PLoS ONE: Tab af urothelial Differentiering Marker FOXA1 er forbundet med High Grade, Late Stage blærekræft og Øget Tumor Proliferation

Abstrakt

Omkring 50% af patienter med muskel-invasiv blærekræft (MIBC) udvikle metastatisk sygdom, som er næsten uvægerligt dødelig. Men vores forståelse af veje, der driver aggressiv adfærd MIBC er ufuldstændig. Medlemmer af Foxa underfamilien af ​​transkriptionsfaktorer er impliceret i normale urogenitale udviklings- og urologiske maligniteter. Foxa proteiner er impliceret i normal urotelial differentiering, men deres rolle i blærekræft er ukendt. Vi undersøgte Foxa udtryk i almindeligt anvendte

in vitro

modeller for blærecancer og i humane blærekræft prøver, og brugte en roman

in vivo

væv rekombination for at fastslå den funktionelle betydning af FOXA1 udtryk i blærekræft. Logistisk regressionsanalyse viste reduceret FOXA1 ekspression er forbundet med stigende tumor fase (p 0,001), og tab af FOXA1 er forbundet med høj histologisk bedømmelse (p 0,001). Også, fandt vi, at blæren urothelium, som har undergået keratiniserende squamøs metaplasi, en forløber for udviklingen af ​​pladecellecarcinom (SCC) udviste tab af FOXA1 ekspression. Endvidere 81% af tilfældene af SCC af blæren var negative for FOXA1 farvning sammenlignet med kun 40% af urothelial cellecarcinomer. Desuden viste vi, at en delpopulation af FOXA1 negative urothelial tumorceller er meget proliferativ. Knockdown af FOXA1 i RT4 blære kræftceller resulterede i forøget ekspression af UPK1B, UPK2, UPK3A, og UPK3B, nedsat E-cadherin ekspression og signifikant øget celleproliferation, mens overekspression af FOXA1 i T24 celler steg E-cadherin ekspression og faldt betydeligt cellevækst og invasion.

In vivo

rekombination af blære cancerceller manipuleret til at udvise reduceret FOXA1 udtryk med embryonal rotte blære mesenkym og efterfølgende renal kapsel indpodning resulterede i forøget tumorproliferation. Disse resultater giver det første beviser, der forbinder tab af FOXA1 udtryk med histologiske undertyper af MIBC og urotelial celledeling, og foreslå en vigtig rolle for FOXA1 i den maligne fænotype af MIBC

Henvisning:. DeGraff DJ, Clark PE, Cates JM, Yamashita H, Robinson VL, Yu X, et al. (2012) Tab af urothelial Differentiering Marker FOXA1 er forbundet med High Grade, Late Stage blærekræft og Øget Tumor spredning. PLoS ONE 7 (5): e36669. doi: 10,1371 /journal.pone.0036669

Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA

Modtaget: November 16, 2011; Accepteret: April 9, 2012; Udgivet: May 10, 2012 |

Copyright: © 2012 DeGraff et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Djd var støttet af American Cancer Society Great Lakes Division-Michigan Cancer Research Fund Postdoc Fellowship. PEC blev støttet af USA National Institutes of Health (NIH) tilskud K08-CA113452. Denne undersøgelse blev også støttet delvist af NIH tilskud CA143971 til DT, til en Merit anmeldelse Award fra Veterans Administration XW, og NIH tilskud R01-DK55748 til RJM. Denne forskning blev også støttet delvist af Vanderbilt CTSA tilskud UL1RR024975-01 fra NCRR /NIH. Forfatterne ønsker at anerkende den tekniske ekspertise og rådgivning af Doug Strand og Simon Hayward i designfasen af ​​væv rekombinationseksperimenter, og støtte fra Michael Kidd, Tom Case og Manik Paul, samt Blære Cancer Research Network (BCRN), den (BCAN) Diane Zipursky Quale blærekræft Advocacy Network, og for deres støtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Djd, PEC, JMC, SFS, HFF, DT, og RJM har indgivet en opfindelsen videregivelse med Vanderbilt University for brug af FOXA1 som et diagnostisk og /eller prognostisk markør for blærecancer. Der er ikke yderligere produkter i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Det anslås, at i 2011 mere end 69.250 mennesker i USA vil blive diagnosticeret med carcinom i urinblæren [1]. Mere end 90% af blære kræft er histopatologisk klassificeret som urothelial celle karcinomer (UCC), mens adenocarcinomer, planocellulært karcinom (SCC) og små celle carcinomer repræsenterer mindre almindelige histologiske varianter. De fleste patienter til stede med non-invasiv sygdom, men ofte udvikler recidiv, undertiden med progression til stromale invasion. Således er årvågen overvågning af disse patienter med periodisk cystoskopi og urin cytologi kræves følgende tumor behandling. Klinisk forvaltning for patienter med Ta eller Tis sygdom er derfor overordentlig dyrt [1]. På den anden side, klinisk intervention, efter diagnosen muskel invasiv blærekræft (MIBC; tumor stage≥T2) medfører typisk radikal cystektomi. Trods aggressiv kirurgisk indgreb, vil cirka 50% af patienter, der gennemgår radikal cystektomi opleve recidiv, sædvanligvis i form af metastatisk sygdom. Udviklingen af ​​metastatisk sygdom er næsten altid dødelig, og det skønnes i 2011 at over 14.990 personer i USA vil omkomme fra metastatisk blærecancer i USA [1].

