PLoS ONE: Påvisning af livmoderhalskræft biomarkør Opskrifter i Blood plasma og urin ved differentialscanningskalometri og Mass Spectrometry

Abstrakt

Forbedrede metoder til nøjagtig identifikation af både tilstedeværelsen og sværhedsgraden af ​​cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) og der er behov omfanget af spredning af invasive karcinomer i cervix (IC). Differentiel scanningskalorimetri (DSC) er for nylig blevet vist at påvise specifikke ændringer i den termiske opførsel af blod plasmaproteiner i adskillige sygdomme. Denne metode er ved at blive undersøgt for at skabe en supplerende metode til screening af livmoderhalskræft sygdom. Den foreliggende undersøgelse evaluerede anvendeligheden af ​​DSC i skelne mellem raske kontrolpersoner, stigende sværhedsgrad af CIN og tidlig og avancerede IC. Betydelig diskrimination var tydeligt i forhold til omfanget af sygdom med nogen klar effekt af demografiske faktorer som alder, etnicitet, rygning status og paritet. Af de fleste klinisk relevans, der var stærk differentiering af CIN fra raske kontrolpersoner og IC, og blandt patienter med IC mellem FIGO fase I og fremskreden kræft. De observerede sygdomsspecifikke ændringer i DSC profiler (termogrammer) blev fremsat den hypotese at afspejle differentiel ekspression af sygdomstilstande biomarkører, som efterfølgende er bundet til og påvirket termiske opførsel af de mest udbredte plasmaproteiner. Effekten af ​​interagerende biomarkører kan udledes af modulering af termogrammer men kan ikke direkte identificeret af DSC. For at undersøge karakteren af ​​de foreslåede interaktioner blev massespektrometri (MS) analyser anvendes. Kvantitativ vurdering af de lavmolekylære proteinfragmenter af plasma- og urinprøver afslørede en lille liste over peptider, hvis overflod var korreleret med omfanget af cervikal sygdom, med de mest slående plasma peptidindhold data understøtter interactome teorien om peptid portionering til rigelige plasmaproteiner. Den kombinerede DSC og MS tilgang i denne undersøgelse lykkedes at identificere unikke biomarkør underskrifter for livmoderhalskræft og demonstreret nytten af ​​DSC plasma profiler som et supplerende diagnostisk redskab til at vurdere livmoderhalskræft sundhed

Henvisning:. Garbett NC, Merchant ML, Helm CW, Jenson AB, Klein JB, chaires JB (2014) Påvisning af livmoderhalskræft biomarkør Opskrifter i Blood plasma og urin ved differentialscanningskalometri og massespektrometri. PLoS ONE 9 (1): e84710. doi: 10,1371 /journal.pone.0084710

Redaktør: Jose M. Sanchez-Ruiz, Universidad de Granada, Spanien

Modtaget: August 31, 2013; Accepteret: November 18, 2013; Udgivet: 8. januar 2014

