1 3 ‘

methyleret gruppe end i den ikke-methylerede gruppe (log-rank

P

= 0,0257). d) Kaplan-Meier estimat af OS hos patienter med CIMP-høj eller CIMP-lave gastriske cancere. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev frembragt ifølge CIMP status. Den 5-årige overlevelsesrate blev analyseret for CIMP høje gruppe og CIMP-lav gruppe. Overlevelsesraten var lidt højere i CIMP høje gruppen end i CIMP-lav gruppe, men forskellen var ikke signifikant (log-rank

P

= 0,0688). e) bidrag CIMP og fejlparringsreparationsmangel status til overlevelsesraten. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret i henhold til CIMP og

MLH1

methylering status. Patienterne blev klassificeret på grundlag af kombineret CIMP status og

MLH1

methylering status i CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

methylerede (A), CIMP-lav /

MLH1 3 ‘

methylerede (B), CIMP høj /

MLH1 3′

ikke-methylerede (C), og CIMP-lav /

MLH1 3 ‘

ikke-methylerede grupper (D). Samlet overlevelse var højere i den kombinerede CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

denatureret gruppe, sammenlignet med de andre grupper, hvor forskellene ikke var statistisk signifikant (log-rank

P

= 0,0706) .

Overlevelse resultater hos patienter baseret på

MLH1 3 ‘

methylering og CIMP status i gastrisk kræft

overlappende forhold mellem CIMP og

MLH1 3 ‘

methylering status blev analyseret. 10 patienter var i CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

methylerede, 1 patient var i CIMP-lav /

MLH1 3′

methylerede, 20 patienter var i CIMP høj /

MLH1 3 ‘

ikke-methylerede og 37 patienter var i CIMP-lav /

MLH1 3′

ikke-methylerede grupper (figur 1b). Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret i overensstemmelse med den

MLH1 3 ‘

methylering status. De 5-årige OS satser blev bestemt for

MLH1 3 ‘

methylerede og ikke-methylerede grupper. De 5-årige OS satser var signifikant højere i

MLH1 3 ‘

denatureret gruppe sammenlignet med den ikke-methylerede gruppe. (Log-rank

P

= 0,0257, Fig 1c)

Ligeledes 5-årige OS satser blev analyseret for de CIMP-høje og CIMP-lave grupper, og satsen var lidt højere i CIMP høje gruppen end i CIMP-lave gruppe, men forskellen var ikke signifikant ( log-rank

P

= 0,0688;. figur 1d)

Bidrag af fejlparringsreparationsmangel og CIMP status til overlevelsesraten

De 5-årige overlevelsesrater blev analyseret og sammenlignet blandt disse grupper; CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

methylerede, CIMP-lav /

MLH1 3′

methylerede, CIMP høj /

MLH1 3 ‘

ikke-methylerede og CIMP-lav /

MLH1 3 ‘

ikke-methylerede grupper. Vi bemærkede, at den samlede overlevelsesrate var højere i den kombinerede CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

denatureret gruppe, sammenlignet med de andre grupper, hvor forskellene ikke var statistisk signifikant (log-rank

P

= 0,0706;. figur 1e)

forholdet mellem

MLH1

methylering og MSI

overlappende forhold mellem

MLH1 5′

methylering og

3 ‘

methylering status blev analyseret. 10 patienter blev klassificeret som

MLH1 5′

methylerede /

3 ‘

methylerede, 8 patienter som

MLH1 5′

methylerede /

3′

ikke- methylerede, en patient som

MLH1 5′

ikke-methylerede /

3 ‘

denatureret, og 49 patienter, som

5′

non-methylerede /

3 ‘

ikke-methyleret (figur 2a). I

MLH1 3 ‘

methylerede gruppe, viste mere end 80% af patienterne MSI. I modsætning hertil i

MLH1 3 ‘

non-methylerede gruppe, viste næsten alle tilfælde MSS (figur 2b). Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret i henhold til

MLH1 5′

methylering status. De 5-årige overlevelsesrater blev analyseret for

MLH1 5 ‘

methylerede og ikke-methylerede grupper, og satsen var lidt højere i

MLH1 5′

methyleret gruppe end i den ikke- methylerede gruppe, men forskellene var ikke signifikante (log-rank

P

= 0,1009, fig 2c). Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev frembragt ifølge MSI status. De 5-årige overlevelsesrater blev analyseret for MSI og MSS-grupper, og satsen var lidt højere i MSI-gruppen end i MSS gruppen, men forskellene var ikke signifikante (log-rank

P

= 0,1316; fig 2d).

