PLoS ONE: CRISPR /Cas9n-medieret Sletning af sneglen 1Gene (SNAI1) Afslører Dens rolle i reguleringen af ​​Cell Morfologi, celle-celle-interaktioner, og genekspression i kræft i æggestokkene (RMG-1) Celler

Abstrakte

Snail1 er en transskription faktor, der inducerer epitelial til mesenkymale overgang (EMT). Under EMT, epitelceller mister deres kryds, omlægge deres cytoskelet, og omprogrammere genekspression. Selvom Snail1 er en fremtrædende repressor af E-cadherin transkription, er de præcise roller i hver af fænomenerne EMT ikke helt forstået, især i cytoskeletændringer. Tidligere undersøgelser har anvendt gen knockdown systemer til at bestemme funktionerne af Snail1. Imidlertid er ufuldstændig protein knockdown ofte forbundet med disse systemer, som kan forårsage fejlagtig fortolkning af data. Til mere præcist at vurdere funktioner Snail1, genereret vi en stabil cellelinje med en målrettet ablation af Snail1 (Snail1 KO) ved hjælp af CRISPR /Cas9n system. Snail1 KO-celler udviser øget celle-celle-adhæsion, nedsat celle-substrat-adhæsion og cellemigration, ændringer i deres cytoskeletorganisation der omfatter få stress fibre og rigelige kortikal actin, og opregulering af epitel- markørgener såsom E-cadherin, occludin, og claudin -1. Imidlertid blev morfologiske ændringer induceret ved behandling af Snail1 KO-celler med TGF-beta. Andre transkriptionsfaktorer, der inducerer EMT blev også induceret ved behandling med TGF-beta. Den præcise sletning af Snail1 af CRISPR /Cas9n system giver klare beviser for, at tabet af Snail1 forårsager ændringer i actincytoskelettet falder celle-substrat vedhæftning, og øger celle-celle-adhæsion. Behandling af RMG1 celler med TGF-beta tyder redundans blandt de transkriptionsfaktorer, der inducerer EMT

Henvisning:. Haraguchi M, Sato M, Ozawa M (2015) CRISPR /Cas9n-medieret Sletning af sneglen 1Gene (

SNAI1

) afslører sin rolle i reguleringen af ​​Cell Morfologi, celle-celle-interaktioner, og genekspression i kræft i æggestokkene (RMG-1) Cells. PLoS ONE 10 (7): e0132260. doi: 10,1371 /journal.pone.0132260

Redaktør: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, UNITED STATES

Modtaget: December 20, 2014 Accepteret: 11 Jun 2015; Udgivet: 10. juli 2015

Copyright: © 2015 Haraguchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. Grant nummer: 22590287 til MH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) er en almindelig proces, der forekommer under udviklingen, sårheling og cancermetastase. Under EMT, epitelceller mister deres kryds, ændre deres form, omlægge deres cytoskelet, og omprogrammere genekspression [1]. Denne ændring i genekspression induceres af flere master-regulatorer, herunder Snail1, TWIST og zink-finger E-box binding (ZEB) transkriptionsfaktorer. Deres bidrag til induktion af EMT afhænge af celletypen og signalvejen der initierer EMT. De styrer ofte ekspressionen af ​​hinanden og funktionelt samarbejde på målgener [1]. EMT reguleres af signalveje medieret af multiple cytokiner, herunder Wnt, Notch og transformerende vækstfaktor (TGF) -beta [2]. TGF-beta signalvej har en dominerende rolle blandt dem [1]. Efter induktion af EMT af TGF-beta, er transkriptionsfaktorer, såsom Snail1 opreguleret [3]. Snail1 rolle i EMT er blevet grundigt undersøgt. Snail1 er en stærk repressor af epiteliale markører, såsom E-cadherin, de claudins og occludins. På den anden side, Snail1 øger ekspressionen af ​​mesenchymale markører såsom vimentin og fibronectin [4], [5]. Vi har bekræftet, at Snail1 regulerer celle-matrix adhæsion via sin regulering af ekspressionen af ​​integrin og basalmembranproteiner såsom lamininer [6]. Snail1 er primært tænkt at inducere EMT gennem direkte undertrykkelse af E-cadherin, hvilket fører til nuklear beta-catenin translokation og yderligere ændringer i transkription [7]. Snail1 genekspression er rapporteret at inducere ændringer i celleform og bevægelser [5]. Disse ændringer kræver ændringer i actin organisation. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der styrer F-actin dynamik under EMT ikke fuldt forstået [1]. For nylig McGrail undersøgte rolle Snail1 i cytoskeletale reformationen og aktin dynamik. De undersøgte virkningen af ​​Snail1 på ekspressionen af ​​actin-cytoskeleton gener [8]. Vi forsøgte også at afklare virkningen af ​​Snail1 på celle form og actin kropsbygning ved at slette Snail1 fra RMG1 celler.

