PLoS ONE: Den Warburg Effect Undertrykker oxidativ stress induceret apoptose i en gær Model for Cancer

Abstrakt

Baggrund

Otto Warburg observeret, at cancerceller ofte er karakteriseret ved intens glykolysen i tilstedeværelse af ilt og en samtidig reduktion i mitokondrie respiration. Forskning har hovedsageligt fokuseret på en mulig sammenhæng mellem øget glykolyse og tumor udvikling mens nedsat respiration er stort set blevet efterladt uden opsyn. Derfor er en årsagssammenhæng mellem nedsat respiration og tumorigenese er ikke påvist.

Metode /vigtigste resultater

Til dette formål kolonier af

Saccharomyces cerevisiae

, som er egnet til manipulation af mitokondriel respiration og viser mitokondrier-medieret celledød, blev anvendt som en model. Undertrykkelse af respiration samt ROS-latrintømning via glutathion hæmmede apoptose og tillagt en overlevelse fordel under såning og tidlig udvikling af denne hurtigt prolifererende cellepopulation solid. I modsætning hertil forøgelse af respiration udløste celledød

Konklusion /Betydning

Således kan det Warburg effekten direkte bidrage til indledningen af ​​dannelse kræft -. Ikke kun ved forbedret glykolysen – men også via faldet respiration i tilstedeværelse af ilt, der undertrykker apoptose

Henvisning:. Ruckenstuhl C, Büttner S, Carmona-Gutierrez D, Eisenberg T, Kroemer G, Sigrist SJ, et al. (2009) Den Warburg Effect Undertrykker oxidativ stress induceret apoptose i en gær Model for Cancer. PLoS ONE 4 (2): e4592. doi: 10,1371 /journal.pone.0004592

Redaktør: Julian Rutherford, Newcastle University, England

Modtaget: 26 august, 2008; Accepteret: 9. januar 2009; Udgivet: 25 februar 2009

Copyright: © 2009 Ruckenstuhl et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud FWF-FSP S93 til FM og give EU STREP 511.983 (TransDeath) til KU. F .. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i 1920 Otto Warburg beskrev den mest almindelige biokemiske fænotype af tumorceller: selv i nærværelse af en normal ilt niveau, glykolyse er meget forhøjet, og ledsaget af høj laktat produktion samt drastisk reduceret mitokondrie respiration [1] – [3]. Selvom dette fænotype er grundlaget for tumor diagnostik overvågning glukose forbrug [4], udfordrende spørgsmål forbliver undvigende: For eksempel, hvordan tumorceller vedtage denne fænotype ved forskellige mekanismer [5], [6], om begge fænomener (høj glykolyse og nedsat respiration) er årsagssammenhæng [7], [8], og endelig deres specifikke bidrag til tumorigenese [7], [9] – [11].

hurtigt prolifererende gær viser lignende gæring værdier som tumorceller [12], således tillader at undersøge forholdet mellem metabolisme energi og maksimal proliferation. Især programmeret celledød, som beskytter mod tumorigenese, er tæt forbundet med mitokondrie processer i pattedyrsceller. Gærceller kan også undergå programmeret celledød [13], [14] i en mitokondrier-afhængig måde [15], [16], herunder cytochrom c og AIF udgivelse, kanal åbning på human Bax udtryk [17] – [19], depolarisering af mitokondrie membran potentiale [20], og mitokondrie fragmentering [21].

Den særlige evne Crabtree-positive gær som

Saccharomyces cerevisiae

at tænde og slukke respiration som reaktion på ændringer i kilden carbon og muligheden for at producere levedygtige stammer som mangler mitokondrie-DNA (rho

0), tillader den strenge genetiske evaluering af den rolle, mitokondrier under celledød [15], [22]. Her vurderer vi den mulige forbindelse mellem undertrykt celledød og hæmmede oxidativ fosforylering, i kolonier dyrket fra en enkelt celle, der ligner tumorvækst.

Resultater og Diskussion

I en maksimal prolifererende fast cellepopulation , respiration øger ROS produktion og apoptose

S. cervevisiae

celler arver et unikt glukose undertrykkelse system, der ved vækst på glucose drastisk undertrykker respiration uafhængigt af ilt tilgængelighed [23]. Modellering tumorvækst, testede vi hvis undertrykt åndedræt påvirkninger celle-overlevelse under vækst af cellepopulationer startende fra en enkelt celle på glucose medier. Tre forskellige stammer ude af stand åndedræt sammen med isogene vildtype

S. cerevisiae

blev anvendt i en koloni-assay, hvor isolerede kolonier blev dyrket fra enkeltceller. Cellerne fjernes fra kolonier under tidlig udvikling af en rho

0 stamme koloni udviser signifikant forøget overlevelse sammenlignet med vildtype-stamme (fig. 1A). Konsekvent, generering af reaktive oxygenarter (ROS), en proces tæt forbundet med og ofte forårsagende til programmeret celledød, er formindsket (fig. 1B).

