PLoS ONE: den prognostiske betydning af kræft-associerede fibroblaster i esophageal pladecellecarcinom

Abstrakt

Baggrund

Cancer-associerede fibroblaster (CAF) aktiveres fibroblaster i kræft stroma og spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft. Nogle rapporter har indikeret sammenhængen mellem ekspression af CAF markører og negativ prognose i flere kræftformer. Imidlertid har ingen rapporter studeret CAF fænotype og dens kliniske relevans i esophageal planocellulært karcinom (ESCC).

Metoder

Vi undersøgte CAF fænotype af ESCC baseret på histologi og immunohistokemiske udtryk for fem CAF markører såsom fibroblast aktiverede protein (FAP), glatmuskelactin (SMA), fibroblast-specifikke protein-1 (FSP1), blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGFRα), og PDGFRβ i 116 ESCC vævsprøver. Desuden har vi også undersøgt korrelationen af ​​CAF fænotype med klinisk relevans samt andre kræft-microenvironment relaterede faktorer

Resultater

Histologisk umoden CAF fænotype var korreleret med dårlig prognose (p. 0,001 ) og forbundet med øget mikrokar tæthed, øget tumorassocierede makrofager, og epitelial til mesenkymale overgang. CAF markører karakteristisk udtrykt i stromal fibroblast tæt på tumorceller og ekspressionsmønsteret af 5 CAF markører var stærkt heterogen i hvert enkelte tilfælde. Af fem CAF markører, SMA, FSP1, og PDGFRα var ugunstige prognostiske indikatorer for ESCC. Antallet af positive CAF markører var større i ESCC med umodne CAF end i dem med modne dem.

Konklusioner

Vores resultater viser, at histologisk klassifikation af CAF fænotype er en pålidelig og betydelig prognostisk indikator i ESCC. CAF markører har potentiale til at være diagnostiske og terapeutiske mål i ESCC

Henvisning:. Ha SY, Yeo S-Y, Xuan Y-h, Kim S-H (2014) den prognostiske Betydningen af ​​cancerassocierede fibroblaster i esophageal pladecellecarcinom. PLoS ONE 9 (6): e99955. doi: 10,1371 /journal.pone.0099955

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: Februar 7, 2014 Accepteret: 20 maj 2014; Udgivet: 19 Jun 2014

Copyright: © 2014 Ha et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling på Korea Health Technology R D Project via Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed Velfærd, Republikken Korea (tilskud nummer: HI11C17620000), og Samsung Biomedical Research Institute tilskud SS1B30131. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancerassocierede fibroblaster (CAF) aktiveres fibroblaster i kræft stroma og er ved den forreste kant af mange faste tumorer, herunder bryst-, tyktarms-, og melanom [1] – [5]. CAF er de mest fremtrædende celletype i tumor stroma af mange kræftformer og en vigtig aktør i kræft-mikromiljø, som består af en dynamisk blanding af fibroblaster, monocytter /makrofager, endotelceller, lymfocytter og granulocytter. [2], [6] CAF drive tumor progression ved direkte stimulering af tumorcelleproliferation gennem sekretion af forskellige vækstfaktorer og cytokiner såsom hepatocytvækstfaktor, transformerende vækstfaktor-β, stromal celleafledt faktor 1, og interleukin-6 samt ved remodeling cancer mikromiljø gennem aflejring af ekstracellulære matrix og rekruttering af andre aktører såsom forskellige inflammatoriske celler og endotelceller [1] – [3]. Desuden aktiverede CAF bidrager til kræft progression ved at inducere angiogenese [1] – [3]. Under kræft progression, CAF bidrager til invasiv vækst af cancer ved at udskille flere proteaser, såsom matrix metalloproteinase eller cathepsiner og inducere epitel til mesenkymale overgang (EMT) [1] – [3].