I forhold til andre maligniteter, blære kræft er alvorligt dublerede og underfinansieret. I betragtning af den høje pris på overvågning og høj dødelighed hos patienter med fremskreden sygdom, øget indsats for at definere er brug de biologiske veje kritiske for sådanne presserende kliniske problemer i tumor tilbagefald, samt progression til muskel invasion, og /eller fjernmetastaser. En fremgangsmåde er at identificere de veje, der påvirker normal differentiering, der er forstyrret under tumor initiering og progression. En gruppe af proteiner, der synes at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​og kontrol med vævsspecifik ekspression i blære urothelium består af udvalgte medlemmer af Forkhead Box (FOX) familie af transkriptionsfaktorer. Adskillige nylige rapporter har impliceret en central rolle for et medlem af denne familie, FOXA1, i urotelial differentiering [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Mens FOXA1 udtrykkes i normal voksen murin og human urothelium, omfanget af Foxa familiemedlem ekspression i blærecarcinom er ukendt. Da andre FOX proteiner er blevet impliceret i udviklingen og progressionen af ​​en række forskellige maligniteter [8], indledte vi en undersøgelse for at afhøre Foxa familiemedlem udtryk i humane blærekræft cellelinjer og i humane tumorprøver, samt at bestemme den funktionelle rolle FOXA1 i et væv rekombination model af urothelial tumor cellebiologi.

Materialer og metoder

etiske retningslinjer

de-identificerede humane blære vævsprøver blev opnået fra Vanderbilt tissue erhvervelse Core via Patologisk Institut i overensstemmelse med Vanderbilt IRB-protokoller. Tissue microarrays blev skabt som beskrevet tidligere [9] fra de identificerede humane blære væv opnået fra University of Virginia, og blev anvendt i overensstemmelse med University of Virginia IRB protokoller. Alle patienter underskrevet informeret samtykke om godkendelse af brugen af ​​deres væv til uspecificerede forskningsformål. blev udført Alle forsøg med dyr som defineret i Vanderbilt dyr protokol nummer M-10-411, og i henhold til dyreværnsloven og godkendt af Vanderbilt Institutional Animal Care og brug Udvalg. Animal pleje /velfærd og veterinære tilsyn blev leveret af Vanderbilt Divison of Animal Care.

Cell kultur

De tidligere etablerede humane blære cancer cellelinjer RT4 [10] og T24 [11] blev opretholdt i McCoys modificerede medium suppleret med 10% FBS. J82 [12], 5637 [13] og UMUC-3 [14] humane urothelial cancercellelinier dyrkedes i DMEM med L-glutamin og høj glucose (4,5 g /l; Mediatech) suppleret med 10% FCS (Atlanta Biologicals) og 100 enheder /ml penicillin /streptomycin (BioWhittaker /Cambrex). 253J-P og 253J-BV [15] celler blev opnået gennem en aftale materiale overførsel fra laboratoriet af Dr. Colin Dinney (University of Texas MD Anderson Cancer Center) og dyrket i MEM (Mediatech) suppleret med 10% FCS (Atlanta Biologicals ), 100 enheder /ml penicillin /streptomycin (BioWhittaker /Cambrex), 10 mmol /l natriumpyruvat (Mediatech), 1x ikke-essentielle aminosyrer (Mediatech) og 2x MEM vitamin opløsning (Mediatech). Scaber celler [16] blev opnået fra ATCC og opretholdt i Minimum essential medium (Eagle) (Invitrogen) indeholdende 10% FCS med 2 mM L-glutamin (Mediatech) og Earles balancerede saltopløsning (Invitrogen) tilpasset til at indeholde 1,5 g /l natriumphosphat bicarbonat, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer og 1,0 mM natriumpyruvat. Den tidligere etableret human prostataadenocarcinom cellelinier LNCaP [17] og PC3 [18] og hepatocellulært carcinom HepG2 [19] blev opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2.