(A) Isolerede kolonier blev dyrket fra enkelte celler, manipuleret på agarplader. Klongenicitetsassayet af celler fjernet fra kolonier af vildtypestammen, rho

0 (ingen mitokondrie-DNA) og to enkelt gen-deletionsstammer (

mgm1

og

oxa1

), dyrket på SCGlu. Efter 3 dage 500 celler af hele kolonier efter 5 dage 500 celler af den centrale koloni-regionen blev analyseret (middelværdi ± SEM,

n

= 2). Statistisk signifikans af p 0,006 sammenligner kolonidannende enheder (cfu) af mutantstammer til vildtypestamme ved respektive tidspunkter. (B) Celler fra hele kolonien (3 dage) samt fra det centrale område (5 dage) blev farvet for reaktive oxygenarter (ROS) med dihydroethidium og analyseret ved FACSAria flowcytometri (middelværdi ± SEM,

n

= 2; ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med deletionsstammer på respektive tidspunkter). (C) Ca. 50 (2 dage) og 10 (3 dage) kolonier dyrket på SCGlu pladerne blev vasket af og klonogene assays blev udført med de indsamlede celler (gennemsnit ± SEM,

n

= 5; ** p 0,001). (D) Ca. 50 kolonier dyrket på SCGlu plader i 2 dage blev farvet for phosphatidylserin exposition (annv) og DNA brud (TUNEL) og analyseret ved FACSAria flowcytometri (middelværdi ± SEM,

n

= 3; ** p 0,01, *** p 0,001). (E) Fluorescens mikroskopi fra det centrale og ydre region af 5 dage gamle vildtype koloni celler, huser plasmid dsRed-MLS.

For at udelukke Rho

0 strain specifikke virkninger ikke tegner sig for åndedræt mangler blev to andre åndedræt forringet stammer undersøgt. Enkelt gendeletion stammer af begge,

MGM1

(homolog til humant

OPA1

) – en GTPase placeret i mitokondrie intermembrane plads [24] – og

OXA1

(en insertase af den indre mitokondrielle membran – særdeles konserveret fra prokaryoter til pattedyr [25], [26]) opførte sig som den (vildtype) rho

0 stamme. Efter 3 og 5 dage,

mgm1

samt

oxa1

slettede celler hentet fra hele kolonien (3 dage) eller det centrale område (5 dage), og således hovedsageligt ældre celler, viste signifikant forøget overlevelse (fig. 1A) samt inhibering af ROS generation sammenlignet med prøver af vildtype-stamme (fig. 1B). Notatet modsætning til andre åndedræt mangelfuld mutantstammer (herunder rho

0 og Δ

mgm1

) den Δ

oxa1

stammen viste samme vækstrater som vildtype-stammen i flydende kulturer og under kolonivækst, (fig. 2A og B).

(A) vækstkurver en

oxa1

deletion-stamme og den tilsvarende vildtypestamme. Forsøg blev udført tre gange. Y-aksen er skaleret logaritmisk. (B) Størrelse af isolerede kolonier af de angivne stammer, der dyrkes i 3 og 5 dage på SCGlu plader, henholdsvis. Diametre blev evalueret ved behandling af fotos med Metamorph Imaging (gennemsnit ± SEM,

n

= 2).

I en supplerende tilgang, seeded kolonier (10 og 50 per plade) af vildtype- og Δ

oxa1

stammer henholdsvis blev vasket fra SCGlu pladerne efter 2 og 3 dage og klonogene overlevelse blev vurderet. Igen stammen ude af stand til respiration viste bedre overlevelse end respirerende vildtypestamme (fig. 1C). Derudover overlevelse fordel af Δ

oxa1

stamme forekom allerede efter 2 dage, hvilket er i god overensstemmelse med tidligere data, som vildtype-kolonier dyrket på sædvanlige glucose medier, hvor vist at forlade den logaritmiske vækstfase efter ca. 36 timer [27].