Selvom fibroblaster er vidt udbredte og let genkendelig på grund af deres tenformet eller spindel-lignende form, forbliver fibroblaster dårligt defineret i molekylær form, og der er ingen kendte specifikke og pålidelige molekylære fibroblast markører. [4] Derfor identitet CAF er også dårligt forstået og CAF markør med absolut specificitet er ikke blevet identificeret. Der er flere veletablerede indikatorer for CAF såsom glatmuskelactin (SMA), fibroblast stimulerende protein-1 (FSP-1), blodpladeafledte vækstfaktor α (PDGFRα), og PDGFRβ. [4] Ingen af ​​dem er begge eksklusive for CAF og til stede i alle CAF. [4] i stedet hver af disse CAF markører anslås at repræsentere en bestemt og anderledes fænotype af CAF. Desuden fibroblaster er meget heterogene og fibroblaster fra forskellige anatomiske steder har betydeligt forskellige ekspressionsprofil [7].

Generelt CAF har været kendt for at have særskilte morfologi karakteriseret som store og fyldigt celler skelnes fra normale fibroblaster, som er tynde, bølget, og mindre spindel celler. [4], [6], [8] Men vi har foreløbigt fundet, at nogle ESCC havde stromale fibroblaster har histologi relativt normal fibroblast, mens nogle havde særskilte morfologi CAF.

klassificeringen af ​​histologiske morfologi enkelte CAF og dens kliniske relevans er ikke blevet undersøgt, selv om nogle tidligere rapporter viste, at histologisk kategorisering af stromal fibrose blev korreleret med kliniske resultater for tyktarmskræft [9], brystkræft [10], og lungekræft [11].

esophageal planocellulært karcinom (ESCC) er en af ​​de mest aggressive maligne tumorer, med en 5-års overlevelse på kun 10%. [12] CAF har sjældent været drøftet i ESCC trods dens betydning i kræft progression. Kun ganske få studier har undersøgt den biologiske rolle af tumor stroma herunder angiogenese i ESCC [13] – [18]. Fordi fibroblaster i forskellige dele af kroppen er væsensforskellige, resultatet af CAF undersøgelse i kræft i forskellige organer kan ikke være direkte anvendt på ESCC.

Derfor har vi studeret kliniske relevans af CAF i ESCC ved histologiske klassificering i henhold til individuel celle morfologi og immunhistokemiske studier af fem CAF markører såsom FAP, SMA, FSP-1, PDGFRα, PDGFRβ. Desuden vurderede vi sammenhængen mellem CAF og andre cancer-microenvironment relaterede faktorer som mikrokardannelse densitet (MVD) og tumor associeret makrofag (TAM) infiltration eller EMT fænotype.

Materialer og Metoder

vævsprøver

i alt 116 formalinfikserede og paraffinindstøbte tumor prøver fra patienter, som gennemgik helbredende kirurgisk resektion for primær ESCC på Samsung Medical center, Seoul, Korea 1995-2008, blev medtaget. Denne retrospektiv undersøgelse blev godkendt af institutionel gennemgang bord Samsung Medical Center, og gennemføres i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen fra 1996. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke i henhold til institutionelle retningslinier. Ingen patient fik præoperativ kemoterapi eller strålebehandling. Postoperativ adjuverende behandling blev udført i 86,2% (100/116) af patienterne: kemoterapi og strålebehandling i 31 patienter, kemoterapi alene i 51 patienter, og strålebehandling kun hos 18 patienter. Kliniske og patologiske rapporter blev revideret for alder, køn, tumorstørrelse, histologisk kvalitet, invasion dybde (PT), nodal status (PN), og fjernmetastaser (PM). Den mediane opfølgningsperiode var 30 måneder (interval 0-108 måneder). Den pTNM klassifikation blev anvendt i overensstemmelse med retningslinjerne fra 2010 amerikanske Blandede Udvalg om kræft iscenesættelse manual (AJCC 7

th udgave).

Tissue Microarray (TMA) Rekonstruktion

Hematoxylin og eosin ( HE) -stained væv blev revideret for at bekræfte den histologiske diagnose og til at vælge repræsentative områder for immunfarvning. En eller to cylindrisk kerne (2 mm i diameter) blev fjernet fra formalin-fikserede og paraffin-embedded tissue blokke svarende til HE glider at konstruere vævet microarray. Hver kerne blev valgt til at indeholde både tumoral (20-50%) og stromale (50-80%) komponent. For at minimere selektionsbias, blev hvert væv kerne omhyggeligt valgt til at indeholde mindst én eller flere CAF er “hot spot” overfyldt med CAF og stromale celler. Sektionsinddeling af microarray blokke produceret 4 mm tykke sektioner efter afslutningen af ​​vævet array.

