PLoS ONE: Nye roller for P53 i Genesis og målretning af Tetraploid Cancer Cells

Abstrakt

Tetraploid (4N) celler anses for vigtige i cancer, fordi de kan vise øget tumorgenicitet, modstandsdygtighed over for konventionelle behandlinger, og menes at være forstadier til hele kromosom aneuploidi. Det er derfor vigtigt at fastslå, hvor tetraploid kræft celler opstår, og hvordan til at målrette dem. P53 er en tumor suppressor protein og nøgle regulator af tetraploidy. Som en del af “tetraploidy checkpoint”, p53 hæmmer tetraploid celledeling ved at fremme en G1-anholdelse i begyndende tetraploide celler (kaldet en tetraploid G1 anholdelse). Nutlin-3a er et præklinisk stof, der stabiliserer p53 ved at blokere interaktionen mellem p53 og MDM2. I den aktuelle undersøgelse, Nutlin-3a fremmet en p53-afhængig tetraploid G1 standsning i to diploide kloner af HCT116 coloncancercellelinie. Begge kloner undergik endoreduplikation efter Nutlin fjernelse, hvilket giver anledning til stabile tetraploide kloner, der udviste forøget resistens over for ioniserende stråling (IR) og cisplatin (CP) -induceret apoptose sammenlignet med deres diploide forstadier. Disse resultater viser, at forbigående p53-aktivering ved Nutlin kan fremme tetraploid celle dannelse ud fra diploide forstadier, og de resulterende tetraploide celler er terapi (IR /CP) resistente. Vigtigt er det, de tetraploide kloner udvalgt efter Nutlin behandling nogenlunde dobbelt så meget

P53

MDM2

mRNA som diploide forstadier, udtrykt ca. dobbelt så mange p53-MDM2 proteinkomplekser (ved co-immunoudfældning) og var mere modtagelige for p53-afhængig apoptose og vækststandsning induceret af Nutlin. Baseret på disse resultater, foreslår vi, at p53 spiller hidtil ukendte roller i både formationen og målretning af tetraploide celler. Specifikt foreslår vi, at 1) forbigående p53-aktivering kan fremme en tetraploid-G1 arrest og, som følge heraf, kan uforvarende fremme dannelsen af ​​terapi-resistent tetraploide celler, og 2) terapi-resistent tetraploide celler, ved at have højere

p53

genkopital og udtrykke dobbelt så mange p53-MDM2-komplekser, er mere følsomme for apoptose og /eller vækststandsning ved anti-cancer MDM2 antagonister (f.eks Nutlin)

Henvisning:. Davaadelger B, Shen H, Maki CG (2014) Nye roller for P53 i Genesis og målretning af Tetraploid kræftceller. PLoS ONE 9 (11): e110844. doi: 10,1371 /journal.pone.0110844

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 27. juni, 2014, Accepteret: September 24, 2014; Udgivet: November 7, 2014

Copyright: © 2014 Davaadelger et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant 1RO1CA137598-01A1 fra National Cancer Institute (NCI) (til C.G.M.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatter Carl Maki er en PLoS ONE redaktionelle bestyrelsesmedlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Tetraploide celler indeholder to gange den normale mængde af DNA og er sjældne i de fleste normale væv. Men tetraploide celler er forholdsvis almindelige i cancer og menes at bidrage til tumorudvikling, aneuploidi, og terapi resistens [1]. Direkte beviser for tumorigent potentiale tetraploide celler blev leveret af Fujiwara et al. [2], som isoleret binucleated, tetraploide mammaepitelceller fra p53-nul-mus. Bemærkelsesværdigt, disse celler var mere modtagelige for carcinogen-induceret transformation (soft-agar vækst) end diploide modstykker, og de tetraploide celler dannede tumorer i nøgne mus, mens diploide celler ikke gjorde. Andre undersøgelser har knyttet tetraploidy for stråling og kemoterapi modstand. F.eks Castedo et al. [3], [4], isoleret tetraploide og diploide kloner fra to menneskelige kræftceller med vildtype p53. Vigtigere, tetraploide kloner var resistente over for stråling og flere kemoterapeutiske stoffer sammenlignet med diploide modstykker. Endelig er der stigende tegn på, at aneuploide cancerceller genereres fra enten asymmetrisk deling eller progressiv kromosomale tab fra tetraploide forstadier. Tidlig beviser for dette kom fra undersøgelser i præmaligne Barretts øsofagus. I disse undersøgelser, udseendet af tetraploide celler korrelerede med p53 tab og gik forud brutto aneuploidi og carcinogenese [5], [6]. Alt i alt kan tetraploide celler har højere tumorigent potentiale, være terapi og stråling-resistente, og være forstadier til kræft aneuploidi. Det er derfor vigtigt at identificere, hvordan tetraploid celler opstår, og hvordan de kan målrettes til kræftbehandling.