Funktionen af ​​Snail1 er blevet evalueret i flere typer af kræftceller ved brug af RNA-interferens (RNAi) [9]. Imidlertid knockdown af målgenekspression af RNAi er ufuldstændig og midlertidig [10]. For at bestemme den præcise rolle Snail1 under induktion af EMT, har vi ansat en ny genom redigering system kaldet “klynger Regelmæssigt indbyrdes afstand Short palindrom Gentager (CRISPR) /CRISPR-associerede 9 (Cas9)” The CRISPR /Cas9 system består af to komponenter : den Cas9 proteinet og en guide RNA (gRNA). Den Cas9 protein har nukleaseaktivitet og kan inducere dobbeltstrengede pauser (DSBs) i enhver genomisk DNA-sekvens styret af en gRNA, forudsat at der eksisterer en protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens i mållocuset [11]. I mangel af en reparation skabelon, ligeres gennem en ikke-homolog endesammenbinding proces, som forårsager små insertion eller deletion mutationer kendt som indels. Således CRISPR /Cas9 muliggør specifik genomisk forstyrrelser [12]. Nylige undersøgelser har vist, at CRISPR /Cas9 kan være meget aktive på humane celler, selv med ufuldstændigt matchede RNA-DNA grænseflader. Derfor kan CRISPR /Cas9 systemet inducere højfrekvente off-target mutagenese i humane celler [13]. At undgå off-target mutagenese, Ran et al [14] udviklet en strategi, der kombinerer aspartae-til alanin (D10A) mutant nickase version af Cas9 (Cas9n) med et par offset gRNAs komplementære til modsatte strenge af målområdet. Cas9n nicks DNA til opnåelse enkeltstrengede brud. Disse pauser er fortrinsvis repareret gennem homologi-dirigeret reparation, hvilket nedsætter hyppigheden af ​​uønskede InDel mutationer afledt af ikke-target DSBs [12]. Når Cas9n kombineres med et par gRNAs, dobbelt nicking forårsager DSBs på kun den genomiske loci, hvor begge gRNAs binder i en passende afstand. Dette øger effektivt specificitet målet anerkendelse. Denne dobbelte huldannelse systemet er rapporteret at reducere off-target-aktivitet ved 50- til 1500-fold i cellelinier [14].

I denne undersøgelse anvendte vi CRISPR /Cas9n systemet til specifikt at blokere Snail1 ekspression i humane æggestokkene adenocarcinom (RMG-1) celler [15] og bestemmes effekten af ​​denne Snail knockout (KO) på celle morfologi og funktion, samt TGF-beta-induceret EMT.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Forsøg med rekombinant DNA-teknologi blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Kagoshima University Udvalg for rekombinant DNA. Sikkerheden godkendelsesnummer er 26005.

cellelinje og kultur

Menneskelig æggestokkene mesonephroid adenocarcinom cellelinje RMG1 [15] blev opnået fra JCRB (japansk Indsamling af Research Bioressourcer, Osaka) Cell Bank og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Nissui, Tokyo) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Nichirei Biosciences, Inc. Tokyo).