Klassificering af CAF ved histologi på Hematoxylin og Eosin (HE) Slides

CAF blev inddelt i to grupper efter deres morfologi på HE glider, af to erfarne patologer (YHX og SHK) uden forudgående kendskab til klinisk-patologiske resultater, som nedenfor: 1. modne når fibroblaster viste tynd, bølget, og lille spindel cellemorfologi som normale fibroblaster; 2. Umodne når fibroblaster viste stor, buttet spindel-formet celle med fremtrædende nucleoli (figur 1). Når andelen af ​​umodne fibroblaster var mere end 50%, blev sagen for at have umoden CAF fænotype. I nogle få tilfælde med uenighed, blev den endelige fortolkning bestemmes ved konsensus ved hjælp af multi-head mikroskop.

A. Ældre type, når fibroblaster viser tynd, bølget, og lille spindel cellemorfologi; normale fibroblaster; B. Umodne type, når fibroblaster viser store, buttet spindel-formet morfologi; C-D. Survival kurver ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden ved log-rank test for histologisk undertype af cancer associeret fibroblast.

immunhistokemisk farvning Procedure

Sektioner på microslides blev afparaffiniseret med xylen, hydreret ved hjælp af en fortyndet alkohol-serien, og nedsænket i 0,3% H

2O

2 i methanol for at standse endogen peroxidase aktivitet. Sektioner blev behandlet med TE-buffer (10 mM Tris og 1 mM EDTA, pH 9,3) ved 98 ° C i 30 minutter. At reducere ikke-specifik farvning blev hver sektion blokeret med 4% bovint serumalbumin i PBS med 0,1% Tween 20 i 30 minutter. Snittene blev derefter inkuberet med anti-SMA (1:100, Millipore, Billerica, MA, USA), anti-FAP (1:100, Abcam), anti-FSP1 (1:100, Millipore), anti-PDGFRα (1 :100, Cell Signaling Technology), anti-PDGFRβ (1:100, Abcam), anti-CD34 (1:100, Dako, Glostrup, Danmark) og anti-CD68 (1:1000, Dako) i PBST med 3 mg /ml ged globulin (Sigma, St. Louis, MO, USA) i 60 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af tre successive vaske med puffer. Snit blev derefter inkuberet med et anti-muse /kaninantistof (Envision plus, Dako) i 30 minutter ved stuetemperatur. Chromogenet anvendte 3,3′-diaminobenzidin (Dako). Snit blev modfarvet med Meyers hematoxylin. Udelade primære antistof forudsat negative kontroller til immunfarvning.

Evaluering af immunhistokemisk analyse

To patologer (YHX og SHK) har evalueret de immunhistokemiske resultater med ingen forudgående viden om klinisk-patologiske resultater, og diskuteret eventuelle uoverensstemmelser i scoringer indtil enighed var nået. Ifølge farvningsintensitet og andelen af ​​positive stromaceller blev immunohistokemiske scorer for SMA, FAP, FSP1, PDGFRα, og PDGFRβ målt ved to patologer (YHX og SHK) med ingen forudgående kendskab til klinisk-patologiske resultater, som følger: 1, svag farvning i 50% eller moderat farvning i 20% af stromale celler; 2, svag farvning i ≥50%, moderat farvning i 20-50% eller stærk farvning i 20%; 3, moderat farvning i ≥50% eller stærk farvning i ≥20% (opsummeret i figur 2). Tilfælde med stillingen 2 og 3 blev betragtet som positivitet for hvert protein ekspression. MVD blev evalueret ved fremgangsmåden ifølge Weidner et al. [19] Kort fortalt alle CD34 positive individuelle mikrokarrør tællinger blev foretaget på en 200 x banen efter det højeste område blev identificeret ved scanning ved lav forstørrelse (40-100 ×). MVD blev klassificeret i tre grupper: lav, når MVD var 40; mellemliggende da MVD var 40-60; og højt, når MVD var 60. TAM blev identificeret ved positivitet for CD68 og graden af ​​TAM infiltration blev bestemt ved procentdelen af ​​CD68 positive celler blandt alle stromale celler: lav, når procentdel var 20%; højt, når ≥20% [20]