P53 er en tumor suppressor og vigtig regulator af tetraploidy [7]. p53 holdes på lave niveauer af MDM2, en E3-ligase, der binder p53 og fremmer dens nedbrydning [8], [9]. DNA-skader og andre påvirkninger forstyrre p53-MDM2 binding, forårsager p53 niveauer til at stige. Øget p53 stopper spredning ved at inducere ekspression af gener, der fremmer G1-anholdelse (

P21

) eller apoptose (

PUMA, NOXA, BAX

) [10]. Dokumentation for, at p53 fungerer i en “tetraploidy checkpoint” kommer stort set fra studier med anvendelse af mikrotubuli hæmmere (MTIs), at blok celler i metafase. Celler arresteret i metafase ved længere tids MTI eksponering kan i sidste ende gå ud mitose og indtaste en pseudo-G1 tilstand, der omtales som tetraploid G1 [11], [12]. Endofordobling refererer til det tilfælde, hvor disse tetraploide celler ind S-fasen og kopiere deres DNA, der giver anledning til høje ploidi celler med stigende overlapninger af genomet (8N, 16N, 32N, osv). Celler, der mangler p53 /p21 er mere tilbøjelige til MTI-induceret endoreduplikation end vildtypeceller [11] – [14]. Dette understøtter en p53-p21 afhængige tetraploidy checkpoint at entry blokerer S-fase ved 4N celler.

Tetraploid G1-arrest er typisk karakteriseret ved udtømning af G2 /M-proteiner (f.eks Cycliner A /B, CDC2) og øget ekspression af G1 anholdelse proteiner (f.eks P53, p21) i 4N celler [15] – [19]. DNA-beskadigende midler fx ioniserende stråling (IR) aktivere p53 og standser celler i G1 og G2-faser. To tidlige rapporter fundet IR forårsagede p53 og p21-afhængig udtømning af Cdc2, cyclin A, og cyclin B mRNA og protein [20], [21]. I et tilfælde, udtømning af disse G2 /M markører faldt sammen med endoreduplikation 1-6 dage efter behandling [21]. Disse resultater antydede, at p53-p21 aktivering i IR-behandlede celler kan fremme en tetraploid G1 anholdelse fulgte derefter af endoreduplikation. Nutlin-3a (Nutlin) er et præklinisk stof, der stabiliserer p53 ved at blokere p53-MDM2 binding. Vi rapporteret at Nutlin kunne fremme en tetraploid G1 arrest i multiple p53 vildtype cellelinier, kendetegnet ved depletering af G2 /M-proteiner og forøget ekspression af p53 og p21 i 4N celler [18], [19]. Efter Nutlin fjernelse, p53 og p21 faldet, og, i nogle tilfælde, celler undergik endoreduplikation [18]. p53 og p21 var nødvendige for både tetraploide G1 anholdelse og for endoreduplikation efter Nutlin fjernelse. Vigtigere, kunne stabile tetraploide kloner isoleres fra Nutlin behandlede celler, og disse tetraploide kloner var resistente over for IR og cisplatin (CP) -induceret apoptose [19]. Disse undersøgelser antyder p53-p21 aktiveret af Nutlin kan fremme en tetraploid G1-arrest og, når p53-niveauer fald (Nutlin fjernelse) cellerne kan replikere deres DNA (endoreduplikation) og give anledning til tetraploide celler, som er IR- og CP-resistente. en advarsel af disse tidligere undersøgelser er imidlertid, at de blev gjort i cancercellelinier, som kan omfatte en blanding af diploide og tetraploide celler, hvoraf nogle kan være potentielt IR /CP-resistente. Det er muligt, at vi havde isoleret IR /CP-resistente tetraploide kloner, som allerede var til stede i populationen, eller at de tetraploide kloner vi isoleret blev afledt fra diploide celler, som allerede var IR /CP-resistente. Således forblev det uklart, om forbigående p53-aktivering ved Nutlin kunne konvertere diploide celler i tetraploide celler, og hvis ja, om de heraf tetraploide kloner ville vise øget resistens over for terapi-induceret apoptose. Den aktuelle undersøgelse blev indledt for at behandle disse spørgsmål, og for at teste den mulighed, at tetraploide kræftceller kan være særligt følsomme over for MDM2 antagonister.