Antistoffer og reagenser

mus monoklonale antistoffer (mAbs) mod human E-cadherin (klon 36, BD Biosciences, San Jose, CA), human Snail1 (klon L7042, Cell Signaling, Danvers, MA), human vimentin (klon V9, Zymed, Carlsbad, CA), human vinculin (klon hVIN-1, Sigma, St. Louis, MO), human vitronectin (klon 342.603, R halvdelen blev underkastet formering og den anden halvdel blev anvendt til at vurdere ekspressionen af ​​Snail1 anvendelse af Western blotting. Fem kloner viste en signifikant reduktion i Snail1 ekspression. Derfor blev genomiske DNA’er fra disse kloner isoleret. DNA-fragmenter (182 bp i størrelse), der dækkede gRNA målregioner blev amplificeret under anvendelse af PCR. Primere -57F (5′-GAGTGGTTCTTCTGCGCTAC-3 ‘) og 125R (5’CCCACGCAGCCTTCGCCTGT-3’) blev anvendt til PCR. PCR-produkter blev verificeret ved hjælp af gelelektroforese, oprenset ved anvendelse af QIAquick Gel Extraction kit (Quiagen, Hilden Tyskland), og gælder sekventeret for at detektere deletionsmutation. PCR-produkter fra 5 kloner indeholdt deletionsmutationer. At bekræfte, om disse kolonier har mutationer i begge alleler (såkaldte bi-allele KO), disse PCR produkter blev sub-klonet ind i pGEM-T Easy-vektoren (Promega Fitchburg, WI) og amplificeret i en bakterievært; derefter plasmid DNA fra enkelte kolonier blev sekventeret.

Transfektion af Snail1 KO celler med Snail1 (rescue eksperiment)

Snail1 KO-celler (2 × 10

5) blev transficeret med 2,5 pg af HA-mærket humant Snail1 plasmid (pCAGGS-Snail1 HA) under anvendelse af Lipofectamine 2000 eller polyethylenimin max (Polysciences Inc, Warrington, PA). Vi var i stand til forbigående transficere Snail1 KO celler med Snail1, men vi var ude af stand til stabilt transfektion Snail1 KO celler med Snail1.

Western blotting

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet, med mindre modifikationer [6]. Celler blev kogt i 5 minutter i natriumdodecylsulfat (SDS) gel prøvebuffer. Identiske mængder protein blev separeret ved 10% polyacrylamidgelelektroforese, og blev overført til nitrocellulosemembraner (Whatman Protran BA83, 0,2 um, GE Healthcare, Wauwatosa WI). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (TBS), og blev derefter inkuberet med specifikke primære antistoffer (1: 1000) natten over. Dette blev efterfulgt af behandling med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer. Efter vask med TBS, blev proteinbånd visualiseret ved forøget kemiluminescens (ECL) (PRN 2106, GE Healthcare, Wauwatosa WI).

Immunfluorescensfarvning

Celler blev dyrket på dækglas i 48 timer og fast med 3% paraformaldehyd i phosphatbufret saltvand (PBS) (-) i 30 minutter ved stuetemperatur. Cytoskelettet blev visualiseret ved farvning med rhodamin X-konjugeret phalloidine i PBS (-) indeholdende 0,1% Triton X-100 i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev analyseret under anvendelse af et konfokalt laserscanningsmikroskop (Carl Zeiss LSM700).

RNA-isolering og real-time PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af ISOGEN II (Wako, Osaka) og reverse transskriberet hjælp ReverTra Ace revers transkriptase (Toyobo, Osaka). Den resulterende cDNA blev underkastet kvantitative RT-PCR (QRT-PCR) under anvendelse Syber premix Ex Taq (PR820, Takara Bio, Ohtsu). QRT-PCR blev udført under anvendelse af Step One Plus Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, Fostercity, CA). Ekspressionsniveauer blev kvantificeret ved hjælp af ΔΔCt metoden med

GAPDH

som kalibratoren. De anvendte primere i denne analyse er anført i tabel 1.

Attachment assay

Fastgørelsen assay blev udført som tidligere beskrevet, med mindre modifikationer [6]. Celler blev vasket og inkuberet med 0,125% trypsin-0,01% EDTA i 10 minutter ved stuetemperatur. De løsnede celler blev opsamlet og suspenderet i DMEM suppleret med 10% FCS. Celler (1,5 x 10

4) blev podet i ikke-overtrukne plader med 96 brønde eller plader med 96 brønde, der var blevet præ-inkuberet med DMEM indeholdende 10% FCS. Det samme antal celler blev podet i plader med 96 brønde, der blev præ-coatet med poly-lysin til normalisering. Efter 4 timers inkubation blev ikke-adhærente celler fjernet ved vask og adhærerende celler blev fikseret med 70% ethanol i 20 min. Efter farvning med en 0,1% opløsning af krystalviolet i PBS i 30 min blev cellerne skyllet og derefter opløst ved anvendelse af 0,5% Triton X-100 i PBS. Den optiske densitet af de opløste celler blev målt ved 595 nm. Antallet af vedlagte celle blev beregnet ved anvendelse af en standardkurve (celleantal versus absorbansværdier). Forholdet mellem vedhæftede celler blev udtrykt som antallet af vedhæftede celler i ikke-overtrukne eller præinkuberet brønde divideret med dem i poly-lysin coatede brønde.