Copyright: © 2014 Garbett et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette materiale er baseret på arbejde understøttes af Kontoret for forskning og udvikling, Medicinsk Research service, Department of Veterans Affairs, Department of Energy Office of Science Assistance Program Financial (dE-FG02-05ER6406 til MLM og JBK), og NIEHS tilskud P30ES014443 ( til MLM og JBK). Dette arbejde blev også støttet af en underentreprise tildelt JBC fra National Cancer Institute tilskud R44 CA103437 og af en bevilling til JBC fra Elsa. U. Pardee Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. NCG, ABJ og JBC er co-opfindere på patentansøgninger beskriver DSC plasma termogrammet teknologi, hvortil Louisville Bioscience, Inc. (LBI) har en eksklusiv licens fra University of Louisville. JBC og ABJ er grundlæggere og aktionærer i LBI; NCG er en grundlægger, aktionær og medarbejder i LBI. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Invasiv karcinom i livmoderhalsen (IC) er den tredje mest almindelige kræftform blandt kvinder med en anslået 529.000 tilfælde diagnosticeret på verdensplan i 2008 og 274.000 dødsfald [1]. I de seneste årtier rutinemæssig screening har været med til at reducere både hyppigheden og dødsfald fra IC i USA, men ikke desto mindre vil en anslået 12,340 nye tilfælde blive diagnosticeret med 4.030 dødsfald i 2013 [2]. Invasiv kræft i livmoderhalsen forudgås af en præcancerøse betingelse, cervikal intraepithelial neoplasi (CIN), hvori abnorm cellevækst forekommer i epitelforingen af ​​livmoderhalsen. CIN er opdelt i klasser (1 = mild, 2 = moderat, 3 = svær) baseret på histologiske funktioner, herunder nukleare ændringer og omfanget af inddragelse af epitel. Risikoen for progression af CIN til IC over tid stiger med kvalitet, være højest for CIN 3 [3], [4]. CIN kan behandles for at reducere risikoen for IC udvikle. Dels for at hjælpe med at planlægge behandling, CIN 2 og CIN 3 er almindeligt grupperet som high-grade skællede intraepithelial læsion (HSIL), som ville blive behandlet og CIN 1 og HPV kondylomer så lav kvalitet skællede intraepithelial læsion (LSIL), som ville være ubehandlet . Når IC opdages det vigtigste behov er at afgøre, om der er tidligt stadie sygdom (FIGO fase I), som er begrænset til livmoderhalsen, eller hvis der er mere avanceret metastatisk sygdom. Kun sygdom begrænset til livmoderhalsen og tilstrækkelig lille størrelse anses behandles med kirurgi.

Pålidelige metoder til præcist opdage CIN og IC er kritiske. Aktuel screening kan ikke skelne lav kvalitet fra højere lønklasse CIN, CIN fra IC, tidligt fra mere avancerede stadier af IC, eller bestemme yderligere status sygdom indikatorer såsom tilstedeværelsen af ​​lymfeknudeinvolvering. I mange år den indledende screeningsfremgangsmåde til CIN har været den Pap smear test, som muliggør cytologiske abnormaliteter, der skal detekteres på afskrab fra cervix. Kvinder med celleprøve tyder planocellulære intraepithelial læsioner ville så blive evalueret, herunder ved klinisk undersøgelse og kolposkopi og biopsi, for at bestemme den lønklasse og omfanget af eventuelle CIN nuværende og udelukke (eller diagnosticere) tilstedeværelsen af ​​IC. Celleprøvescreening nu integreret med testning for højrisiko-genotyper af human papillomavirus (HPV HR), som kan påvises i den samme cytologisk celleprøve prøve under anvendelse væskebaseret Hybrid Capture II teknologi [5]. Alle kvaliteter af CIN er forbundet med en høj sandsynlighed for tilstedeværelsen af ​​HPV HR. Hos kvinder mellem 30 og 65 år HPV HR test forbedrer opdagelse sats af CIN 3 eller højere med 17-31% i den første runde af screening og reducerer forekomsten af ​​IC i anden runde af screening [6], [7], [8], [9]. HPV HR test nu også integreres i opfølgningen af ​​kvinder, der tidligere er blevet vist at have HPV HR-infektion eller CIN, da persisterende HPV HR-infektion er associeret med en øget risiko for udvikling af tilbagevendende CIN og IC [6] , [10]. Selvom teste for HPV HR kan forbedre påvisningen af ​​CIN det kan ikke skelne mellem CIN læsioner med en højere sandsynlighed for forløber fra dem, der ikke gør. Biomarkører er blevet undersøgt i denne henseende, men har endnu ikke vist sig nyttig [11], [12], [13], [14]. Work-up og behandling af kvinder med unormale celleprøve er traumatisk fysisk, følelsesmæssigt og økonomisk, og desværre på grund af den manglende evne til at skelne CIN læsioner med en højere sandsynlighed for progression til IC mange kvinder stadig få over behandles.