PCR

RNA-ekstraktion blev udført med RNeasy kits (Qiagen) i henhold til fabrikantens protokol med DNase-fordøjelse. Efterfølgende cDNA blev amplificeret i overensstemmelse med standardprotokoller. PCR blev udført med primer sæt til human FOXA1 (FWD-CGCTTCGCACAGGGCTGGAT, rev-TGCTGACCGGGACGGAGGAG), FOXA2 (FWD-TGCCATGCACTCGGCTTCCA, rev-CCCAGGCCGGCGTTCATGTT), FOXA3 (FWD-CTGGCCGAGTGGAGCTACTA, rev-GAGGATTCAGGGTCATGTAGGA). Primer sekvenser anvendt til standard PCR af uroplakin transkripter er tidligere blevet beskrevet [20]. Primer sæt til Q-RT-PCR-analyse omfatter UPK1A fwd-GGTGTGGGTGCCGCACTCTG, rev-GGTCGGTGTCCGCGCTGTAG), UPK1B (FWD-GCCCTACCGTGTGCGCAGAAA, rev-AGCAGGCCCTGGAAGCAACG), UPK2 (fwd- CTCTGCTGTCCCCAGGGGCT, rev-GGCAACCAGCAGGCTCTCCG), UPK3A (FWD-TCACTGGCACCCACGAGGTCT, omsæt- CGTTGAGCCCAGTGGGGTGTT), og UPK3B (fwd- CCCTGGCCCTGGACCCTATCG, rev-CCACAGGCTGGAGAAGCGCA). GAPDH (fwd-TGCACCACCAACTGCTTAGC, rev-GGCATGGACTGTGGTCATGAG) blev anvendt som tidligere rapporteret [21] som en intern kontrol for PCR-reaktioner.

Menneskelige vævsprøver

Den foreliggende undersøgelse omfattede to separate patientkohorter fra Vanderbilt University Medical center og University of Virginia Medical center (opsummeret i tabel 1). Alle undersøgelser blev udført efter godkendelsen af ​​de interne Boards anmeldelse ved hver af de deltagende institutioner. Hele vævssnit blev fremstillet fra transurethrale endoskopiske tumorresektion prøver fra 18 patienter med lav kvalitet stadium Ta sygdom behandlet ved Vanderbilt University Medical Center. Vævsprøver fra primær tumor prøver stammer fra University of Virginia patient kohorte var repræsenteret på et tidligere beskrevet væv microarray (TMA) [9]. Firdobbelte væv kerner (0,6 mm) af levedygtige tumor blev høstet fra arkiverede zink-formalin-fikseret væv blokke af 167 cystektomi prøver. De oprindelige patologi slides blev gennemgået for at registrere histologiske undertype og kvalitet samt bekræfter patologiske stadium af tumorer. Tumorer blev histologisk ligger på en skala fra 1-4,, med grad 4 som den højeste karakter. 19 patienter, der fik neoadjuvansterapi blev 6 behandlet med strålebehandling, 8 med kemoterapi og resten med kombinationen kemostråleterapi. TMA kohorte omfattede 112 urothelial carcinomer, 21 planocellulært karcinom, 5 primære blære adenokarcinomer, 3 småcellet (high-grade neuroendokrine) carcinomer, en blandet urothelial og skællede karcinom, en adenokarcinom med sarcomatoid foci og 2 urothelial karcinomer med sarcomatoid foci (tabel 1). En yderligere TMA fra University of Virginia bestod af firdobbelte vævskerner (0,6 mm) af lymfeknudemetastaser dissekeret fra 28 patienter, der er repræsenteret i den primære tumor TMA (tabel 1).