Scattering assay

Spredningen assayet var udført som tidligere beskrevet, med mindre modifikationer [17]. Celler blev vasket og inkuberet med 0,125% trypsin-0,01% EDTA i 10 minutter ved stuetemperatur. De løsnede celler blev opsamlet og suspenderet i DMEM suppleret 10% FCS. Celler (1,5 x 10

4) blev podet i plader med 96 brønde. Efter 72 h inkubation blev celle spredning undersøgt ved anvendelse af fasekontrastmikroskopi. Celle spredning blev kvantificeret ved at tælle antallet af isolerede celler fra kolonier i tilfældigt valgte fase-kontrast. Det relative antal spredning blev vurderet ved at dividere antallet af spredning celler afledt af Snail1 KO1 eller fra Snail1 KO1 + Snail1 celler med antallet af spredning celler afledt fra vildtype (WT) celler.

Dissociation assay

dissociation assay blev udført som tidligere beskrevet, med mindre modifikationer [18]. Celler (5 x 10

4) blev podet i plader med 24 brønde og dyrket i DMEM med eller uden TGF-beta. Efter at have nået konfluens blev cellerne vasket og inkuberet med 0,125% trypsin eller 0,125% trypsin-0,01% EDTA i 10 minutter ved 37 ° C. Løsnede celler blev omhyggeligt vasket med PBS (-) og udsat for mekanisk belastning ved pipettering med en 1 ml pipette fem gange. Cellefragmenter blev fikseret med 3% paraformaldehyd i 20 minutter og farvet med krystalviolet (Sigma-Aldrich, St. Louis MO). Efter omhyggelig vask, blev antallet af partikler pr felt tælles (mindst fem forskellige områder). Det relative antal partikler er repræsenteret ved antallet af fragmenterede celle partikler fra den angivne celletype divideret med antallet af fragmenterede cellepartikler afledt fra WT-celler dyrket uden TGF-beta.

Migration assay

migrationen assay blev udført som tidligere beskrevet, med mindre modifikationer [6]. Migration assays blev udført i Transwell kamre med en 8 um porestørrelse (Corning, 3422, Tewksbury MA). Kort beskrevet blev 0,1 ml celler (4 x 10

5 celler /ml) i DMEM suppleret med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) blev podet i de øvre brønde. I de lavere brønde, 0,6 ml DMEM suppleret med 0,1% BSA indeholdende 2,5% FCS blev tilsat. Efter 4 timers inkubation blev de ikke-migrerende celler på den øvre overflade af membranen fuldstændigt skrubbes og 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (slutkoncentration 0,5 mg /ml) blev tilsat til de nedre brønde og inkuberet i 3 timer. De migrerende celler fastgjort til den nederste overflade af membranen dannede blå pletter indeholdende formazan. Disse pletter blev fotograferet og talt. Det relative antal af migrerede celler er repræsenteret ved antallet af migrerede celler af den angivne celletype divideret med antallet af migrerede WT celler dyrket uden TGF-beta.

Statistiske analyser

Statistiske analyser af uafhængige prøver blev udført ved anvendelse af t-test. Data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. To niveauer af statistisk signifikans er angivet med stjerner (**

P

0,05 og *

P

0,01).