a) Venn diagram, der viser overlapningen af ​​MLH1 5′-methylering og 3’status for methylering. Den overlappende forhold mellem

MLH1 5 ‘

-og

3′

methylering status blev analyseret. 10 patienter var i

MLH1 5′

methylerede /

3 ‘

methylerede (A), 8 patienter var i

MLH1 5′

methylerede /

3′

non-methylerede (B), 1 patient var i

MLH1 5 ‘

non-methylerede /

3′

methylerede (C), og 49 patienter var i

5′

ikke-methyleret /

3 ‘

ikke-methylerede grupper (D). b) Forholdet mellem

MLH1

methylering og MSI. I

MLH1 3 ‘

denatureret gruppe, 80% tilfælde viste MSI. I modsætning hertil i

MLH1 3 ‘

non-methylerede gruppe, viste næsten alle tilfælde MSS. c) Kaplan-Meier estimat af OS hos patienter med

MLH1

5 ‘methyleret eller ikke-methyleret gastrisk cancer. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret i henhold til

MLH1 5′

methylering status. Den 5-årige overlevelsesrate blev analyseret for

MLH1 5′

gruppe og ikke-methylerede grupper. Overlevelsesraten var lidt højere i

MLH1 5 ‘

methyleret gruppe end i den ikke-methylerede gruppe, men forskellen var ikke signifikant (log-rank

P

= 0,1009). d) Kaplan-Meier estimat af OS hos patienter med MSI eller MSS mavekræft. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev frembragt ifølge MSI status. Den 5-årige overlevelsesrate blev analyseret for MSI-gruppen og MSS gruppe. Overlevelsesraten var lidt højere i MSI-gruppen end i den ikke-methylerede gruppe, men forskellen var ikke signifikant (log-rank

P

= 0,1316).

multivariat analyse for overlevelse resultatet prædiktorer

en Cox proportionel risiko model, herunder alder, scene, differentiering,

KRAS

mutation status, og CIMP /

MLH1 3 ‘

methylering status i forhold til OS blev anvendt til at udføre multivariat analyse (tabel 3). Kun fase (

P

= 0,0088), differentiering (

P

= 0,0267), og CIMP /

MLH1

methylering status (

P

= 0,0312) var statistisk signifikante prædiktorer for OS. Hazard ratio var signifikant lavere i CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

methylerede gruppe.

Diskussion

DNA methylering i cancerceller er blevet et emne for intens undersøgelse. Inaktivering af tumorsuppressorgener af CpG-methylering af promotorregioner accelererer carcinogenese grund af afvigende cellecyklusregulering og proliferation [15]. Nogle kandidat afvigende denatureret gener i mavekræft er blevet rapporteret.

RASSF1A

,

p14ARF

, og

MGMT

[34-38];

CHRNA3

,

DOK1

, og

GNMT

[39];

p16

,

hMLH1

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT12

,

MINT25

, og

MINT31

[40];

APC

,

CDH1

,

MHL1

,

CDKN2A

,

CDKN2B

, og

RUNX3

[17 ];

CDH1

[41];

DKK3

[42];

PTEN

[43];

MGMT

[44];

TFPI2

[22];

CACNA2D3

[45];

PCDH10

[46];

SOX2

[47];

MAL

[48]; og

COX2

[49] blev tidligere rapporteret at være hypermethyleret i mavekræft. Methylering af

p16

promotor- CpG-øer er en markør for malignt potentiale dysplasi i maven [50]. Methylering af

MGMT

er forbundet med fremskreden og dårlig prognose [44]. Afvigende DNA methylering i disse gener kan fremme udviklingen af ​​mavekræft. Men præcise gen mål for hypermethylering for carcinogenese forbliver ukendte [51,52].

Samtidig CpG methylering i flere gener er blevet defineret som CIMP i kolorektal cancer (CRC) og gastrisk kræft [15,40,53- 57], og er blevet vist at korrelere med hypermethylering af tumorsuppressorgener. Men beviserne for CIMP i gastrisk cancer er ikke så overbevisende som det er tilfældet for CRC [58,59]. I gastrisk cancer, har CIMP-high blevet beskrevet i 41% [40] og 31% [54] tumorer. Patienter med CIMP-high mavekræft har betydeligt kortere overlevelse end dem med CIMP-lav mavekræft [54,60]. En anden rapport viste, at CIMP var forbundet med bedre overlevelse i gastrisk kræft [54]. Den seneste meta-analyse har fokuseret på den stærke relation CIMP med H. pylori, EBV, og MSI, men CIMP kunne ikke vise en prognostisk potentiale for mavekræft [61].