Udover tumoren prøver for hvilke der forelå demografiske data som beskrevet i tabel 1, blev arkivering væv bestående af tumor og normal tilstødende væv (NAT) fra 10 patienter, som gennemgik cystektomi for avanceret blærekræft ved Vanderbilt University indsamlet til analyse af FOXA1 og uroplakin. Desuden blev arkivering væv bestående af 21 patienter med ikke-keratiniserende squamous metaplasi identificeret. Af disse 2 patienter havde områder af keratiniserende skællede metaplasi, og 15 patienter havde NAT, der tjente som kontrol.

Immunhistokemi og dobbelt immunofluorescens

Immunhistokemi blev udført som tidligere beskrevet [22], [23]. Kort fortalt blev objektglassene deparaffineret, rehydreret gennem en række graduerede alkoholer og vasket i dobbelt deioniseret vand i 5 minutter. Væv blev derefter anbragt i antigen-demaskering opløsning (Vector Labs, Burlingame, CA) og antigen-genvinding blev udført ved mikrobølger prøver i 20 minutter ved 30% effekt i en 900 watt mikrobølgeovn. Objektglas blev derefter afkølet til stuetemperatur og derefter vasket 3 gange i 10 minutter i PBS (pH 7,4). For immunohistokemi blev alle inkubationer udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med anvendelsen af ​​peroxidase blokerende reagens (Dako Nordamerika, Carpinteria, CA) i 20 minutter, hvorefter snit blev igen vasket i PBS 3 gange i 10 minutter. Tilberedte objektglas blev inkuberet i gedeserum i 30 min for at reducere ikke-specifik antistofbinding. Slides hvor derefter inkuberet natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer med 1:1000 fortyndinger af enten gede polyklonalt FOXA1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA), ged polyklonale FOXA2 (Santa Cruz Biotechnology) eller et pan-uroplakin antistof, AUM [ ,,,0],24] fortyndet 1:5000 i PBS. Objektglas blev derefter vasket 3 gange i 10 minutter med PBS og biotinyleret sekundært antistof fortyndet i PBS blev derefter tilsat. Primært antistof blev visualiseret under anvendelse af Vectastain Elite ABC Peroxidase Kit (Vector Labs) ifølge fabrikantens protokol med DAB i substratbuffer som chromogen (Thermo Scientific, Fremont CA). For FOXA1 og FOXA2 blev objektglassene scoret for tilstedeværelse eller fravær af specifik kernefarvning. Den positive kontrol for FOXA1 var vildtype murint prostatavæv, og den positive kontrol for FOXA2 var prostatavæv fra tidligere beskrevne Probasin-T-antigen //Dominerende aktive beta-catenin bigenic mus [21]. For pan-UPK blev tilstedeværelsen eller fraværet af cytoplasmatisk immunoreaktivitet i tumorceller registreres. Immunfarvning af humane blære væv blev udført for pladeepitelet markør cytokeratin 10 (1:100; Dako, Carpinteria CA), og den basale celle markør cytokeratin 14 (1:200; Dako). Immunofluorescens farvning blev udført på humane blære væv med antistoffer for Ki67 (1:100, Dako, Carpinteria, Californien; klon MIB-1) og FOXA1 (1:100: Santa Cruz)

Stabil cellelinje Generation

efter transfektion af Phoneix pakkeceller, retrovirale partikler blev filtreret og renset, og virale partikler blev anvendt til infektion af RT4 og T24 target blære cellelinier. Efter retroviral infektion blev RT4 celler puromycin udvalgt til stabilt at udtrykke et FOXA1 målrettet shRNA konstrukt resulterer i nedsat FOXA1 ekspression (RT4-FOXA1 KD) eller krypteret shRNA udtrykkende kontrolceller (RT4-SCR) ifølge producentens instruktioner (Origene, Rockville, MD) . Tilsvarende blev T24 celler puromycin udvalgt efter virusinfektion til stabilt udtrykke pLPCX plasmid indeholdende en FOXA1 insert (T24-FOXA1) eller tom vektor (T24-pLPCX). Data fra microarray analyse er beskrevet i dette manuskript vil blive deponeret i en offentligt tilgængelig database i overensstemmelse med MIAME retningslinjer.