Resultater

Generation af Snail1 KO celler ved hjælp af CRISPR /Cas9n systemet

for at bestemme roller Snail1 under induktion af EMT, vi brugte CRISPR /Cas9n system til at generere stabile RMG1 cellelinjer udviser ablation af genet, der koder for Snail1. RMG1 celler blev co-transficeret med pX335-Cas9-g snail1 1, som har udført target 1 sekvens, pX335-Cas9-g snail1 2, som har udført target 2 sekvens, (Fig 1A) og pEGF-N1, som gennemførte en G418-resistens markør. Ca. 50 kolonier blev analyseret efter G418-selektion. Halvdelen af ​​cellerne i hver koloni blev lyseret, og derefter lysatet blev anvendt til at vurdere Snail1 ekspression ved Western blotting. Fem kloner viste en signifikant reduktion i sneglen ekspression. Derfor blev genomisk DNA isoleret fra hver af disse kloner. DNA-fragmenter omfatter både gRNA målregioner blev forstærket og de resulterende PCR-produkter blev udsat for direkte sekventering. Hvert af disse PCR-produkter havde deletionsmutationer. At kontrollere, om begge alleler havde deletionsmutationer blev PCR-produkter klones ind i en pGEM-T-vektor og amplificeret i en bakteriel vært. Plasmid DNA isoleret fra flere kolonier forbindelse med hver enkelt PCR-produkt blev sekventeret. To kloner udviste 24 bp deletioner i begge alleler (fig 1B og 1C). Vi har udpeget disse kloner Snail1 KO1 og Snail1 Ko2. Hver af de resterende tre kloner indeholdt en WT allel. Fordi Snail1 KO 1 og Snail1 Ko2 havde samme sletning, vi brugte Snail1 KO 1 celler i de følgende forsøg. Fraværet af Snail1 ekspression i Snail1 KO 1-celler blev bekræftet ved kvantitativ realtids-PCR (Fig 2B) og western blotting (fig 2C).

(A) Repræsentative billeder der viser cellemorfologien af ​​vildtype ( WT) RMG celler (I), Snail1 KO1 celler (II). Celler visualiseret ved fasekontrastmikroskopi. Scale bar indikerer 50 um. WT celler udviste brostensbelagte-lignende morfologier, mens de fleste af de Snail1 KO1 cellerne udviser en mere afrundet morfologi. Repræsentative billeder af actin cytoskelet af WT-celler (III) Snail1 KO1 celler (IV) farvet med rhodamin X-konjugeret phalloidine og fremkaldes med et konfokalt laserscanningsmikroskop (Zeiss LSM700). Billeder af 5 til 10 billeder pr prøve blev taget. Forsøg blev gentaget 5 gange. WT celler er rige på stress fibre, hvorimod Snail1 KO1 celler har knappe stress fibre, men kortikal actin på deres celleoverflader. Scale bar indikerer 20 um. (B) Kvantitativ RT-PCR af angivne gener i vildtype (WT) RMG celler, Snail1 KO1 celler og Snail1 KO1 celler transient transficeret med en Snail1 ekspressionsvektor (Snail1 KO1 + Snail1 celler). Værdier er udtrykt som middelværdi ± sem af tredobbelte prøver. Forsøg blev gentaget tre gange. Statistisk signifikans er angivet med en stjerne (*

P

0,05 og **

P

0,01 hjælp Students ‘

t

-test). Snail1 KO1 celler viste et fuldstændigt tab af Snail ekspression og forøget ekspression af

E-cadherin

,

claudin-1

,

occludin

,

beta-actin

og

alpha-tubulin

, samt nedsat udtryk for

integrin alpha 5 fotos. Forbigående udtryk for Snail1 i Snail1 KO celler vendt disse effekter, bortset fra stigningen i

occludin

udtryk. (C) Western blot-analyse af angivne proteiner i vildtype (WT) RMG celler, Snail1 KO1 celler og Snail1 KO1 celler transient transficeret med en Snail1 ekspressionsvektor (Snail1 KO1 + Snail1 celler). Snail1 KO1 celler viste et fuldstændigt tab af Snail1 ekspression og en stigning i E-cadherin, occludin og claudin-1, beta-actin, alfa tubulin, samt en reduceret i integrin alpha 5-ekspression. Transient ekspression af Snail1 i Snail1 KO-celler vendt disse virkninger, bortset fra den faldt i integrin alpha 5-ekspression. Vinculin blev anvendt som en loading kontrol. Forsøg blev gentaget tre gange.

Ablation af Snail1 genet ændrer morfologi og genekspression i RMG1 celler

Wild-type RMG1 celler udviste brosten-lignende morfologier (fig 2A-2I, S1 fig-i), mens de fleste af de Snail1 KO celler udviste en mere afrundet morfologi (fig 2A-II, S1 fig-II). Fordi cytoskeletorganisation er kendt for at være direkte forbundet med cellemorfologi undersøgte vi lokalisering af actincytoskelettet hjælp rhodamin X-konjugeret phalloidin. WT celler viste actin stress fibre i deres cytoplasmaer (fig 2A-III, S1 Fig-III). I modsætning hertil cortical actin af Snail1 KO celler viste en tyk, afrundet form (fig 2A-IV, S1 Fig-IV). Snail1 undertrykker ekspressionen af ​​epitel markører, såsom E-cadherin, claudin-1 og occludin [19]. Analyse ved hjælp af QRT-PCR afslørede, at Snail1 KO1 celler udviste forøget ekspression af