for at vurdere den inducerede type celledød vi screenet for apoptotiske markører ved hjælp AnnexinV og TUNEL analyser. Apoptose blev signifikant reduceret i en respiration mangelfuld

oxa1

deletionsmutant sammenlignet med kontrollen vildtype (fig. 1D). Det skal bemærkes, at cellevæggen fordøjelse af vildtypeceller var mindre effektiv. Derfor lavere mængder af positivt farvede celler blev opnået sammenlignet med den observerede celleoverlevelse i klonogene assays efter 2 dage. Dette betyder, at den observerede suppression af apoptotiske markører i

oxa1

deleterede stamme er sandsynligvis endnu højere end i 1D. I denne linje ved behandling med 30% mere enzymblanding kan forbedre cellevæg fordøjelse, ca. 37% af vildtypeceller vises en TUNEL positiv farvning (data ikke vist). Mitokondrie fragmentering er en forudsætning for apoptose i gær. Derfor mitokondrie morfologi af celler fra vild-type kolonier (og ikke for rho

0-celler, fordi de mangler respiration) blev overvåget ved anvendelse dsRed bærer en mitokondrie lokaliseringssekvens. Efter 5 dage celler fra den centrale region (dermed ældre celler) viste en drastisk øget opsplitning af mitochondrier og mere punkterede strukturer henviser frisk næring yngre celler fra den ydre rand vises en normal rørformet struktur af mitokondrier (Fig 1E).

Vi konkluderer, at ophævelsen af ​​respiration undertrykker apoptose og ROS produktion i en stærkt prolifererende cellepopulation på faste medier.

Tvunget forøgelse af respiration udløser celledød under udsåning af en celle population

Novel kræft terapier er baseret på den antagelse, at rekonstitution eller tvungen forøgelse af respiration i faste tumorer kan føre til væksthæmning og celledød [10], [28], [29]. For at teste, om genetisk håndhævelse af respiration påvirkninger celledød under podning af en cellepopulation (som er den kronologiske skridt før en koloni etablerer), medie-shift forsøg under anvendelse af glucose (SCGlu), galactose (SCGal), og glycerol (SCGly) medier som vekslende eneste carbonkilder blev udført. Derved respiration enten undertrykt (SCGlu), samvirkende aktiv gæring (SCGal), eller det repræsenterer den eksklusive energikilde (SCGly). Når stationære (ikke prolifererende) flydende populationer af gær vildtypeceller dyrket på SCGlu blev flyttet til fast SCGal eller SCGly, kun 65% eller 44% af henholdsvis sederede celler var i stand til at danne en koloni (fig. 3A). Brug af stærkt proliferative kulturer af vildtype BY4741-stammen (fra den eksponentielle vækstfase) denne virkning var endnu mere udtalt med næsten ingen overlevelse på både respiratorisk medier (fig. 3A). Sammenlignelige resultater blev opnået med stærkt proliferative kulturer af andre vildtype-stammer, såsom AH22, TB50, og DBY746 (data ikke vist) under vore betingelser. Selv en overførsel i samme høje respiratoriske medier (fra væske SCGly til fast SCGly) førte til en formindsket koloni dannelse af -70% (i forhold til et skift fra væske SCGly til fast SCGlu), hvilket understreger, at specielt indledningen af ​​koloni vækst er negativ påvirket af forøget respiration (fig. 3B).

(A) Klonogen assay af kulturer forhånd dyrket i flydende SCGlu. 500 celler blev udpladet på SCGlu, SCGal, og SCGly agarplader henholdsvis (middel ± SEM,

n

= 3; *** p 0,001). (B) Klonogen assay af kulturer pre-dyrket i flydende SCGly. 500 celler blev udpladet på SCGly og SCGlu media plader, henholdsvis (middel ± SEM,

n

= 2; ** p 0,01). (C) Celler fra hele kolonien (3 dage) samt fra det centrale område (5 dage) blev farvet for reaktive oxygenarter (ROS) med dihydroethidium (DHE). Værdier af relative fluorescensenheder (RFU) blev normaliseret til vildtypestammen værdier (middelværdi ± SEM,

n

= 2; ** p 0,01, *** p 0,001). (D) Størrelse af isolerede kolonier vildtype dyrket på SCGlu og SCGal medier plader blev overvåget ved at tage fotos ved angivne tidspunkter. Diametre blev evalueret ved behandling af billeder med Metamorph Imaging (hvid bjælke repræsenterer en cm) (gennemsnit ± SEM,

n

= 3; * p 0,05, ** p 0,01).