Tissue Rekombination Xenografting

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med institutionelle IACUC godkendelse. Isolering af embryoniske blære mesenkym (eBLM), fremstilling af vævs- rekombinanter, og nyre kapsel operationer blev udført som tidligere beskrevet [2]. Gravide rotter (Harlan Laboratories, Tampa FL) blev aflivet på embryonisk dag 16 (E16) (plug dag = 0). Blærer blev derefter mikrodissekeres fra isolerede embryoner, og embryonale blærer blev separeret fra det urogenitale sinus ved blærehalsen og de ledsagende urinlederne omhyggeligt dissekeret. Hele blærer blev derefter placeret i calcium- og magnesium-fri Hanks saltvand (Gibco) indeholdende 25 mM EDTA (Sigma, St. Louis MO) i 90 minutter for at frigøre blæren urothelium. Den mesenkym og urothelium blev adskilt manuelt under mikroskopisk undersøgelse, forlader mesenchyme bag som en blære shell. Halvtreds tusind RT4-Scr-celler og RT4-FOXA1 KD-celler blev resuspenderet i 50 mikroliter af en 03:01 forhold mellem rottehalecollagen og indstilling opløsning, og blev udpladet i 10 cm skåle. Efter indsættelsen af ​​1 eBLM pr alikvot blev væv rekombinanter anbragt ved 37 ° C for at fremme størkning. McCoys modificerede medium (Gibco) indeholdende 10% FBS blev derefter påført størknet transplantater og inkuberet natten over. Den følgende dag blev to væv rekombinanter placeres under nyrekapslen af ​​den venstre nyre af 5 SCID-mus, hvilket resulterede i alt 10 grafts. Tre uger efter implantationen blev mus injiceret med BrdU og aflivet. Dissekerede nyrer indeholdende væv rekombinanter blev fikseret i formalin og underkastet standard behandling som forberedelse til immunohistokemi. Dyreforsøg blev gentaget én gang. målinger tumorvolumen blev udført ved standardmetoder og er repræsenteret som fold tumorvolumen.

Western blotting-analyse

Western blotting-analyse blev udført som tidligere beskrevet [25]. Kort fortalt blev cellelysater fremstillet med fuldstændig lyse-M-kittet (Roche, Nutley NJ) ifølge fremstilling protokol og proteinkoncentrationer blev bestemt via standard BCA-protokol (Pierce, Rockford, IL). Cellelysater (30 ug) blev underkastet elektroforese på en 10% Bis-Tris-geler i 50 minutter ved 200 V. Elektroforetisk overførsel til nylon forstærket nitrocellulosemembraner (Osmonics, Minnetonka, MN) blev udført natten over ved 30 V, efterfulgt af Ponceau- S-farvning (Sigma) for at verificere lig protein lastning og overførsel. Membraner blev blokeret natten over i i 5% fedtfri tørmælk (NFDM), 0,1% Tween 20 (Sigma) i 1X Tris-bufret saltvand. Den følgende dag blev nitrocellulosemembraner inkuberet med gede-anti-FOXA1 (Santa Cruz, 1/1000), anti-E cadherin (BD Biosciences; 1/1000) eller anti beta actin (Sigma; 1/1000) efterfulgt af passende HRP konjugeret sekundært antistof (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) ved en fortynding på 1 /2.000.

krystalviolet vækstassays

Celler (5000 per brønd) blev udpladet i 24 brønd dyrkningsskåle ( Falcon) og fik lov til at binde natten over i McCoys medium indeholdende 10% FBS og 0,5 ug /ml puromycin. Den følgende dag blev dyrkningsmediet aspireret, og cellerne blev fikseret i 11% glutaraldehyd (Sigma) og inkuberet ved stuetemperatur på en orbitalryster indstillet til 500 cykler /min. Celler blev derefter vasket 3 gange ved at nedsænke i deioniseret vand og fik lov at lufttørre og farvet med 0,1% krystalviolet opløst i 200 mM borsyre (Sigma), pH 8,0. Efter inkubation i 20 minutter på en orbitalryster blev overskydende krystalviolet derefter fjernet ved vask i deioniseret vand og fik lov at lufttørre. Krystalvioletfarvning blev efterfølgende opløst i 10% eddikesyre (Sigma), og absorbans blev aflæst ved 590 nm efter baggrundssubtraktion. Crystal violet vækst blev udført i fem dage i tre eksemplarer og gentaget to gange.