A:. Analyse af immunhistokemisk farvning udføres baseret på både intensitet og farvning område. B:. Påvisning af immunhistokemisk farvning af glatmuskelactin (SMA), fibroblast-specifikke protein-1 (FSP-1), fibroblast aktivator protein (FAP), blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGFR) α, og PDGFRβ

Statistisk analyse

Korrelationer blev undersøgt ved hjælp af Pearsons chi-square test eller Fishers eksakte test efter behov. Samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) blev bestemt under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og blev sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Overlevelse blev målt fra tidspunktet for kirurgi. Cox proportional hazard model blev anvendt til multivariat analyse. Cinicopathologic faktorer, som var statistisk signifikant i univariated analyse blev inkluderet som covariables i multivariat analyse. Hazard ratio (HR) og intervaller 95% sikkerhedsgrænser (CI) blev vurderet for hver faktor. Alle tests var to sider, og

P

≤0.05 blev betragtet som signifikant. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af SPSS statistisk software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

Histologisk Klassifikation af CAF er korreleret med Prognose i ESCC

Fifty to tilfælde (44,8%) blev klassificeret som moden CAF fænotype og 64 dem (55,2%) som umoden fænotype (figur 1A-B). Sammenhængen mellem disse kategorier, og clinicopathologic funktioner er opsummeret i tabel 1. De umodne CAF fænotyper var signifikant forbundet med øget MVD (p 0,001) og forøget infiltration af TAM (p = 0,003) sammenlignet med det modne stromale fænotype. Både forøget MVD og infiltration af TAM er korreleret med dårlig prognose af ESCC (fig S1). Denne histologiske kategorisering var også forbundet med EMT fænotype af ESCC (p = 0,002), som blev defineret i vores tidligere undersøgelse af immunhistokemisk ekspression af mesenchymale markør og E-cadherin. [21] Den komplette EMT fænotype, kendetegnet ved tab af E- cadherin ekspression med erhvervelse af mesenchymale markør ekspression, var signifikant hyppigere hos umodne CAF fænotyper end i de andre fænotyper. Den umodne CAF fænotype var stærkt korreleret med nedsat OS og DFS (p 0,001) (Figur 1C-D), og var en stærk uafhængig prognostisk faktor for OS (HR: 5,23 (95% CI: 2,57-10,65), s 0,001 ) og DFS (HR: 3,05 (95% CI: 1,66-5,59)., s 0,001) (tabel 2)

udtryk af CAF Markers såsom SMA, FSP1, FAP, PDGFRα, og PDGFRβ i Stromale Fibroblaster er Hyppig i ESCC og SMA FSP1 er stærkt forbundet med negative Klinisk Outcome

Vi valideret antistof mod FSP1, FAP, PDGFRα, og PDGFRβ, undtagen SMA, udbredt i daglig praksis (Figur S2 og Tekst S1) og udførte efterfølgende IHC procedure. Foreningen af ​​ekspressionen af ​​fem CAF markører med de klinisk-patologiske træk er sammenfattet i tabel S1. SMA, FSP1, FAP, PDGFRα, og PDGFRβ blev udtrykt i 82,8%, 72,4%, 61,2%, 88,8% og 54,3% af stromale fibroblaster i patienter med ESCC henholdsvis (figur 2). SMA-ekspression i cancer stromale fibroblast blev observeret hyppigere i tumorer, hvis størrelse er mere end 4 cm (p 0,001), avanceret T stadium (p 0,001) og N fase (p 0,001), men mindre hyppigt i dem med godt differentieret tumorer (p 0,001). Det var også forbundet med EMT fænotype (p = 0,005). FSP1 udtryk blev oftere fundet hos ældre patienter (≥65 år) (p = 0,037). PDGFRβ ekspression blev associeret med dårligt differentieret tumorer (p = 0,010). Men der er ingen væsentlige sammenhænge mellem FAP, PDGFRα og clinicopathologic parametre.