Tvunget forøgelse af respiration undertrykker vækst og øger ROS produktion af kolonier

de observerede effekter af undertrykt koloni såning når respiration er høj blev også afspejlet i yderligere vækst af cellepopulationen: efter to dages vækst på solid SCGal kolonierne vises kun halv størrelse af dem, der dyrkes på fast SCGlu, selvom yderligere størrelse stigning (efter den indledende forsinkelse) er sammenlignelige (fig. 3D). Den indledende forsinkelse kan være forbundet med en umiddelbar ROS brast, som understreges yderligere af drastisk forhøjede ROS-niveauer i kolonier dyrket på SCGal eller SCGly (fig. 3C, også se nedenfor og fig. 4C).

(A) ca. 100 kolonier blev dyrket i 36 timer på SCGlu plader med eller uden 5 mM GSH, vaskes og klonogene assays blev udført med de indsamlede celler (gennemsnit ± SEM,

n

= 3; ** p 0,01) . Derudover lige store mængder af celler blev farvet for reaktive oxygenarter (ROS) med dihydroethidium (DHE) og kvantificeret under anvendelse af en fluorescensmikropladelæser (Genios-Pro). Værdier af relative fluorescensenheder (RFU) vises (middel ± SEM,

n

= 3; ** p 0,01) (B). (C) Klonogen assay af kulturer pre-dyrket i flydende SCGlu. 500 celler blev udpladet på SCGlu, SCGal eller SCGly agarplader, henholdsvis med eller uden 1 mM GSH (middelværdi ± SEM,

n

= 2; *** p 0,001).

derfor etablere en stærkt prolifererende cellepopulation solid kræver åndedræt skal undertrykkes.,

respiration medieret celledød i kolonier og nyligt seedede celler effektivt undertrykt via ROS scavenging

for yderligere at bevise at åndedræt og ledsagende ROS produktion er en væsentlig årsag til apoptose under koloni udvikling vi bruges reduceret glutathion (GSH) som et indfangende reagens: Kolonier af vildtype og

oxa1

deletionsstammer blev dyrket på SCGlu agarplader med eller uden GSH og celleoverlevelse blev bestemt efter 36 timer i en klongenicitetsassayet. Henviser til

oxa1

deletion-stamme viste ingen ændrede overlevelse ved tilsætning af GSH, blev overlevelsen af ​​vildtypeceller drastisk forbedret (Fig 4A). Dette var ledsaget af signifikant mindsket ROS niveauer (Fig 4B). Interessant forlængelse af fermentativ vækstfase ved at fordoble glukosekoncentrationen i medierne plader førte til svagt forøget celleoverlevelse (data ikke vist).

Derudover virkningen af ​​glutathion som ROS scavenger blev testet i et skift assay hvor stærkt proliferative vildtypeceller pregrown i flydende SCGlu medier blev podet på SCGal og SCGly plader med eller uden GSH. Slående, overlevelse blev forbedret til 50% og 55%, sammenlignet til 1% overlevelse på plader uden GSH (Fig 4C.). En lignende forskydning af stationære celler gav en forøget overlevelse fra 50% til 60% til 75% og 77%, henholdsvis på GSH holdige plader (data ikke vist). Vi konkluderer, at latrintømning ROS via glutathion øger celle overlevelse under koloni udvikling samt under såning på meget respiratoriske medier. Interessant nok er det blevet rapporteret for nylig, at i cancerceller og i neuroner (som også vist Warburg effekt), cytochrom

c

reduceres og holdes inaktive ved GSH [30].

Hidtil , forskning i Warburg effekten har hovedsageligt fokuseret på den høje glykolytisk flux, mens den medfølgende undertrykkelse af mitokondrie respiration ofte blev efterladt uden opsyn [8], [9]. Vores data viser, at respiration udløser apoptose under såning og udvikling af en celle population, der giver direkte eksperimentelle beviser til støtte for Warburg hypotesen under initiering af tumorigenese. Den stærkt nedsat respiratorisk kapacitet kan være afgørende for tumor malignitet [12] og for resistens mod uundgåelige svingende iltning i tumorer [31], [32]. Interessant nok er det blevet vist, at gær rho

0 stammer udviser forøget resistens overfor visse eksterne apoptotiske stimuli såsom eddikesyre, hvilket udløser død via den mitokondriske pathway [15], [17]. En lignende modstand mod celledød kan også spille en rolle for tumorceller i et surt omgivelser. Vi spekulere at omprogrammering af kræftceller følger en gammel mekanisme til stede i