Her beskriver vi anvendelsen af ​​en kombineret metode differentialscanningskalometri (DSC) og massespektrometri (MS) til karakterisering af cervikal sygdom. DSC er almindeligt anvendt til at måle denatureringen profiler af biomolekyler, kendt som termogrammer, ved direkte overvågning af varme ændringer i forbindelse med molekylære begivenheder som en funktion af temperaturen. Under givne opløsningsbetingelser, et termogram giver en unik signatur for et givet protein med specifikke strukturelle motiver og molekylære kræfter. Det har for nylig vist, at DSC kan anvendes til analyse af blodplasma til at give en indikation af et individs kliniske status [15], [16], [17], [18], [19], [20], [ ,,,0],21], [22], [23], [24]. Termogrammet af plasma fra raske individer afspejlede den vægtede sum af denatureringen profiler af de mest udbredte plasmaproteiner; dog termogrammer fra individer med forskellige tilstande eller sygdomme var signifikant ændret [15], [16], [17], [18]. Termogram ændringer syntes at være følsom over for den særlige sygdomstilstand, og indikerede, at plasma DSC kan have nytte som et klinisk screeningsmetode diagnostisk. Mekanismer til sygdomsspecifikke ændringer i termogrammer øjeblikket under efterforskning i vores laboratorium, men vi hypotesen, at de afspejler tilstedeværelsen af ​​sygdom biomarkører, som modificerer eller interagere med plasmaproteiner dermed påvirke deres denaturering egenskaber. Sådanne biomarkør interaktioner ville støtte “interactome” koncept, foreslår, at peptider med lav molekylvægt til stede i plasmaet proteom er kompleksbundet med mere rigelige plasmaproteiner oprettelse af et netværk af protein-protein og peptid-protein-interaktioner [25]. Selv om tilstedeværelsen af ​​formodede lavmolekylære biomarkører kan udledes gennem ændringer i termogrammet nogen direkte identifikation kan fremstilles ved denne fremgangsmåde. Vi har anvendt en MS peptidomic tilgang til at undersøge karakteren af ​​plasma termogram profiler forbundet med livmoderhalskræft sygdom.

MS har været brugt som et redskab til at støtte i forståelsen af ​​sygdommens patogenese og generering af kandidat biomarkører for sygdom [ ,,,0],26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. En anvendelse af MS har været den kvantitative og kvalitative analyse af lavmolekylære protein fragmenter fundet i plasma og /eller urin, der omtales som en peptidomic tilgang [33], med det mål at korrelere overflod med detektering eller prognose af sygdom. Peptiderne observeret i disse undersøgelser er reflekterende af metaboliske omsætning forælder proteiner med overflod ændringer mellem tilfælde (sygdom) og kontrol forhold relateret til en ændring (er) til proteinets normale kataboliske eller anabolske metaboliske halveringstid. Disse peptidomic undersøgelser har i nogle tilfælde med succes demonstreret korrelationer mellem mængder eller mønstre af adskillige peptider med sygdommen eller sygdomsprogression. Med hensyn til cervikal sygdom, er det metastatiske potentiale af CIN blevet korreleret med ekspressionen af ​​tre proteiner, herunder matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9, og urokinase-plasminogenaktivator [14]. På grund af den primære inddragelse af peptid genererende metalloproteinaser i sygdomsprogression kunne denne korrelation af CIN udvides til peptidomic fænotype. Som sådan kunne tilstedeværelsen af ​​unikke plasma og /eller urin peptidprofil (er) fastsættes ved MS tilgange og korreleres med termogram profiler afspejler tilstedeværelsen og omfanget af cervikal sygdom. Vi beskriver resultater demonstrerer følsomhed DSC termogrammer til klinisk status og dokumentation for sammenslutningen af ​​termogrammet profiler med interagerende peptid biomarkører identificeret af MS.

Materialer og Metoder

Prøvetagning

undersøgelsen protokol og patient godkendelsesprocedurer blev godkendt af University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 08,0108, 608,03). Kvinder deltager klinikker i afdelingen for Gynækologisk onkologi med biopsi-verificeret livmoderhalskræft intra-epitel neoplasi og invasive livmoderhalskræft var støtteberettigede, og gav skriftligt informeret samtykke for deres blod og væv, der skal opføres i et væv repository (IRB # 608,03) og anvendes til forskningsformål. IRB godkendte specifikt anvendelse af væv fra vævet repository til anvendelse i denne undersøgelse uden behov for yderligere samtykke (IRB # 08.0108). Kvinder er kendt for at være hiv-positive var støtteberettigede. Blod og spot urinprøver blev indsamlet fra rekrutteret patienter i løbet af deres første klinik besøg på tidspunktet for evalueringen og før modtagelsen terapi. Urinprøver blev alikvoteret og straks opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Blod blev trukket ind i 5 ml lilla top (plasma K