Materialer og metoder

cellelinier og dyrkningsbetingelser

p53 vildtype og p53-nul HCT116-celler (beskrevet i [11] blev opnået fra Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University). D3 og D8 er blevet beskrevet [22] og er diploide kloner, der blev isoleret fra p53 vildtype HCT116-celler ved begrænsende fortynding. cellerne blev dyrket i McCoys 5A-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). celler blev udpladet 24 timer før de behandlet med Nutlin-3 (10 pmol /l; Sigma), bestråling (10 Gy), cisplatin (Bedford Laboratory), eller som angivet

immunblotting

Hele celleekstrakter blev fremstillet ved resuspendering. cellepellets i lyseringsbuffer (150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 50 mM Tris, pH 7,5), opløst ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (NEN Life Science Products). Antistoffer mod p21 (H-164), cyklin A (H-432), Geminin (FL-309), Cdk2 (M2) og p53 (AB-6) var fra Santa Cruz Biotechnology; antistoffer mod cyclin B1 (V152), CDC2 (POH1), og Tyr-15 Phospho-CDC2 var fra Cell Signaling; antistoffer mod MDM2 (2A10) var fra Calbiochem. Antistof til cyclin E (HE-2) var fra BD Pharmingen. Primære antistoffer blev påvist med gede anti-muse (Pierce) eller gede anti-kanin (Life Technologies) sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase, ved anvendelse Klarhed kemiluminescens (Bio-Rad).

flowcytometrianalyse og live Celle Sortering

i cellecyklusanalyse, celler blev høstet og fikseret i 25% ethanol natten over. Cellerne blev derefter farvet med propidiumiodid (25 ug /ml; Calbiochem). Flowcytometri analyse blev udført på Gallios flowcytometer (Beckman Coulter) og analyseret med CellQuest (Becton Dickinson) og FlowJo 8,7 (Treestar, Inc). For hver prøve blev 10.000 begivenheder indsamlet. For levende cellesortering blev celler inkuberet med Hoechst 33342 (2 pmol /l; Invitrogen) i 90 minutter ved 37 ° C og derefter høstet. Cellesortering blev udført baseret på DNA-indhold under anvendelse af en MoFlo cytometer udstyret med en UV excitation laser. De sorterede celler blev udpladet ved lav densitet.

mRNA analyse

Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) blev udført for at måle mRNA niveauer for cyclin A2, cyklin B1, CDC2, P21, Bax, Noxa, PUMA, P53R2, Actin i celler, der var ubehandlet eller behandlet med Nutlin, Cisplatin, eller IR som angivet. Den kvantitative real-time PCR-reaktion blev kørt i en 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster, CA) under anvendelse af SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) efter fabrikantens instruktioner. Termocyklisering blev udført i et endeligt volumen på 20 pi indeholdende 2 pi cDNA og 400 nmol /l af primere (primere er anført i tabel S1). Alle prøver blev amplificeret in triplo under anvendelse af følgende cyklus skema: 95 ° C i 2 minutter, 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 55 ° C i 60 sekunder. Fluorescens blev målt i hver cyklus og mRNA-niveauer blev normaliseret under anvendelse actin værdier i alle prøver. En enkelt top blev opnået for mål, understøtter specificiteten af ​​reaktionen.

metafasespredninger

Cell blev inkuberet med Colcemid (50 ng /pl) (Sigma-Aldrich) i en time ved 37 ° C, høstet og vasket med PBS og hypotonisk opløsning (2 dele 0,075 M KCI og 1 del 0,7% Na-citrat). Cellerne blev derefter fikseret i fiksativ (3 del methanol og 1 del eddikesyre) og spredt på et objektglas. Spændene blev undersøgt under et fasekontrastmikroskop.

FISH Analyse

Celler blev høstet og vasket med PBS. Derefter inkuberet med hypotonisk opløsning (2 dele 0,075 M KCI og 1 del 0,7% Na-citrat) for 20mins ved 37 ° C. Cellerne blev derefter fikseret i fiksativ (3 del methanol og 1 del eddikesyre). Objektglassene blev fremstillet og ældet ved 55 ° C i 3 minutter på en thermobrite. Objektglassene blev inkuberet med 0,05% Pepsin (Fisher # P53-100) i 16 minutter ved 37 ° C og derefter vasket med PBS og dehydreret i 70%, 85% og 100% ethanol i 1 minut hver ved stuetemperatur. Derefter proben Vysis LSI TP53 SpectrumOrange /CEP 17 SpectrumGreen (Abbott Molecular Inc # 01N17-020) blev tilsat hybridisere ved 73 ° C i 5 minutter og 37 grader i 18 timer. Derefter blev glassene vasket med SSC puffer (Gibco # 15.557-044) med 0,5% NP-40 (Fisher # P53-100) i 2 minutter ved 73 ° C og modfarvet med DAPI II (Abbott Molecular Inc # 30-804.818). Slides blev undersøgt under fluorescerende mikroskop.