S. cerevisiae

vildtype kolonier: høj glycolyse i tilstedeværelse af ilt

Materialer og metoder

Stammer og medier

Eksperimenter blev udført i BY4741 (MATa

his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0

) og respektive null mutanter af

mgm1

og

oxa1

henholdsvis opnået fra Euroscarf. Stamme BY4741 rho

0 blev bygget af flere runder af ethidiumbromid behandling som tidligere beskrevet [33]. For at udføre fluorescens mikroskopi af mitokondrie strukturer plasmidet dsRed-MLS (dsRed bærer en mitokondrie lokalisering sekvens) [34] blev transformeret i stammen BY4741. For overlevelse platings YEPD (1% gærekstrakt, 2% pepton og 2% glucose) medium blev suppleret med 2% agar. For alle assays, blev stammerne dyrket i SC medium indeholdende 0,17% gærnitrogenbase (Difco), 0,5% (NH

4)

2SO

4, og 30 mg /l af alle aminosyrer (undtagen 80 mg /l histidin, 200 mg /l leucin (uden leucin ved arbejde med plasmid dsRed-MLS)), 30 mg /l adenin, og 320 mg /l uracil med 2% glucose (SCGlu), 2% galactose (SCGal), og 3% glycerol (SCGly) henholdsvis suppleret med 2% agar, hvor det er nødvendigt. Reduceret glutathion (GSH; Sigma-Aldrich) tilsat i koncentrationer på 1 eller 5 mM, hvor der er behov

Isoleret monocolony assay

Seks cm petriskåle, leveret med 13 ml fast SC medier (. med eller uden leucin) blev anvendt. Enkelte celler i 16 til 20 timer natten kulturer blev placeret på faste SC medier plader ved hjælp af en mikromanipulator (serie 200, Singer Instruments). For at minimere dehydrering af de faste plader, blev inkubering udført ved 28 ° C i en lukket, befugtet avl kammer (KBF115, Binder). Til bestemmelse diameter, blev fotos taget på de angivne tidspunkter (Mikrobiologi-koloni-Counter, Lemnatec) og behandles ved hjælp Metamorph billeddannelse.

Survival plating, medie-shift eksperimenter, og vækstkurver

for at bestemme overlevelsen af ​​celler i kolonien, enten hele isolerede kolonier (i tilfælde af 3 dage) og prøver fra de centrale regioner i de isolerede kolonier (i tilfælde af 5 dage) blev fjernet ved angivne tidspunkter, eller SCGlu plader med ca. 100 kolonier (efter 36 timer), 50 kolonier (efter 2 dage) eller 10 kolonier (efter 3 dage) blev vasket af. Celletællinger blev bestemt ved en CASY celletælling enhed (Schärfe Systems) og 500 celler blev udpladet på YEPD-agarplader. blev bestemt kolonidannende enheder (cfu) efter 2 eller 3 dage (i tilfælde af åndedræt mangelfulde stammer rho

0 og Δ

mgm1

) med en Mikrobiologi-koloni-Counter (Lemnatec) og forarbejdet ved hjælp SAWmicrobio version 3.1.

i media-skift eksperimenter blev kulturer dyrket i SCGlu og SCGly flydende medier til logaritmisk (6 timer) og stationær (24 h) fase henholdsvis og 500 celler blev udpladet på respektive faste medier plader samt på SCGlu plader i alle tilfælde.

til vurdering af vækstraterne i flydende medier, overnatskulturer blev dyrket i SCGlu. Kulturer blev inokuleret til 5 × 10

5 celler i SCGlu og cellevækst blev overvåget i løbet af 12 timer ved hjælp af en CASY celletæller enhed.

Farvning for apoptotiske markører og fluorescensmikroskopi

Farvning af reaktive oxygenarter (ROS) med dihydroethidium (DHE), Annexin V-farvning, og TUNEL-farvning blev udført som tidligere [34] beskrevne. I hver prøve blev 30.000 celler evalueret ved hjælp af flowcytometri (FACS-Aria, BD) og forarbejdet ved hjælp FACSDiva software. Alternativt lige store mængder af DHE farvede celler blev målt i en mikroplade fluorescens-læser (Genios-Pro, Tecan).

mitokondrie morfologi blev inspiceret af fluorescens mikroskopi ved hjælp af en dsRed filter på en Zeiss Axioskopmikroskop. Celler af den centrale samt det ydre område af isolerede monocolonies af vildtype celler, der huser plasmid dsRed-MLS blev monitoreret efter 5 dage.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af Students T-test (en-halet, uparret), med * p 0,05, ** p 0,01 og *** p. 0,001 henholdsvis

tak

Vi takker Ulrike Potocnik for teknisk bistand.