Kaplan Meier overlevelseskurver ifølge udtryk mønster af 5 CAF markører leveres i figur 3. udtryk for SMA og FSP1 var signifikant korreleret med kortere OS og DFS satser af patienter. Især den 5-årige OS og DFS hastigheden af ​​det stromale SMA-positive gruppe (41% og 34%) var signifikant lavere end for SMA-negative gruppe (88% og 75%) (OS: p = 0,005 ; DFS: p = 0,004). De 5-årige OS og DFS satser i stromale FSP1-positive gruppe (39% og 35% henholdsvis) var også betydeligt lavere end i for FSP1-negative gruppe (79% og 58%) (OS: p = 0,002; DFS: p = 0,044). Derudover 5-års OS sats i det stromale PDGFRα-positive gruppe (43%) var signifikant lavere end i PDGFRα-negative gruppe (100%) (p = 0,003). Patienter med FAP ekspression viste kortere 5-års samlet overlevelse sats (41% vs. 63%) uden statistisk signifikans (p = 0,070). Og ingen signifikant sammenhæng blev observeret mellem PDGFRβ udtryk og OS eller DFS satser. På multivariat analyse, FSP1 udtryk var en uafhængig prognostisk faktor for OS (HR: 4,86 ​​(95% CI: 1,90-12,40), p = 0,001) og DFS (HR: 2,77 (95% CI: 1,37-5,51), p = 0,004 ).

Korrelationen mellem CAF Marker Expression med Histologisk klassifikation

Fem CAF markører såsom SMA, FSP1, FAP, PDGFRα, og PDGFRβ blev uensartet udtrykt i stromale celler i 116 ESCCs (figur 4). Af disse fem CAF markører, antallet af markører, der viser positivitet i CAF var imidlertid større i ESCC med umodne CAF end dem med modne dem (gennemsnit 3,89 ± 1,09 vs 3,21 ± 1,23, p = 0,002). Konkret blev FSP1, PDGFRα eller PDGFRβ udtryk oftere fundet i ESCCs med umodne CAF, end dem med modne dem (tabel S2).

Diskussion

I denne undersøgelse vi først undersøgt ekspressionsmønsteret og kliniske betydning af CAF markører samt de histologiske kategorier og andre kræft-mikromiljøer i ESCC. Histologisk umodne CAF, defineret som en stor, buttet spindel-formet morfologi, var forbundet med øget MVD, mærket TAM og komplet EMT fænotype. Det var også en stærk uafhængig prognostisk faktor. Fem CAF markører blev heterogent udtryk i enkelte tilfælde, men det samlede antal af højt udtrykte CAF markører var større i umoden CAF type end i moden én.

Fibroblaster synes at være den mest alsidige af binde–væv celler, viser en bemærkelsesværdig evne til at differentiere til andre medlemmer af familien såsom fedtceller, bruskceller og knogleceller. “Moden” fibroblaster med mindre kapacitet til transformation kan for eksempel eksistere side om side med “umodne” fibroblaster (ofte kaldet mesenchymal-celler), der kan udvikle sig til en række af modne celletyper. Generelt er umodne fibroblaster kendt for at vise typisk et stort buttet og euchromatic kerne med en eller to nucleoli og ru endoplasmatiske reticulum og fremtrædende Golgi apparat på ultrastrukturelle fund. I denne undersøgelse har vi klassificeret CAF af ESCC som en moden og umoden type på basis af histologiske træk. Som følge heraf blev umoden form observeret i 55,2% af ESCC og var forbundet med negativ kliniske resultat. det var også forbundet med øget MVD og den fuldstændige EMT fænotype, som er kendt for at være den mekanisme af cancer progression [1] -. [6], [22] Desuden bemærkede vi TAM som angivet ved CD68-ekspression var betydeligt mere hyppige i ESCC med umoden typen CAF. Generelt TAM betragtes som M2 fænotypen af ​​makrofager, der fremmer angiogenese, vækst, invasion, migration, og metastase [23] -. [25] Infiltrerende TAM’er er korreleret med dårlig prognose i brystkræft [23] I overensstemmelse med denne rapport,. forbedret infiltration af TAM i ESCC blev også korreleret med negativ kliniske resultat. Imidlertid er yderligere undersøgelse for at afgøre mere specifikke forhold mellem CAF fænotype og M2 fænotype TAM i ESCC. Disse resultater tyder på, at vores histologisk klassifikation af stromale fibroblast er pålidelig og klinisk relevant trods manglen på detaljeret forståelse af dens molekylære mekanisme.