Klonogen analysen.

Celler blev udpladet 24 timer før at være ubehandlet eller behandlet med CP, IR, eller Nutlin i passende fortyndinger til at danne 50-100 kolonier. Efter 2-3 uger kolonier blev fikseret med formaldehyd og farvet med 0,05% krystalviolet. Kolonierne blev talt og normaliseret med plating effektivitet ubehandlede celler.

Resultater

Nutlin fremmer en tetraploid G1-anholdelse i diploide celler

Vi ønskede at spørge, om forbigående p53 aktivering af Nutlin kunne fremme tetraploid celle dannelse fra diploide forstadier, og hvis ja, om de heraf tetraploide celler ville have øget resistens over for terapi-induceret apoptose. HCT116 er en human coloncancer cellelinie, som udtrykker vildtype-p53. I vores tidligere undersøgelse blev HCT116 udpladet ved enkelt celle tæthed og ti individuelle diploide kloner blev isoleret (kloner designeret D1-D10), der varierede i deres relative følsomhed over for cisplatin (CP) -induceret apoptose [22]. Vi valgte diploide kloner D3 og D8 for den aktuelle undersøgelse, fordi disse kloner udviste en relativ høj følsomhed over for CP i vores tidligere undersøgelse. D3 og D8 behandlet med Nutlin i 24 timer akkumuleret med 2N og 4N DNA-indhold (fig 1A). Immunoblots viste, at Nutlin behandling i begge kloner forårsaget fuldstændig eller næsten fuldstændig udtømning af cyclin A, cyclin B1, og Tyr-15 phosphoryleret CDC2 (pCDC2), og delvis depletering af totalt CDC2 protein (figur 1B). Cyclin A, cyclin B1, og CDC2 mRNA blev også depleteret i Nutlin behandlede celler, hvilket tyder på nedsat niveau af disse G2 /M-proteiner kan skyldes nedsat transkription (figur 1C). I modsætning hertil blev p53 og p21 proteinniveauer forøges markant ved Nutlin behandling (Fig 1B). Vores tidligere undersøgelser viste p53 og p21 blev forhøjet i både 2N og 4N Nutlin-standsede celler [18]. , Nutlin forårsager således udtømning af G2 /M-proteiner og forøget ekspression af G1-anholdelse proteiner (p53, p21) i de 4N anholdte celler, indikerer en tetraploid G1 anholdelse. Vigtigere, Nutlin havde ingen effekt på cyklin A, cyklin B1, pCDC2, og totale cdc2 niveauer i p53-nul HCT116 celler (Fig 1B), og forårsagede ikke en 2N og 4N standsning i disse celler (Fig 1A), hvilket viser tetraploide G1 arrest induceret af Nutlin er p53-afhængig. Vi overvåges også niveauer af geminin, en DNA-replikation inhibitor, der er fraværende i G1 og akkumuleres i S, G2, og M-fase [23]. Geminin blev forårsaget af Nutlin i D3 og D8 celler, i overensstemmelse med cellerne bliver G1-anholdt (Fig 1B). Cdk2 niveauer var uændret ved Nutlin, mens niveauet af G1-fase cyclin proteiner cyclin D1 og cyclin E blev forøget, også i overensstemmelse med celler bliver arresteret i G1-fasen. I summen, resultaterne viser, at Nutlin forårsager en p53-afhængig tetraploid G1-anholdelse i diploide HCT116 kloner D3 og D8.

A) HCT116 diploide kloner D3 og D8, og HCT116 som udtrykker vildtype p53 (p53 + /+) eller er p53-null (p53 – /-) var ubehandlet eller behandlet med Nutlin (NUT 10 uM) i 24 timer, og cellecyklus-profil bestemt ved flowcytometri. B) Ekspression af de angivne proteiner blev overvåget ved immunoblot i celler ubehandlede eller behandlet med Nutlin (NUT 10 uM) i 24 timer. C) mRNA niveauer for de angivne faktorer i ubehandlede celler eller celler behandlet med Nutlin (NUT 10 uM) i 24 timer blev bestemt ved QRT-PCR.