2-EDTA antikoagulerende) vacutainere. Rørene blev forsigtigt blandet ved inversion 8-10 gange umiddelbart efter blodprøvetagning at fordele antikoagulerende additiv efterfulgt af centrifugering ved 3200 rpm i 10 minutter (BD-Clay Adams Compact II centrifuge). Separerede plasma blev omhyggeligt aspireret for at undgå hæmolyse eller kontaminering af de separerede blod faser, alikvoteret og straks opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Kontrol blod og urinprøver blev indsamlet under samme studie procedurer fra raske frivillige med ingen historie unormal celleprøve eller kræft. Som ovenfor blev protokollen og procedurerne for tilladelse undersøgelse godkendt af University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 08,0108, 608,03). Alle frivillige gav skriftligt, informeret samtykke for deres blod og væv, der skal opføres i et væv repository (IRB # 608,03) og anvendes til forskningsformål. IRB godkendte specifikt anvendelse af væv fra vævet repository (IRB # 608,03) til brug i denne undersøgelse uden behov for yderligere samtykke (IRB # 08.0108). Specimen portioner blev optøet til analyse og resten kasseres. Al håndtering af prøver og modeller affald var i overensstemmelse med OSHA blodbårne patogene procedurer. Alle prøver indsamlet til undersøgelsen blev deidentified og gemt i Gynækologisk onkologi Tissue Bank på James Graham Brown Cancer Center. Tilknyttet demografiske og kliniske oplysninger blev indsamlet af kliniske studier personale og opbevares sikkert på studiet computer. Vævsbanken blev godkendt af University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 608,03) og var fuldt HIPAA kompatibel. Prøver leveres til grundlæggende videnskab undersøgelse personale (NCG, MLM, ABJ, JBK, JBC) for DSC og MS undersøgelser blev kodet af vævsbank kollektion nummer. I denne form eksemplarer blev deidentified og blindet for både demografisk og patologisk sygdomsstatus for saglig dataindsamling. Demografisk og sygdomsstatus blev efterfølgende fastsat for data sortering og tolkning.

DSC Studies

Sample forberedelse til DSC studier.

Plasmaprøver (100 uL) blev dialyseres mod en standard phosphatpuffer (1,7 mM KH

2PO

4, 8,3 mM K

2HPO

4, 150 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat, pH 7,5) i 24 timer ved 4 ° C for at opnå normalisering af pufferbetingelser for alle prøver. Frosne plasmaprøver blev optøet natten over ved 4 ° C dagen før dialyse. Om morgenen den dialyse blev prøver fyldt i Slide-A-Lyzer mini dialyse enheder (MWCO 3.500, Pierce, Rockford, IL), der var blevet ækvilibreret mod dialysebuffer natten over. Baseret på omkostninger og pålidelighed, vi rutinemæssigt igen samlet vaskede dialyse enheder erstatter den oprindelige dialyse membran med cut-til-størrelse slangeskind Plisseret Dialyse Tubing (Pierce, Rockford, IL). Prøver blev dialyseret mod 1 liter phosphatpuffer med buffer-ændringer efter tre timers dialyse, derefter efter to perioder på fire timer med en endelig dialyse natten periode. Prøver blev udvundet fra dialysen og filtreret for at fjerne partikler under anvendelse af en spin-X centrifugerør filter (0,45 um celluloseacetat, Corning Incorporated, Corning, NY). Den endelige dialyse buffer blev også filtreret (0,2 um polyethersulfon, Pall Corporation, Ann Arbor, MI).. Og anvendes til alle prøvefortyndinger og som reference løsning til DSC studier