Vi valgte SMA, FSP-1, FAP, PDGFRα, og PDGFRβ som CAF markører baseret på tidligere undersøgelser. [1], [2], [4] Dette er den første undersøgelse for at undersøge ekspressionen og betydningen af ​​SMA, FSP-1, FAP, PDGFRα, og PDGFRβ i ESCC så vidt vi ved. Undtagen SMA, som er meget udbredt i den daglige praksis, de resterende fire antistoffer er relativt nyt, og er blevet brugt mest til forskningsformål. Derfor forsøgte vi at validere disse fire antistoffer og fandt, at alle fire antistoffer var specifikke i både Western blotting og immunhistokemi i formalinfikseret og paraffinindlejret væv (figur S2).

Vores resultater viste, at SMA-ekspression i ESCC stromale fibroblaster var forbundet med større størrelse, avanceret T stadium, lymfeknudemetastase, og dårlig prognose. På trods af forskellen i organer og kræfttyper, dette resultat er meget i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, hvor patienter med rigelige stromale myofibroblaster udtrykker SMA viste en dårligere prognose i mundtlig, kolorektale og brystkræft [26] -. [29] Vores resultater viste også, at patienter, der udtrykker FSP1 var ældre og havde kortere overlevelsesrater, som også var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser udført på brystkræft. [30] PDGFRβ udtryk var forbundet med dårligt differentierede tumorer (p = 0,010), men var ikke forbundet med prognosen. PDGFRα udtryk i CAF er en væsentlig faktor i udviklingen af ​​lungekræft [31], og dette resultat var delvis i overensstemmelse med vores resultat. Patienterne med FAP udtryk viste let nedsat OS (p = 0,070) og FAP udtryk var forbundet med hyppigere død (p = 0,030). Disse resultater er til dels i overensstemmelse med tidligere undersøgelser i bugspytkirtlen og tarmkræft. [32], [33] Hvad angår den prognostiske værdi af PDGFRβ, der er en vis uenighed mellem vores resultat og de to foregående undersøgelser, der bemærkede den sammenslutning af stromale PDGFRβ udtryk og dårlig prognose i prostata og kræft i bugspytkirtlen, henholdsvis. [34], [35] Denne forskel kan skyldes forskellige typer kræft eller organer. Vores resultater viste, at nogle af de enkelte CAF markører var væsentlige prognostiske indikatorer for ESCC. Men udtrykket mønster af CAF markører var meget heterogen i hvert enkelt tilfælde, hvilket afspejler den heterogenitet CAF befolkning. I betragtning af mangfoldigheden af ​​cellulære oprindelse CAF og enorme heterogenitet CAF fænotyper, er yderligere CAF markører med en god specificitet kræves [2].

På grund af heterogenitet CAF fænotype, evalueringen af ​​CAF markører ved væv microarray ( TMA) kan have en potentiel begrænsning i forhold til evaluering af hele blokken-baserede immunfarvning. Vi fandt imidlertid, at CAF jævnt fordelte uanset heterogenitet CAF fænotype i mere end halvdelen af ​​ESCC tilfælde (Figur S3A-B) i det foreløbige undersøgelse af, udtryk for FSP1, en repræsentant CAF markør, i hele blokke af 10 ESCC sager. I de resterende tilfælde, viste CAF fordeling regional koncentration omkring forskellige placering, såsom invaderende front overflade nekrose eller muskel lag (Figur S3C-E), uden en specifik sammenhæng med anatomiske placering eller dybde invasion. Og CAF s “hot spot” intenst overfyldt med CAF og stromale celler let genkendes på H & E afsnittet. For at minimere selektionsbias anvendte vi store og mellemstore væv kerne (2,0 mm i diameter) for TMA konstruktion og hvert væv kerne blev valgt til at indeholde mindst en eller flere CAF er “hot spot”.