Forbigående Nutlin behandling fremmer dannelsen af ​​terapi resistente tetrapolid kloner fra diploide prækursorceller

Vi har tidligere viste 4N anholdt celler kan reinitiere DNA-syntesen efter Nutlin fjernelse og kopiere deres DNA uden en mellemliggende mitotiske division, en proces kendt som endoreduplikation [18], [19]. At spørge, om D3 og D8 undergår endoreduplikation efter Nutlin fjernelse, cellerne blev Nutlin behandlet i 24 timer, efterfulgt af Nutlin fjernelse for forskellige tidspunkter. Flowcytometri blev anvendt til at overvåge cellecyklus profiler og anvendes til at overvåge proteinniveauer efter Nutlin fjernelse immunoblots (fig 2). D3 og D8 akkumuleret med 2N og 4N DNA indhold, når Nutlin behandlet i 24 timer, som i fig 1. Begge kloner undergik endoreduplikation efter Nutlin fjernelse, fremgår af den udtalte fremkomsten af ​​ 4N celler 16 timer efter Nutlin fjernelse og deres forbigående akkumulering i en 8N højdepunkt. Fremkomsten af ​​ 4N celler og deres ophobning i en 8N top er tegn på 4N celler indlede DNA-syntese, replikere deres DNA, og indtaste mitose. Cyclin A2, cyclin B1, og cdc2 niveauer returneret 16 timer efter Nutlin fjernelse, i overensstemmelse med de celler, bliver hovedsagelig i G2 /M på dette tidspunkt. Cyclin E-CDK2-aktivitet menes at fremme eller være påkrævet for DNA-syntese initiering [24], [25], og p21 binder til og inhiberer cyclin E-CDK2-aktivitet [26]. Især fremkomsten af ​​ 4N, DNA replikerende celler 12-16 timer efter Nutlin fjernelse faldt sammen med et kraftigt fald i p21 protein niveauer. Vi spekulere de reducerede niveauer af p21 efter Nutlin fjernelse tilladt aktivering af cyclin E-CDK2-komplekser, der kunne så køre DNA-syntese.

A) Diploide HCT116 kloner D3 og D8 var ubehandlet (NT) eller udsættes for Nutlin (NUT 10 uM) i 24 timer, efterfulgt af Nutlin fjernelse. Cellerne blev høstet på de angivne tidspunkter efter Nutlin fjernelse. Fikserede celler blev farvet med propidiumiodid (25 ug /ml) og underkastet flowcytometrianalyse. B) Celler blev ubehandlede (NT) eller udsættes for Nutlin (NUT 10 uM) i 24 timer, efterfulgt af Nutlin fjernelse. Cellelysater blev opsamlet ved angivne tidspunkter og analyseret ved immunoblotting med de angivne antistoffer. Actin var som en loading kontrol.

P-Cdc2

, fosfor-Cdc2 (Tyr-15).

Næste, vi har ønsket at spørge, om endoreduplikation efter Nutlin fjernelse kunne give anledning til stabile tetraploide kloner, og hvis ja , om de heraf tetraploide kloner ville være resistente over for CP eller ioniserende stråling (IR) -induceret apoptose. Med henblik herpå D3 og D8 blev Nutlin behandlet i 24 timer efterfulgt af Nutlin fjernelse i yderligere 16 timer. Cellerne blev derefter mærket med live-cell DNA-farve Hoechst 33342. 2N og 8N celler blev isoleret ved flowcytometri og genudpladet ved lav densitet til isolering af individuelle kloner (Fig 3A). I alt 11 D3 kloner og 12 D8 kloner blev opnået fra isolerede 8N befolkninger, der opstod efter Nutlin fjernelse. 7 af de 11 D3 kloner (63%) og 8 af de 12 D8 kloner (66%) voksede som tetraploide 4N celler. Dette fremgik af: 1) G1 peak af disse kloner overlapper G2 /M højdepunktet af D3 og D8 diploide celler (Fig 3B), 2) kromosom optælling af metafasespredninger som støttede tetraploide kloner med to gange DNA-indholdet af diploid D3 og D8 forstadier (fig 3C), og 3) FISH-analyse ved hjælp af

P53

og kromosom 17-specifikke prober. Denne FISH analyse viste tetraploide kloner har 4 kopier af kromosom 17 og