E-cadherin

,

claudin-1

,

og occludin

. For at udføre en redning forsøg blev en Snail1 ekspressionsvektor introduceret i Snail1 KO1 celler. Fordi vi ikke kunne få en transfektant der udviste stabil ekspression af Snail1, vi brugte forbigående transfektanter af Snail1 (Sanil1 KO1 + Snail1) som kilde af reddede Snail KO1 celler. Snail1 KO 1 + Snail1 celler viste reduceret ekspression af

E-cadherin og claudin-1 Hotel (Fig 2B) Western blotting eksperimenter støttede også disse resultater. Ekspressionen af ​​E-cadherin, claudin-1 og occludin var forøget i fravær af Snail1 ekspression. Transient transficeret Snail1 i Snail1 KO1 celler understøttede reduceret ekspression af E-cadherin og claudin-1 og occludin (fig 2C). Omvendt blev ekspression af integrin alpha 5 reduceret i Snail1 KO-celler (Fig 2B og 2C). Det er bemærkelsesværdigt, at ekspressionen af ​​beta-actin blev påvirket af tilstedeværelsen eller fraværet af Snail1 protein (Fig 2B og 2C).

Ablation af sneglen genet forårsager ændring i celle-substrat-adhæsion, celle spredning, celle dissociation, og celle migration

Fordi blev observeret reduceret ekspression af integrin alpha 5 i Snail1 KO1 celler, antog vi, at celle-substrat vedhæftning kan være nedsat i disse celler. Viste nemlig, Snail1 KO1 celler signifikant reduceret celle-substrat-adhæsion sammenlignet med WT-celler (Fig 3A og 3B sort søjle). Således sletning af Snail1 i RMG1 celler reduceret celle-substrat vedhæftning. Der er en anden mulighed; at reduktionen af ​​celle-substrat vedhæftning i snail1 KO1 celler kan skyldes reduktion af ECM deposition. Derfor har vi præinkuberet brøndene med serumholdigt medium for at tillade vitonectin /fibronectin at adsorbere til brøndene, og igen undersøgt celle-substrat-adhæsion. Denne behandling næsten reddet reduktionen af ​​celle-substrat-adhæsion set med Snail1 KO1 celler. Ca. 30,6% af WT-celler og 28,9% af Snail1 KO1 celler blev bundet til brønde præinkuberet med serumholdigt medium (fig 3B grå søjle). Derfor undersøgte vi ekspressionen af ​​vitronectin og fibronectin. Mod forventning har Snail1 KO1 celler ikke udvise reduceret ekspression af disse proteiner (Fig 2B og 2C).

(A) Repræsentative billeder af substrat adhæsion af vildtype (WT) RMG1 celler (I), Snail1 KO1 celler (II) og Snail1 KO celler transient transficeret med en Snail1 ekspressionsvektor (Snail1 KO1 + Snail1 celler) (III) 4h efter podning i ikke-coatede brønde. (B) Bestemmelse af forholdet mellem bundne celler repræsenteret ved antallet af fastgørelse celler til ikke-coatede brønde (sort kolonne) eller på præcoatede med DMEM indeholdende FCS (grå søjle) divideret med antallet fastgørelse til præcoatede med poly-lysin . Værdier er udtrykt som middelværdi ± sem af tredobbelte prøver. Forsøg blev gentaget tre gange. (C) Repræsentative billeder af spredende celler fra WT (I), Snail1 KO1 (II) og Snail1 KO1 + Snail1 (III) celler 72 timer efter podning. (D) Bestemmelse af det relative antal af spredende celler repræsenteret ved antallet af isolerede celler fra kolonierne af hver type celler divideret med antallet af isolerede celler fra kolonier af WT-celler. Værdier er udtrykt som middelværdi ± sem fem billeder per prøve. Forsøg blev gentaget fire gange. (E) Repræsentative billeder af celledissociering blandt WT celler (I), Snail1 KO1 celler (II) og Snail1 KO1 + Snail1 (III) celler. (F) Bestemmelse af det relative antal af fragmenterede partikler, præsenteret som antallet af fragmenterede partikler af hver type celler divideret med antallet af fragmenterede partikler af WT-celler. Værdier er udtrykt som middelværdi ± sem af 5-10 billeder pr prøve. Forsøg blev gentaget to gange. (G) Repræsentative billeder af WT-celler (I), Snail1 KO1 celler (II) og Snail1 KO + Snail1 (III) celler, som migrerede til de nedre overflader af Transwell membraner. (H) Bestemmelse af det relative antal af migrerede celler, præsenteret som antallet af migrerede celler af hver type celler divideret med antallet af migrerede WT celler. Værdier er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. fem billeder per prøve. Forsøg blev gentaget tre gange. Statistisk signifikans er angivet med en stjerne (*