In vitro invasion assays

In vitro

invasion assays blev udført som tidligere beskrevet [26]. Falcon cellekultur skær (8 um porer), blev vasket to gange med McCoys medium og efterfølgende overtrukket med 20 ul reduceret vækstfaktor Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes NJ) fortyndet 1:06 og fik lov at størkne i 30 minutter. RT4-Scr, RT4-FOXA1 KD, T24-pLPCX, og T24-FOXA1 (1 × 10

5 /brønd) blev tilsat til individuelle brønde i 200 pi hvis McCoys medium (10% FBS, 0,5 ug /ml puromycin) , og 300 ul af identisk medium blev tilsat til den nederste kammer. Efter 24 og 48 timers inkubation blev mediet aspireret fra det nedre kammer, og invaderede celler blev fikseret i 5% glutaraldehyd opløst i 1 x PBS i 10 minutter ved stuetemperatur, og cellerne blev efterfølgende vasket i deioniseret vand tre gange. Invaderede celler blev farvet ved tilsætning af 0,5% toluidinblåt (Sigma) i 2% natriumcarbonat og inkubering 20 minutter, hvorefter toluidin farvestof og mediet blev aspireret fra det øvre og nedre kammer, henholdsvis. Den nederste kammer blev derefter vasket tre gange med deioniseret vand og ikke-invaderede celler blev fjernet ved at tørre indersiden af ​​det øvre kammer forsigtigt med en vatpind, og invaderede celler blev talt under et 20 x objektiv. Invasion blev udført i tre eksemplarer og gentages to gange.

Statistisk analyse

Foreninger mellem nuklear FOXA1 og FOXA2 farvning og clinicopathologic parametre blev vurderet ved hjælp af standard univariate metoder. FOXA1 og FOXA2 udtryk status blev sammenfattet af tumor fase, nodal status, histologiske type og kvalitet. X2 tests af association blev udført mellem dikotomiseret udtryk værdier og hver patologisk parameter. For FOXA1 udtryk, blev logistisk regression anvendt til at teste prædiktor “tumor stadie” som ordinal variabel med fem kategorier (Ta, T1, T2, T3 og T4). Test af foreningen blev udført både på hele datasættet og delmængde af kun TCC prøver. Statistisk analyse blev udført i SAS 9.2. Alle test blev vurderet ved α = 0,05. Statistisk vurdering af forskelle i tumor volumen mellem RT4-Scrambled og RT4-FOXA1 KD blev udført ved hjælp af standard univariate metoder, med p 0,05 betragtet som signifikant

Resultater

FOXA1 og FOXA2 udtryk er begrænset til. specifikke blære cancer cellelinjer:

i undersøgelser af urinblæren udvikling, blev fundet FOXA1 udtryk nukleare at være begrænset til den urotelial rum og blev opretholdt i voksen urothelium [27]. I modsætning hertil

in situ

hybridisering analyser indikerede udtryk for FOXA2 i den tidlige fosterudvikling [28], mens ingen udtryk var tydelig i senere stadier af urotelial udvikling eller i urinvejene af voksne blærer [27]. Som et indledende skridt i at karakterisere ekspressionen af ​​Foxa familiemedlemmer i blærekræft, vi udførte RT-PCR på de almindeligt anvendte humane blære cancer cellelinjer RT4, T24, J82, 5637, 253J, 253J-BV, UMUC3 og scaber. Interessant er det kun RT4 cellelinien, som oprindeligt blev opformeret fra en brønd differentieret tumor [10], udviste høje FOXA1 ekspression. Derudover blev ekspression af FOXA1 associeret med tilstedeværelsen af ​​UPK transkripter (Fig 1A), hvoraf UPK2 anvendes som en urotelial differentieringsmarkør. 5637 celler også co-udtrykte lave niveauer af FOXA1 og UPK mRNA. T24 celler udtrykte meget lave niveauer af FOXA1 og UPK2, men viste også tegn på FOXA2 ekspression (fig. 1A). Kvantitativ RT-PCR-analyse af scaber celler etableret fra en primær SCC tumor viste, at FOXA1 ekspression var signifikant lavere i disse sammenlignet med RT4 (fig. 1B). Ingen af ​​cellelinierne undersøgte udtrykt FOXA3, en tredje beslægtet medlem af Foxa familien (data ikke vist). Som FOXA1 udtryk var forbundet med UPK i RT4 og 5637 celler, undersøgte vi udtryk for disse markører i humane blærekræft prøver. Ud af 10 prøver med FOXA1 positiv NAT, og FOXA1 negative associeret tumor, 4 tumorer udviste negativ AUM farvning, mens 6 tumorer beholdt AUM farvning (Fig. 1C). Tilsammen indikerer disse resultater, at tab af FOXA1 udtryk er forbundet med nedsat eller fraværende UPK udtryk i udbredte menneskelige blære cancer cellelinjer og i en delmængde af menneskelig blære tumorvæv