P53

, mens diploide D3 og D8 celler har 2 kopier af kromosom 17 og

P53

(Fig 3D). Endelig har vi testet, om tetraploide kloner, der opstod efter Nutlin behandling var mere modstandsdygtige over for CP og IR-induceret apoptose end diploide modstykker. Først 5 tetraploide kloner og 5 diploide kloner isoleret fra Nutlin behandlede D3 eller D8 celler blev udsat for CP (20 uM) eller IR (10 Gy), og apoptose overvåget 48 timer senere ved sub-G1 DNA-indhold. Som vist i fig 4A, de tetraploide kloner som gruppe var signifikant mere resistente over for CP og IR-induceret apoptose end parentale celler og diploide kloner isoleret efter Nutlin behandling. Individuelle tetraploide kloner (T3 og TD6) var også mere resistente over for CP og IR-induceret apoptose i forhold til diploide modparter (D3 og D81B), fremgår af en lavere procent sub-G1 celler efter CP og IR behandling (Fig 4B) og lavere udtryk af spaltet PARP og spaltes caspase-3 (fig 4D). Disse resultater er i overensstemmelse med rapporter fra os og andre, der viste tetraploide celler kan være terapi resistente [3], [19]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at p53 og p21 kan bidrage til CP og IR-resistens i HCT116 og andre celler, mest sandsynligt ved at inducere eller håndhæve en cellecyklusstandsning, som blokerer CP eller IR-behandlede celler fra prolifererende og forsøger at opdele [27] – [31]. Især fandt vi p53, MDM2, og p21 proteinerne blev induceret til sammenlignelige niveauer i CP og IR-behandlede diploid og tetraploide kloner (Fig 4C), og at p53-responsive cellecyklusstandsning gener (

P21

), DNA reparation gener (

P53R2

), og apoptotiske gener (

PUMA, Noxa, Bax

), blev også induceret sammenligneligt i CP og IR-behandlet diploid og tetraploide kloner (fig 4E). Disse resultater antyder CP og IR-modstand i tetraploide kloner er ikke forbundet med øget p53-niveauer eller aktivitet. I alt indikerer resultaterne forbigående p53 aktivering med Nutlin kan fremme en tetraploid G1 anholdelse og endoreduplikation efter Nutlin fjernelse i diploide precursorceller, der fører til dannelsen af ​​terapi (CP /IR) resistente tetraploide kloner.

A ) Vist er proceduren for at isolere diploide og tetraploide kloner fra celler forbigående eksponeret for Nutlin. D3 og D8 var ubehandlet (NT) eller behandlet med 10 pM Nutlin (NUT) i 24 timer, efterfulgt af Nutlin fjernelse i yderligere 16 timer. Cellerne blev derefter leve-farvet med Hoechst 33342 (5 ug /ml). Cellesortering blev udført på et MoFlo cytometer udstyret med en UV excitationsbølgelængde laser. Sorterede 2N og 8N-celler blev udpladet ved lav densitet i normalt medium (minus Nutlin) og individuelle kloner isoleret. B)

Top

, sammenligningen af ​​dna-profiler mellem D3 og en repræsentant tetraploid klon isoleret fra D3.

Bund

, sammenligning af dna-profiler mellem en repræsentant diploid klon (D81B) isoleret fra D8 celler, og en repræsentant tetraploid klon (TD6) isoleret fra D8 celler. C) repræsentant metafasespredning fra diploide D3-celler og tetraploide T3 celler. Tallet i nederste højre angiver antallet af kromosomer optalt. D) FISH-analyse med kromosom 17 (Chr 17) og p53-specifikke prober viser tetraploide (T3) celler indeholder 4 kopier af p53 og Chr 17, mens diploide (D3) celler indeholder 2 kopier af p53 og Chr 17.

A) fem diploide kloner isoleret fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 diploide) og D8 celler (D8 diploide) og fem tetraploide kloner isoleret fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 tetraploide) og D8 celler (D8 tetraploide) var ubehandlet (NT) eller udsættes for CP (20 uM) eller IR (10 Gy) i 48 timer. Procentdelen af ​​celler med sub-G1 DNA blev bestemt. Vist er de gennemsnitlige resultater fra tre separate forsøg,

barer

, Standard fejl (SE). * Signifikans (P 0,05). B) Tetraploide kloner (T3, TD6) og deres diploide modstykker (D3, D81B) var ubehandlet (NT) eller udsættes for CP (20 uM) eller IR (10 Gy) i 72 timer. Procentdelen af ​​celler med sub-G1 DNA (propidiumiodid-farvning) blev bestemt. Vist er de gennemsnitlige resultater fra tre separate forsøg,