I modsætning ustabilitet på mikrosatellitter gentagelser inden for forskellige vækstregulerende gener er defineret som MSI. En standard panel, såsom NCI-panelet, anbefales, herunder mononukleotid (BAT26 og BAT25) og dinukleotid (D2S123, D5S346 og D17S250) gentager [62]. Tre niveauer af MSI kan identificeres: højt niveau MSI (MSI-H), lavt niveau MSI (MSI-L), og MSS. MSI-H fænotype i mavekræft blev rapporteret til at tegne sig for 5% -50% MSI positive neoplasmer [17]. MSI er en funktion, forårsaget af et defekt DNA MMR-system. Funktionel inaktivering af MMR-gener, såsom

MLH1

eller

MSH2

ved mutations inaktivering og promotor methylering er ansvarlig for MSI-H fænotype i mavekræft. Især ligner CRC, methylering af

MLH1

er forbundet med MSI-H fænotype [15,40,63,64] fordi

MLH1

methylering forud for tab af protein-ekspression. Leite M et al. rapporterede, at

MLH1

promotor hypermethylering blev observeret i 78,7% (70/89) af de analyserede MSI sager [65]. Methylering af 3′-regionen af ​​

MLH1

promotor, hvilket er tæt på sin transkriptionelle startsted (TSS), er nødvendig for gendæmpning. 5′-enden af ​​promotoren er også tilbøjelige til methylering, men dette er ikke funktionelt vigtigt medmindre methylering strækker sig til den kritiske 3′-region [66,67]. MSI status er ansvarlig for mutation af gener, der regulerer celle-cyklus og apoptotisk signalering, herunder

TGFβRII

,

IGFIIR

,

TCF4

,

RIZ

,

BAX

,

CASPASE5

,

FAS

,

BCL10

, og

APAF1

[17,25] og gener opretholde genomisk integritet , herunder

MSH6

,

MSH3-

,

MED1

,

RAD50

,

BLM

,

ATR

, og

MRE11

[17,68]. Gastriske cancere med MSI-H viser en højere frekvens af antral beliggenhed, intestinal subtype, lavere forekomst af lymfeknudemetastase og forbedret overlevelse i forhold til dem af mavekræft med MSS eller MSI-L [17,25-30].

Som beskrevet ovenfor CIMP og MMR-mangel status er centrale elementer i mavekræft og kan afspejle overlevelse forskelle i patienter, der lider af denne malignitet. Signifikant sammenhæng mellem CIMP og MSI er blevet rapporteret i GC [61]. Men data vedrørende de synergistiske virkninger af disse parametre er knappe, og er nødvendig multivariat analyse af disse genetiske og epigenetiske parametre. I vores undersøgelse,

CACNA1G

,

CHFR

,

DCC

,

HPP1

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3′

,

p16

,

RASSF2A-regionen1

,

RASSF2A-region2

,

RUNX3

,

SFRP2-region2

,

UNC5C

,

3OST2

, og

FOXL2

var signifikant methylerede i CIMP høje gruppe. Især rapporterede vi promotor methylering af

FOXL2

gastrisk kræft.

FOXL2

er et gen, der koder en forkhead transskriptionsfaktor og er afgørende for ovariefunktion [69].

FOXL2

regulerer cellecyklus ved at inducere G1 anholdelse og beskytter celler fra oxidative skader ved at fremme oxideret DNA-reparation og ved at øge mængden af ​​anti-oxidant agent glutathion [69].

FOXL2

undertrykker proliferation, invasion og fremmer apoptose af livmoderhalskræft celler [70]. Promotor methylering af

FOXL2

kan have en væsentlig rolle i tumorigenese i mavekræft. I modsætning hertil

MLH1 3 ‘

methylering var påkrævet for MMR-mangel og viste MSI.

MLH1 3 ‘

methylering gruppe havde en tendens til en god prognose i Kaplan-Meier overlevelse skøn.

Men CIMP og MMR-mangel er afhængige af hinanden. MSI-associerede opstår sporadiske CRC’er gennem en proces, der involverer CIMP [66,71]; Derfor bør udføres integreret statistisk analyse af CIMP og MMR-mangel. For eksempel i duodenal adenokarcinomer, CIMP /

MLH1

methylering status viste en signifikant prognostisk værdi i både OS og time-to-recidiv (TTR) i multivariat analyse [72]. Patienter med CIMP-høj /

MLH1

-unmethylated tumorer havde den værste OS og TTR [72]. I vores multivariat analyse af patienter med gastrisk cancer, er det kun CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

methyleret gruppe havde en god prognose. Årsagen til god prognose i CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

methylerede gruppe fortsat ukendt. Dette fænomen kan være på grund af synergistisk inaktivering af vitale gener på grund af mutation og promotor-methylering. For yderligere at bekræfte vores resultater, vi udførte en uafhængig validering af vores resultater fra i patientdata indsendt til The Cancer Genome Atlas database (TCGA). [73-75] CIMP-høj /