DSC-analyse

DSC-data blev indsamlet med en MicroCal VP-Kapillær DSC instrument med integreret autosampler (MicroCal, LLC, Northampton, MA, nu en del af GE Healthcare). Elektrisk kalibrering af den differentierede power signal og temperatur kalibrering ved hjælp kulbrinte temperaturstandarder blev udført som en del af fabrikantens årlige instrument vedligeholdelse. Producent kravspecifikationer for temperaturen standarder er ± 0,2 ° C. Interim instrument præstation blev vurderet ved hjælp af biologiske standarder lysozym og RNaseA. Producent ydeevne specifikationer for biologiske standarder er ± 0,5 ° C. Dialyserede plasmaprøver blev fortyndet 25 gange til opnåelse af en egnet proteinkoncentration til DSC-analyse. Prøver og dialysat blev overført til plader med 96 brønde og derefter fyldt i instrumentet autosampleren termostateret ved 5 ° C indtil analyse. Prøve mængder af 400 uL blev forpligtet til at give tilstrækkelig volumen til lastning af instrumentet kapillar og sikre en korrekt fyldning af 135 uL termiske sensing område. DSC-scanninger blev registreret fra 20 ° C til 110 ° C ved en scanningshastighed på 1 ° C /min med en pre-scan termostat på 15 minutter, mid tilbagemelding mode og en filtrering periode på 2 sekunder. Identiske DSC-scanninger blev opnået for hver plasmaprøve. For hvert eksperiment sæt, vi batched prøver at sikre analyse blev afsluttet inden for en syv dages vindue efter indledende optøning af prøver. I udviklingen af ​​vores eksperimentelle procedure har vi nøje vurderet prøve og buffer scanninger som en funktion af køre sekvens, instrument kammer skylning og rengøring protokol, og tid siden forberedelse. Vi har undersøgt buffer scanninger indsamlet i begyndelsen og slutningen af ​​en prøvesæt og efter en enkelt eller på hinanden følgende prøve scanninger og bestemt acceptabel reproducerbarhed og effektiv rengøring af instrumenter kamre. Vi har sammenlignet dobbeltprøve scanninger opsamlet efter en puffer eller prøve scanning og fundet det er muligt at indsamle hinanden følgende sample scanninger efter omfattende skylning af instrumenterne kamre uden effekt på termogram profil. Vi rutinemæssigt sammenlignet dobbeltprøve scanninger indsamlet under forskellige run-sekvenser og på forskellige tidspunkter for at sikre termogrammet profil var reproducerbar. Salg

DSC-data blev analyseret under anvendelse Origin 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Rå DSC-data blev korrigeret for den instrumentale baseline ved fratrækning af en egnet buffer henvisning scanning. Korrigerede scanninger blev normaliseret til det totale protein fusion, der blev bestemt kolorimetrisk under anvendelse af bicinchoninsyre proteinassaykit og mikroplade proceduren fra Pierce (Pierce, Rockford, IL), med mindre modifikationer til producentens protokol. Absorbansaflæsninger blev taget ved hjælp af en Tecan Sunrise mikroplade absorbans læser (Tecan USA, Research Triangle Park, NC). Efter normalisering, blev plasma DSC-scanninger korrigeret for ikke-nul basislinjer ved anvendelse af en lineær baseline pasform. Valg af en passende stikprøve baseline korrektion kompliceres af tilstedeværelsen af ​​et begrænset område af post-overgang baseline efterfulgt af sammenlægning og nedbørshændelser opstår efter den termiske denaturering kuvert. Vi har vurderet alle tilgængelige baseline korrektion muligheder inden for analyse software og fundet den lineære baseline mulighed for at give de mest konsistente resultater, når testet på gentagne målinger, forskellige prøver og af uafhængige brugergrupper bestemmelser. Vi accepterer, at vores tilgang kan have begrænsninger, men har valgt den mest konsekvente baseline korrektion metode, der kan anvendes på tværs af alle vores undersøgelser. Afsluttende termogrammerne blev plottet som overskydende specifikke varmekapacitet (cal /° CG) versus temperatur (° C).

Statistisk analyse af DSC-dataene.