barer

, Standard fejl (SE). * Signifikans (P 0,05). C) Den angivne diploide og tetraploide kloner var ubehandlet (NT) eller udsættes for CP (20 uM) eller IR (10 Gy) i 24 timer. p53, p21 og MDM2 proteinniveauer blev bestemt ved immunoblotting og kvantificeret. Tal angiver det relative niveau for hvert protein. Actin blev anvendt som en loading kontrol. D) Den angivne diploide og tetraploide kloner ubehandlede (NT) eller udsat for CP (20 uM) eller IR (10 Gy) i 48 timer. Spaltet PARP og caspase-3 proteinniveauer blev bestemt ved immunblotting og kvantificeret i forhold til den ubehandlede. E) QRT-PCR blev anvendt til at bestemme mRNA-niveauer for de angivne gener i diploide (D3, D81B) og tetraploide (T3, TD6) kloner, som enten var ubehandlede (NT) eller udsættes for CP (20 uM) eller IR (10 Gy ) i 24 timer. Niveauet af hvert mRNA transkript i ubehandlede diploide kloner (D3 NT, D81B NT) blev betragtet som “1,0”, og alle andre værdier er plottet i forhold til den.

Tetraploide kloner er mere modtagelige for p53- afhængig apoptose og vækst anholdelse induceret af Nutlin

det var noget overraskende, at p53 blev induceret sammenligneligt med CP og IR i diploide og tetraploide kloner, på trods af at de tetraploide kloner havnen dobbelt så mange eksemplarer af

P53

genet (FISH, fig 3D). Dette indikerer det niveau, som p53 induceres af CP og IR er ikke afhængig af

P53

kopiantallet, men i stedet kan være begrænset af andre faktorer, måske mængden af ​​beskadiget DNA eller aktiveringen niveau af stress-induceret kinaser, der stabiliserer p53. Ikke desto mindre, vi spekulerede det niveau, som p53 induceres af MDM2 antagonister (f.eks Nutlin) kan afhænge af

P53

kopi nummer, og at tetraploide celler derfor kan udtrykke højere p53 niveauer i respons til Nutlin og være hyper følsomme over for Nutlin-medieret vækstinhibering. For at teste dette, diploid D3 og D81B og deres tetraploid modparter T3 og TD6 blev Nutlin behandlet i 24 timer. P53 og MDM2 proteinniveauer blev bestemt ved immunoblot og mRNA-niveauer bestemmes ved QRT-PCR. Resultaterne viste, at de tetraploide kloner udtrykker forhøjede (~2X mere) p53 og MDM2-mRNA og protein end diploide kloner, både basalt (Fig 5A), og efter 24 timer Nutlin behandling (fig 5C). For at vurdere p53-MDM2 komplekse niveauer blev celler behandlet med proteasominhibitor MG132 at blokere p53 nedbrydning og p53-MDM2 komplekser bestemt ved co-immunoudfældning. Disse undersøgelser viste tetraploide kloner havde flere p53-MDM2 komplekser efter MG132 behandling end de diploide kloner, hvorfra de opstod (Fig 5B). Således tetraploide kloner udtrykker højere niveauer af p53 og MDM2, og indeholder højere niveauer af p53-MDM2 komplekser. Vi spekulerede i tetraploide kloner ville oversætte til højere p53 niveauer efter Nutlin behandling, og en deraf følgende stigning i p53-afhængig G1 anholdelse og apoptose. For at teste dette, vi sammenlignede den relative følsomhed diploide og tetraploide kloner Nutlin-induceret cellecyklusstop eller apoptose. Først blev diploide og tetraploide kloner behandlet med stigende doser af Nutlin (1,0-5,0 uM) i 24 timer. Øget G1 /S-forhold, hvilket afspejler depletion af S-fase celler og en ophobning af celler i G1-fasen, blev anvendt som et mål for Nutlin-induceret G1 arrest. Som vist i fig 6A, de tetraploide kloner som gruppe var mere modtagelige for Nutlin-induceret G1 standsning end parentale celler eller diploide kloner (G1 /S-forhold steg mere med stigende Nutlin doser i tetraploide kloner end parentale eller diploide kloner). Individuel tetraploide kloner T3 og TD6 var også mere modtagelige for Nutlin-induceret G1 standsning end diploide modparter D3 og D81B (Fig 6B). Som vist i fig 6C, blev p53 og p21-protein induceres til højere niveauer og ved lavere Nutlin doser i tetraploide kloner sammenlignet med de diploide kloner. Disse resultater indikerer de tetraploide kloner udtrykker højere niveauer af p53 og p21 efter Nutlin behandling og er mere modtagelige end diploide kloner til Nutlin-induceret G1 anholdelse. Dernæst blev diploide og tetraploide kloner behandlet med en højere Nutlin dosis (20 uM) i 72 timer, og apoptose overvåges af procent celler med sub-G1 DNA-indhold og /eller ekspression af spaltet PARP og spaltes caspase-3. Som vist i fig 6D, tetraploide kloner som gruppe var mere modtagelige for Nutlin-induceret apoptose end diploide kloner. Individuelle tetraploide kloner (T3 og TD6) var også mere modtagelige for Nutlin-induceret apoptose end diploide modparter (D3 og D81B), fremgår af en højere procent sub-G1 celler efter Nutlin behandling og forøget ekspression af spaltet PARP og kløvet caspase-3 ( fig 6E og F).