I ESCCs, nylig flere rapporter har vist kliniske betydning og den rolle, tumor stroma herunder CAF i kræft progression. Wang et al. rapporterede, at tumor-stroma forholdet bestemt ved mikroskopisk evaluering var en uafhængig forudsiger af overlevelse i ESCC. [13] Liu et al. viste, at massefylden for myofibroblasts, lymfocytter, makrofager og mikrokar blev forøget karakteristisk i tumoren stroma ESCC og blev sædvanligvis forbundet med lymfekirtelinvolvering. [14] Zhang et al. sammenlignet genekspression profilering af tumor fibroblaster fra ESCC som de normale fibroblaster og fandt, at gener, der er forbundet med celleproliferation, den ekstracellulære matrix, og immunresponset forskelligt udtrykkes. [16] Disse resultater er generelt i overensstemmelse med vores resultater i, at den tilstedeværelse af aktiverede CAF var forbundet med en ugunstig resultat af ESCC. Men dette er den første undersøgelse, der har evalueret den nøjagtige klinisk-patologisk relevans af hver CAF markører under anvendelse af en stor gruppe af patienter med ESCC. Desuden er dette den første undersøgelse for at analysere stromale fibroblaster i ESCC baseret på histologi og vise sin prognostisk effekt i en stor kohorte af patienter med ESCC.

Som konklusion vores resultater viser, at histologiske klassificering af CAF er et kraftfuld prognostisk prædiktor for ESCC og er forbundet med øget MVD og TAM samt komplette EMT fænotype. Vores resultater tyder også, at CAF markører har potentiale til at være diagnostiske og terapeutiske mål i ESCC.

Støtte oplysninger

figur S1.

Overlevelseskurver hjælp af Kaplan-Meier-metoden ved log-rank test for cancer-microenvironment relaterede faktorer. . (A-B) mikrokar densitet (C-D) tumorassocierede makrofager

doi: 10,1371 /journal.pone.0099955.s001

(TIF)

Figur S2.

Validering af fibroblast aktivator protein (FAP), fibroblast-specifikke protein-1 (FSP-1), blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGFR) α og PDGFRβ antistoffer. A, B: Resultaterne af Western-blotting og mRNA-niveau ved revers transkription polymerasekædereaktion. Alle antistoffer, der er anerkendt proteinerne med de forventede molekylvægte (A) og disse resultater var høj grad i overensstemmelse med mRNA-niveauerne af disse proteiner (B). C: resultaterne af immunhistokemisk farvning af celle blokke fra 293T, NIH3T3, og HeLa-celler. Antistoffer mod FSP1, PDGFRα, og PDGFRβ farvet i NIH3T3-celler (positiv kontrol), men ikke i 293T og Hela-celler (negativ kontrol). Antistof til FAP også farves i Hela celler (positiv kontrol), men ikke i 293T eller NIH3T3 celler (negativ kontrol)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0099955.s002

(TIF)

Figur S3.

Resultatet af forundersøgelsen undersøge ekspressionen af ​​FSP1, en repræsentativ cancer associeret fibroblast (CAF) markør, i hele blokke af 10 esophageal pladecellekræft (ESCC) tilfælde. (A-B) CAF er jævnt fordelt uanset heterogenitet CAF fænotype i mere end halvdelen af ​​ESCC tilfælde. (C-E) De resterende sager viser CAF fordeling med regional koncentration omkring forskellige placering, såsom invaderende front (C), overflade nekrose (D) eller muskel lag (E)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0099955 .s003

(TIF)

tabel S1.

Sammenligning af clinicopathologic egenskaber i henhold til udtryk mønster af SMA, FSP1, FAP, PDGFRA og PDGRB

doi:. 10,1371 /journal.pone.0099955.s004

(DOCX)

tabel S2. .

Korrelation af histologisk undertype og udtryk af 5 kræft forbundet fibroblast markører

doi: 10,1371 /journal.pone.0099955.s005

(DOCX)

Text S1.

Validering af FAP, FSP1, PDGFRα, og PDGFRβ antistoffer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0099955.s006

(DOCX)