A:. Et panel af almindeligt anvendte urothelial cellelinjer blev screenet via traditionel RT-PCR for tilstedeværelsen af ​​FOXA1, FOXA2, og FOXA3 udskrifter, samt medlemmer af uroplakin (UPK) familie. HepG2-celler, som udtrykker hvert medlem af Foxa underfamilien, blev anvendt som positive kontroller (data ikke vist). RT4 celler udviste robust ekspression af FOXA1 og som tidligere rapporteret, UPK familiemedlemmer [20]. FOXA2 ekspression blev påvist i T24 celler, men var ikke korreleret med UPK familiemedlem udtryk. FOXA3 blev ikke detekteret i nogen testet cellelinje (data ikke vist). B: Q-RT-PCR-analyse viser FOXA1 ekspression i SCaBER cellelinie afledt fra en primær SCC og i T24 er betydeligt lavere sammenlignet med RT4. C:Decreased FOXA1 ekspression er forbundet med nedsat UPK ekspression i humant væv. Archival normal tilstødende væv (øverste panel) og muskel invasiv blæretumor blev immunofarvet med en pan-UPK antistof, AUM [24] samt et antistof rettet mod FOXA1. Ud af 10 prøver med FOXA1 positiv NAT, og FOXA1 negative associeret tumor, 4 tumorer udviste negativ AUM farvning.

FOXA1 knockdown i RT4 celler stiger uroplakin udtryk

uroplakin (UPK) familie af gener i mennesker består af UPK1A, UPK1B, UPK2, UPK3A og UPK3B [29]. Selv faldt FOXA1 udtryk syntes at være korreleret med formindsket UPK udtryk i almindeligt anvendte blærekræft cellelinjer, og i et mindretal af de menneskelige cystektomi prøver (Fig 1), AUM antistof, der anvendes til disse undersøgelser anerkender alle medlemmer af uroplakin familien [30] . Endvidere blev det tidligere rapporteret, at knockdown af FOXA1 resulterede i både fald og stigninger i ekspressionen af ​​UPK familiemedlemmer [5]. Derfor var det uklart, om ændret FOXA1 udtryk medført ændringer af de enkelte uroplakin familiemedlemmer. Som RT4 celler udtrykker FOXA1 og hvert medlem af UPK familien (figur 1), brugte vi en shRNA tilgang til ingeniør stabile RT4 celler med nedsat FOXA1 udtryk for at fastslå virkningen af ​​FOXA1 lyddæmpning på UPK udtryk (figur 2). Interessant, microarray undersøgelser udført på RT4-Scr og RT4-FOXA1 KD angivet FOXA1 KD var forbundet med øget UPK familiemedlem udtryk. Kvantitative RT-PCR undersøgelser af RT4-SCR og RT4-FOXA1 KD celler valideret denne observation, der viser, at FOXA1 KD medført betydelige stigninger i ekspressionen af ​​UPK1B, UPK2, UPK3A, og UPK3B (fig 2C-F). Selv FOXA1 og UPK går tabt i de fleste cellelinjer, der er etableret af høj kvalitet, MI tumorer og i en delmængde af humane cystectomy prøver, FOXA1 KD i RT4 celler resulterer i signifikant forøget UPK familiemedlem udtryk

in vitro

A:. Stabil knockdown af FOXA1 i humane RT4 blærekræft celler (se figur 6 for FOXA1 protein niveauer efter knockdown i RT4). B: Der blev ikke fundet signifikante ændringer i UPK1A efter FOXA1 KD. (CF): mRNA-niveauer af UPK1B, UPK2, UPK3A, og UPK3B blev øget betydeligt efter FOXA1 knockdown