MLH1

hyper-methylerede gruppe viste hyppigere lymfeknude metastaser (p = 0,0009), fremskreden sygdom etape (p = 0,0078, S1 File), og lidt bedre sygdomsfri overlevelse (S2 File). På den anden side, kan CIMP /MSI-status ikke vise signifikant værdi som prognostisk markør (S2 tabel). Dette resultat viser,

MLH1

har den vigtigste rolle blandt MMR gener i carcinogenese af GC. Yderligere undersøgelser er påkrævet for at belyse forholdet mellem CIMP status og MMR-mangel. Denne tilgang vil føre til en ny strategi for behandling af mavekræft.

Som konklusion, vores data tyder på, at lagdeling af patienter med CIMP baseret på

MLH1

methylering status kan muliggøre forudsigelse af mavekræft prognose. Den CIMP-høj /

MLH1 3 ‘

methylerede gruppe havde god prognose, men andre grupper kan kræve intensiv behandling til forbedringer af overlevelse, som skal valideres i fremtidige studier.

Støtte Information

S1 fil. Forholdet mellem CIMP og

MLH1

methylering i Gastric kræftpatienter i TCGA database.

Vi undersøgte status 17 promoter CpG ø-relaterede loci methylering (

APC

,

CACNA1G

,

CHFR

,

DAPK

,

DCC

,

MGMT

,

MINT

,

MLH1

,

p16

,

RASSF1

,

RASSF2

,

RASSF3

,

RASSF5

,

RASSF6

,

RUNX3

,

SFRP2

,

og UNC5C

) i TCGA database (TCGA foreløbig). Øvre 25% af hvert locus blev bestemt som hyper-methylerede. CIMP-høj blev defineret som mindst fem af hyper-methylering af disse loci (figur A). Den overlappende forhold mellem CIMP og

MLH1

methylering status blev analyseret. 55 patienter var i CIMP-høj /

MLH1

methylerede, 29 patienter var i CIMP-lav /

MLH1

methylerede, 77 patienter var i CIMP høj /

MLH1

ikke-methylerede og 177 patienter var i CIMP-lav /

MLH1

ikke-methylerede grupper (figur B). Korrelation mellem tumor dybde, lymfeknudemetastase, fjernmetastaser, Stage og CIMP /

MLH1

methylering status blev analyseret under anvendelse af Fishers eksakte test. Positiv lymfeknude metastaser (p = 0,0009) og højere Stage (p = 0,0078) var positivt korreleret med CIMP-høj /

MLH1

methylerede gruppe (figur C)

doi:. 10,1371 /journal.pone. 0130409.s001 Hotel (DOCX)

S2 Filer. Sygdomsfri overlevelse i Gastric kræftpatienter i TCGA database.

Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret i overensstemmelse med den

MLH1

methylering status. Den sygdomsfrie overlevelse blev bestemt for

MLH1

methylerede og ikke-methylerede grupper. Sygdomsfri overlevelse satser var lidt højere i

MLH1

denatureret gruppe sammenlignet med den ikke-methylerede gruppe, men forskellen var ikke signifikant (log-rank

P

= 0,1173) (Figur A). Sygdomsfri overlevelse satser blev analyseret for de CIMP-høje og CIMP-lave grupper, og satsen var lidt højere i CIMP høje gruppen end i CIMP-lave gruppe, men forskellen var ikke signifikant (log-rank

P

= 0,1847) (Figur B). Sygdomsfri overlevelse satser blev analyseret og sammenlignet mellem CIMP-høj /

MLH1

methylerede og andre grupper. Vi bemærkede, at de sygdomsfri overlevelse satser var lidt højere i den kombinerede CIMP-høj /

MLH1

methylerede gruppe, sammenlignet med de andre grupper, hvor forskellene ikke var statistisk signifikant (log-rank P = 0,1073) (Figur . C)

doi: 10,1371 /journal.pone.0130409.s002

(DOCX)

S1 Table. Primer sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0130409.s003

(DOCX)

S2 Table. Multivariat analyse af resultatet prædiktorer baseret på CIMP /MSI-status

doi:. 10,1371 /journal.pone.0130409.s004

(DOCX)

Tak

Forfatterne vil gerne tak Mr. Toru Nakai, Mrs. Tae Yamanishi, og Mr. Akihiro Nyuya til teknisk bistand.