P

0,05 og **

P

0,01 hjælp Students ‘

t

-test).

Snail1 er blevet rapporteret at spille en rolle i celle-spredning [20], så vi undersøgte spredning aktivitet Snail1 KO1 celler. Faktisk 72 timer efter podning, WT-celler viste talrige spredende kolonier (fig 3C-I og 3D). I modsætning hertil viste Snail1 KO1 celler en signifikant lavere antal spredende kolonier (Fig 3C-II og 3D). Snail1 KO1 celler transficeret med Snail1 genvundet spredningen aktivitet (Fig 3C-III og 3D). Således sletning af Snail1 i RMG1 celler reduceret celle spredning aktivitet.

Snail1 regulerer celleadhæsion [5], så vi antog, at celle-celle adhæsion kan forstærkes i Snail1 KO1 celler. For at teste denne mulighed, vi udførte en dissociation assay at undersøge epitelial ark integritet Snail1 KO1 celler. Behandling med trypsin-EDTA tillod WT celler at løsne sig fra retter som små partikler af celler. Disse partikler dissocieret fuldstændigt efter pipettering (fig 3E-I og 3F). I modsætning hertil blev Snail1 KO1 celler fritliggende i store plader, der var resistente over for pipettering-baserede mekanisk dissociation (fig 3E-II og 3F) Transfektion af Snail1 KO1 celler med Snail1 førte til delvis tilbagebetaling af dissociation aktivitet (Fig 3E-III og 3F ). Således sletning af Snail1 i RMG1 celler øget celle-celle adhæsion.

Snail1 øger celle migration [6], så vi brugte en transwell assay til at vurdere migreringen af ​​Snail1 KO1 celler. Sammenlignet med WT celler blev migreringen af ​​Snail1 KO1 celler mod FCS betydeligt undertrykt. Transfektion af Snail1 KO1 celler med Snail1 førte til delvis tilbagebetaling af migration aktivitet (Fig 3G og 3H). Således sletning af Snail1 i RMG1 celler reduceret cellemigration aktivitet.

Tab af Snail1 ikke hindre TGF-beta-induceret ændring af morfologi og genekspression

TGF-beta inducerer ekspression af Snail1 [3] og Snail styrer TGF-beta lydhørhed [21]. Derfor antog vi, at TGF-beta-induceret EMT kan blive hæmmet i fravær af Snail1 udtryk. Faktisk som blev vist i TGF-beta behandlede WT celler (Fig 4A-I, II), behandling af Snail1 KO1 celler med TGF-beta inducerede morfologiske ændringer (figur 4A-III, IV). TGF-beta behandling resulterede også i reduceret ekspression af E-cadherin i Snail1 KO1 celler (Fig 4B og 4C). Angivelse af andre EMT-relaterede transkriptionsfaktorer, såsom

ZEB1 og TWIST

, steg i Snail1 KO1 celler sammenlignet med WT celler, og blev yderligere forstærket af TGF-beta behandling (Fig 4B). Disse faktorer kan bidrage til de observerede morfologiske ændringer og ændringer af genekspression.

Scale bar indikerer 100 um. Billeder blev taget på 5-10 billeder pr prøve. Forsøg blev gentaget tre gange. (B) Kvantitativ RT-PCR vurdering af cellerne, der er vist i (A) for de angivne gener. Værdier er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. af tredobbelte prøver. Forsøg blev gentaget to gange. Statistisk signifikans er angivet med en stjerne (*

P

0,05 og **

P

0,01 hjælp Students ‘

t

-test). (C) Western blot-analyse af cellerne, der er vist i (A) for de angivne proteiner. Vinculin blev anvendt som en loading kontrol.