Tab af FOXA1 udtryk er forbundet med fremskreden tumor stadie og høj histologiske kvalitet

for at bestemme omfanget af FOXA1 og FOXA2 udtryk i forskellige stadier af blærekræft, vi udførte immunhistokemisk analyse af humane tumorprøver (fig. 3). Forekomsten af ​​FOXA1 ekspression faldt med stigende tumor fase (tabel 2). FOXA1 blev ensartet udtryk i fase Ta blæretumorer, sammenlignet med kun 67% af fase T1 tumorer, 59% af fase T2 kræftformer, 42% af scenen T3 tumorer, og 34% etape T4 neoplasmer. Logistisk regressionsanalyse viste, at tab af FOXA1 udtryk var signifikant forbundet med stigende tumor stadie (p 0,001). Tab af FOXA1 udtryk forekom også i tumorer i højere histologisk bedømmelse (p 0,001; tabel 2). FOXA1 var også negativ oftere i tumorer fra kvindelige patienter. Men denne forening ikke nåede statistisk signifikans efter normalisering til tumor scenen og bedømmelse (p = 0,096). FOXA2 blev ikke påvist i Ta fase tumorer og var kun til stede i 12% af højere stadie kræftformer. Der var ingen signifikante sammenhænge mellem FOXA2 udtryk og tumor stadie eller histologisk klasse.

AJCC etape Ta, T1, T2, T3 og T4 blæretumorer blev immunfarvet for FOXA1 og FOXA2. Repræsentative tilfælde er illustreret i top paneler. Tis område er afbildet i en patient diagnosticeret med AJCC T1 stadium blære tumor. Foreningen mellem tab af FOXA1 udtryk og stigende etape blev bekræftet ved logistisk regression (nederste panel, s 0,001). En lille delmængde af invasive tumorer udstillet nukleare udtryk for FOXA2.

FOXA1 udtryk er reduceret betydeligt i keratiniserende skællede metaplasi og planocellulært karcinom i urinblæren

De fleste af blære kræft er histologisk identificeret som UCC. SCC er den næste mest almindelige histologiske variant af blærekræft. En anerkendt forløber for SCC er udviklingen af ​​keratiniserende squamøs metaplasi (KSM). KSM adskiller sig fra ikke-KSM, hvilket er en forholdsvis almindelig og godartet. Som prognosen for patienter med nonbilharzial SCC i urinblæren er især alvorlig [31] sammenlignede vi FOXA1 ekspression i KSM, ikke-KSM og SCC. Histologisk analyse viste, at mens FOXA1 blev udtrykt i ikke-KSM (fig. 4A, indpresningsdybde, venstre panel), og overlappet med ekspression af CK14 positive basale celler, blev FOXA1 ikke udtrykkes i KSM (fig. 4A) eller de fleste af SCC (Fig . 4B). FOXA1 ekspression blev tabt i 81% af SCC prøver (Fig 4B.) Sammenlignet med 40% af UCC i blæren (Fishers eksakte test, p 0,001) (tabel 3). Mens størstedelen af ​​SCC er diagnosticeret på et relativt avanceret tumor stadie, sammenhængen mellem SCC og FOXA1 tab forblev signifikant (p = 0,0043), selv efter justering for tumor fase. Desuden FOXA1 farvning af en TMA bestående af metastatiske tumorer indlån fra positive lymfeknuder dissekeret fra 28 patienter, der er repræsenteret i den primære tumor TMA (fig. 4C) afslørede en yderligere sammenhæng mellem FOXA1 tab og SCC. Ud af de oprindelige 28 sager, tilstrækkelig væv til analyse forblev i kun 22 prøver. Fem tilfælde af lymfeknudemetastaser (23%) var negative for FOXA1 ekspression. Tre ud af 5 FOXA1-negative lymfeknuder (60%) blev dissekeret fra patienter diagnosticeret med primær SCC. Af disse blev 2 (en etape T4 og en etape T2) tilpasset FOXA1-negative primære tumorer blev en matches til en scene T3 primær tumor med tab af FOXA1 udtryk. De resterende 2 FOXA1-negative lymfeknudemetastaser blev dissekeret fra patienter diagnosticeret med stadium T3 TCC og småcellet carcinom, som begge var negative for FOXA1 ekspression

(A) H &. E og immunfarvning af ikke-keratiniserende al.