Undersøgelse af alle termogram data viste, at temperaturområdet 45-90 ° C spændte fuldstændig denaturering profil for alle prøver og scanninger blev afkortet til dette interval for alle efterfølgende analyser. Kvantitativ sammenligning af termogrammer blev opnået gennem beregning af et antal af form og funktion metrics. Parametre betragtes var summen af ​​arealerne; tophøjde; toppens bredde i halv højde; temperatur af top maksimum (T

max); varmekapacitet af den primære overgang i området 60-65 ° C [C

s

ex (top 1)]; varmekapacitet af den sekundære overgang ved 68-72 ° C [C

s

ex (top 2)]; forholdet mellem den første og anden overgang amplituder [C

s

ex (top 1)] /[C

s

ex (top 2)]. På grund af kompleksiteten af ​​termogrammet figurer, blev en ekstra parameter beregnet til at give et mål for fordelingen af ​​arealet af denaturering profil i forhold til temperaturen akse. Det første øjeblik temperatur (T

FM) blev bestemt ifølge ligning 1: (1)

termogrammerne blev grupperet efter patologisk sygdomsstatus i fem grupper: raske kontroller, LSIL (CIN 1), HSIL (CIN 2, CIN 3), tidlig fase IC (fase I) og avancerede IC (fase II-IV). Mean termogrammer med standardafvigelser blev bestemt for hver studiegruppe.

Forskelle i termogram form og funktion målinger blev vurderet af ikke-parametriske metoder. Først blev box diagrammer bruges til at sammenligne forskelle i fordelingerne mellem hver studiegruppe. Box diagrammer blev konstrueret med følgende form: bunden og toppen af ​​kassen repræsenterede 25

th og 75

percentil henholdsvis og 50-percentilen var repræsenteret af bandet i midten af ​​kassen. Den nederste og øverste ender af knurhår betegnes de 5

th og 95

th fraktiler hhv. Vandrette linjer angivet minimum og maksimum af alle data og kors repræsenterede en

st og 99

th percentiler. Den gennemsnitlige blev betegnet med en åben plads. Forskelle i termogram målinger for hvert klinisk gruppe blev testet for signifikans ved hjælp af den ikke-parametriske Mann-Whitney U test for ulige medianer [34].

MS Studies

Eksperimentel design af MS undersøgelser.

Rækkefølgen af ​​prøvehåndtering og analyse (prøve nummer, orden prøveforberedelse, frysetørring, MALDI-TOF plade spotting, og TOF dataopsamling) blev randomiseret til at minimere systematiske udsving i løbet af dataopsamling. Prøver blev behandlet til isolering frie peptider (fraktion 1 eller FX1), isolere peptider, der var bundet til total plasma proteiner (fraktion 2 eller FX2), isolere peptider frigives under immunodepletion af albumin og IgG fra plasma (fraktion 3 eller FX3), og isolere peptider selektivt bundet til den meget rigelige proteiner, albumin og IgG (fraktion 4 eller FX4). Prøverne blev spottet i tre eksemplarer, MALDI-TOF MS-data erhvervet og signal gennemsnit på tværs af de tre pletter. Analyse af midlede data for differentielt rigelige peptider blev udført under anvendelse principal komponent analyse (PCA) og t-test, efterfulgt af manuel gennemgang af ionintensiteter for udvalgte peptider. Manuel gennemgang blev udført for at sikre, at peptider ikke blev udelukket som følge af forkert baseline normalisering eller baseline subtraktion.

Sample håndtering.

Prøverne blev optøet én gang for at udportionerer i 100 pi volumener til opbevaring ved -80 ° C og én gang til prøveforberedelse for peptid kvantificering. Prøver blev analyseret ved anvendelse af to separate portioner og individuelle portioner blev analyseret i tre eksemplarer. Plasmaprøver blev udtømt for albumin og IgG under anvendelse af kommercielt tilgængelige affinitet spin-søjler (Sartorius N. A. Inc, Edgewood, NY) ifølge producentens anvisninger. Peptider der ikke er bundet til plasmaproteiner blev isoleret under anvendelse af en modifikation af nedbør fremgangsmåden ifølge Chertov et al [35]. Peptider bundet til albumin og IgG blev udvundet fra albumin /IgG affinitet harpiks ved syre stripning med 10% eddikesyre. Peptider bundet til plasmaproteiner blev udvundet fra det organiske opløsningsmiddel-koaguleret proteiner ved salt eller syre ionisering. Nyttiggjorte peptid opløsninger blev lyofiliseret og resuspenderet i 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) før MALDI-TOF MS analyse. Spot urinprøver blev optøet fra -80 ° C på is. Urinprøver blev centrifugeret ved 1.500 x g i 15 minutter ved 4 ° C for at pelletere cellerester og partikler. Urin peptider blev isoleret under anvendelse af Amicon Ultra-4 (10.000 NMWCO) (Millipore, Billerica, MA) som tidligere beskrevet [26].