A) P53 og MDM2 mRNA-niveauer blev sammenlignet i ubehandlede tetraploide kloner (T3, TD6) og deres diploide modstykker (D3, D81B). B) Diploid (D3, D81B) og tetraploid (T3, TD6) kloner var ubehandlet eller behandlet med proteasominhibitor MG132 (10 uM) i 8 timer.

Øvre

Niveauer af MDM2, p53, og actin (lastning kontrol) i ubehandlet og MG132 behandlede celler er vist.

Nedre

For at bestemme niveauer af p53-MDM2 komplekser i diploide og tetraploide celler, proteinlysater blev immunfældet med anti-p53-antistof, efterfulgt af immunoblotting for MDM2. C) Diploid (D3, D81B) og tetraploide (T3, TD6) kloner var ubehandlet eller behandlet med Nutlin (10 uM) i 24 timer. p53 og MDM2 proteinniveauer blev påvist ved immunoblotting og kvantificeres ved hjælp Image-J software. Den relative mængde af p53 og MDM2 protein i de ubehandlede diploide kloner blev givet en værdi på “1,0”. Tal angiver det relative niveau for hvert protein. Actin blev anvendt som en loading kontrol.

A) Fem diploide kloner isoleret fra Nutlin behandlede D3 celler (D3 Diploide) og D8 celler (D8 Diploide) og fem tetraploide kloner isoleret fra Nutlin behandlet D3 celler (D3 Tetraploid) og D8 celler (D8 Tetraploid) var ubehandlet eller behandlet med stigende Nutlin (1,0-5,0 uM) i 24 timer. Den procentvise G1 og S-fase-celler blev bestemt ved flowcytometri, og folden ændring af G1 /S-forhold er plottet. Ubehandlet diploide kloner G1 /S-forholdet blev givet en værdi på 1,0. Vist er gennemsnittet af tre separate forsøg, +/- SE. B) Tetraploide kloner (T3, TD6) og diploide modstykker (D3, D81B) var ubehandlet eller behandlet med Nutlin (1,0-5,0 uM) i 24 timer. Fold ændring i G1 /S-forhold er plottet. Vist er gennemsnittet af tre separate forsøg, +/- SE. C) Diploid (D3, D81B) og tetraploide (T3, TD6) kloner var ubehandlet eller behandlet med stigende Nutlin (1,0-5,0 uM) 24 timer. P53 og p21 proteinniveauer blev kvantificeret under anvendelse af Image-J software. Tal angiver de relative niveauer af hvert protein. P53 og p21-niveauer i ubehandlede diploide kloner blev givet en værdi på “1,0”. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. D) Fem diploide kloner isoleret fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 Diploide) og D8 celler (D8 Diploide) og fem tetraploide kloner isoleret fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 Tetraploide) og D8 celler (D8 Tetraploid) var ubehandlet (NT) eller behandlet med Nutlin (20 uM) 72 timer og apoptose bestemt. Vist er de gennemsnitlige resultater fra tre separate forsøg,

barer

, Standard fejl (SE). * (P 0,05). E) repræsentant diploide (D3, D81B) og tetraploid (T3, TD6) kloner var ubehandlet (NT) eller behandlet med Nutlin (20 uM) i 72 timer. Procentdelen af ​​celler med sub-G1 DNA-indhold (propidiumiodid-farvning) blev bestemt. Vist er de gennemsnitlige resultater fra tre separate forsøg,

barer

, Standard fejl (SE). * Signifikans (P 0,05).