MS-analyse af isolerede plasma og urin peptider.

Alle prøver blev afsaltet og koncentreret til MALDI-TOF MS-analyse under anvendelse C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA). Peptider blev elueret fra C18-harpiks under anvendelse af prøvematrixen, 5 mg /ml 4-hydroxy-α-cyanokanelsyre (α-CN), og gælder spottet i tre eksemplarer på MALDI plade. Positiv ion MALDI-TOF massespektre blev erhvervet som beskrevet [36]. Peptider udvalgt til yderligere undersøgelser blev analyseret under anvendelse af AB4700 i TOF /TOF-tilstand og fortolkning af fragmentering data ved hjælp Mascot (Matrix Science, Boston, MA) ver1.9 som tidligere beskrevet [26].

Statistisk analyse af MS data.

Datafiler (.t2d) blev eksporteret fra AB4700 Proteomics Analyzer og importeres til MarkerView software. Denne software kan finde spektrale spidser ved brugerdefinerede masse tolerancegrænser eller bin spektre via brugerdefinerede bin størrelser. Desuden kan brugeren definere minimale og maksimale signalrespons, som hjælper i forbindelse med high-dimensional massespektraldata datasæt. Data blev analyseret ved anvendelse af data binning, hvilket gav mulighed for baseline subtraktion. Peptid udtryk data blev først undersøgt ved hjælp af PCA. Efter import af data, blev dataene forbehandles ved hjælp no-vægtning og enten gennemsnitlig-centreret eller Pareto data skalering før PCA. PCA er en metode til eksplorativ dataanalyse, der reducerer kompleksiteten af ​​data, samtidig beholder deres variabilitet, ved at transformere data til en ny gruppe af variabler, benævnt hovedkomponenterne. PCA blev anvendt til at opnå en objektiv vurdering af, hvorvidt den MALDI-TOF MS peptidekspression data selvstændig sorteret i grupper svarende til patienter med CIN, livmoderhalskræft og raske kontroller uden CIN /livmoderhalskræft. Differentiel peptid og protein-ekspression blev sammenlignet ved uparret, tohalet t-test under anvendelse af linie MALDI spektre og det gennemsnitlige samling af toppe område for individuelle peptider. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som signifikant. Differentielt udtrykte peptider blev udvalgt til tandem MS-analyse ved hjælp af AB4700 Proteomics Analyzer.

Resultater

Plasma prøver fra 67 kvinder deltager afdelingen for Gynækologisk onkologi klinik og 4 raske frivillige blev indsamlet til DSC-analyse. Fordelingen af ​​specimen tal var som følger: kontrol = 4, CIN 1 = 3, CIN 2 = 4, CIN 2-3 = 3; CIN 3 = 22, IC = 35 (FIGO fase I = 14, II = 10, IIIb = 7, IV = 4); aldersgruppe = 18-69 år (gennemsnit 38,7 år) (tabel S1). Komplet demografiske og kliniske oplysninger, herunder biopsi-verificeret CIN og IC-status, blev indsamlet for alle prøver af medlemmer af den kliniske undersøgelse team. Prøver leveres til den grundlæggende videnskab undersøgelsen holdet deidentified og blottet for al demografiske og kliniske oplysninger. DSC-analyse af plasmaprøver viste normaliserede, baseline-korrigeret dublerede termogrammer for hver prøve. På dette trin blev klinisk og demografiske oplysninger til den grundlæggende videnskab team for efterfølgende analyser.

Vi har tidligere vist, at termogram af plasma opnået fra raske individer repræsenterer den termiske denaturering af de mest udbredte plasmaproteiner vægtet i forhold til deres gennemsnitlige normale plasmakoncentrationer [18]. For den nuværende undersøgelse blev termogrammer plasma opnået fra raske frivillige gennemsnit at opnå en undersøgelse specifikt ‘sund kontrol “profil, der tegner sig for de specifikke protokoller indsamling og håndtering ansat i den aktuelle undersøgelse. Til sammenligning blev den tidligere offentliggjorte gennemsnitlige termogram opnået fra 15 raske individer: 9 mænd og 6 kvinder (11 afrikanske amerikanske og fire kaukasiske) i alderen fra 22 til 50 år (gennemsnit 37,0 år). Den gennemsnitlige termogrammet har et areal på 5,02 ± 0,23 cal /g og en første øjeblik temperatur (T

FM) af 67,4 ± 0,8 ° C. Undersøgelsen-specifikke ‘sund kontrol “profil opnået fra 4 kaukasiske hunner med en lignende aldersgruppe til den tidligere undersøgelse (25-50 år betyder 39,3 år) sammenligner godt med lignende område (4,94 ± 0,19 cal /g) og T

FM (66,3 ± 0,3 ° C) værdier

termogrammerne blev midlet inden for fem kliniske grupper:. kontrol, LSIL, HSIL, fase i og fase II-IV. De gennemsnitlige termogrammer er forskellige fra hinanden og udviser en progressiv ændring i profilform (figur 1A). Den væsentligste forandring i intervallet 60-65 ° C bliver gradvist lavere med en stigning i amplituden af ​​den anden overgang omkring 70 ° C. Hver klinisk gruppe blev undersøgt for effekten af ​​patientens demografiske faktorer, specielt alder, etnicitet, rygning status og paritet med ingen signifikant virkning fundet på de gennemsnitlige termogrammerne. Variansen tilknyttet hver gruppe profil blev undersøgt ved beregning af standardafvigelser ved hver temperatur og konstruktion af et plot af standardafvigelsen af ​​varmekapacitet som funktion af temperatur (figur 1B). Den sunde kontrolgruppe viser den mindste varians over hele temperaturområdet. De andre kliniske grupper viser højere varians i forbindelse primært med den store overgang -65 ° C samt den anden overgang -70 ° C og dens højere temperatur skuldre. Den observerede termogrammet varians ligner vores tidligere bemærkninger [18] og afspejler både forventede kliniske variation i plasma protein niveauer samt sygdom forbundet protein modifikationer.

Mean termogram profiler af overskydende specifikke varmekapacitet (C

p

ex) versus temperatur (panel A) og standardafvigelse (panel B) for hver klinisk gruppe: kontrol (sort); LSIL (rød); HSIL (grøn); tidligt stadium IC [FIGO Stage I] (blå); og avancerede IC [FIGO fase II-IV] (cyan). Termogrammer viser en gradvis overgang til højere denatureringstemperaturer med stigende sygdomsbyrde. Forskel plots af klinisk gruppe termogrammer sammenlignet med kontrolgruppen (panel C) viser negative forskel toppe ~62 ° C og stigende skift og omfanget af højere temperatur positiv forskel toppe. Disse er en hypotese at afspejle samspillet mellem sygdomsspecifikke komponenter med rigelige plasmaproteiner, hovedsageligt albumin, med deraf følgende termisk stabilisering og ændring af plasma termogrammet profiler.

Ændringer i termogram profiler forbundet med sygdomsbyrden blev undersøgt gennem DSC forskel plots, som skyldes ændringer i gruppe termogrammer forhold til den raske kontrolgruppe (figur 1C). For hver CIN lønklasse eller IC scenen, var der en negativ forskel peak centreret ~62 ° C med højere temperatur positiv forskel toppe. De positive forskel toppe flyttet til højere temperatur og steg i størrelsesorden med øget sygdomsbyrde. Den LSIL gruppe følger ikke denne tendens i positiv forskel toppe; dette kunne afspejle dårlig definition af denne kliniske gruppe grund af de lave numre sample (n = 3) til evaluering. Mens disse ændringer i termogrammet profil fortsat under efterforskning i vores laboratorium de foreslår den termiske stabilisering af plasmaprotein (r) med en denaturering profil vises ~62 ° C.