PLoS ONE: Nedsat Angivelse af AZGP1 er associeret med dårlig prognose i Primary Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

2-Zink-glycoprotein 1 (AZGP1) er en tværfaglig protein, der deltager i mange vigtige funktioner i den menneskelige krop, herunder befrugtning, immunregulering og lipid mobilisering. For nylig er det blevet vist, at AZGP1 også er involveret i carcinogenese og tumor differentiering. I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionsniveauerne og prognostisk værdi AZGP1 i primære gastriske cancere.

metoder og resultater

Vi undersøgte ekspressionen af ​​AZGP1 i 35 parrede kræft og matches tilstødende noncancerous gastrisk mucosa væv ved real-time kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og western blotting. Derudover analyserede vi AZGP1 udtryk i 248 patienter, som gennemgik resektion procedurer mellem 2005 og 2007 ved hjælp af immunhistokemi. Forholdet mellem AZGP1 ekspressionsniveauerne blev de klinisk-patologiske faktorer og patientens overlevelse undersøgt. AZGP1 udtryk blev reduceret betydeligt på både mRNA (

P

= 0,023) og protein niveauer (

P

= 0,019) i tumor vævsprøver, sammenlignet med udtryk i matchede tilstødende ikke-tumor vævsprøver . De immunohistokemisk farvning viste, at AZGP1 ekspression blev signifikant reduceret i 52,8% (131/248) af gastrisk adenocarcinom tilfælde. Klinisk-patologisk analyse viste, at den reducerede ekspression af AZGP1 var signifikant korreleret med tumor placering (

P

= 0,011), histologisk bedømmelse (

P

= 0,005) og T trin (

P

= 0,008). Kaplan-Meier-overlevelseskurver afslørede, at den reducerede ekspression af AZGP1 var forbundet med en dårlig prognose i gastrisk adenocarcinom patienter (

P

= 0,009). Multivariat Cox-analyse identificeret AZGP1 udtryk var en uafhængig prognostisk faktor for samlet overlevelse af gastrisk adenocarcinom patienter (HR = 1,681, 95% CI = 1,134-2,494,

P

= 0,011).

Konklusioner

Vores undersøgelse tyder på, at AZGP1 kunne tjene som kandidat tumor suppressor og en potentiel prognostisk biomarkør i gastrisk carcinogenese

Henvisning:. Huang Cy, Zhao Jj, Lv L, Chen Yb, Li YF, Jiang ss, et al. (2013) Nedsat Angivelse af AZGP1 er associeret med dårlig prognose i Primary Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10,1371 /journal.pone.0069155

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Marts 5, 2013; Accepteret: 5 juni 2013; Udgivet: 23 Jul 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Doctoral fonden af ​​Undervisningsministeriets Kina (20100171110084). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, med 988,000 nye tilfælde og 736,000 dødsfald om året [1] – [2]. I Kina blev mavekræft forventes at være den tredje mest almindelige kræftform i 2005 med 0,4 millioner nye tilfælde og 0,3 millioner dødsfald rapporteret [3]. Behandling af gastrisk cancer indbefatter en kombination af kirurgi, kemoterapi og strålebehandling. Men næsten 60% af berørte patienter bukker under for mavekræft efter en kurativ resektion alene eller efter en kurativ resektion med efterfølgende adjuverende behandling [4]. Gastrisk cancer er en heterogen sygdom i både histologi og genetik; dermed patient resultat er vanskeligt at forudsige bruge klassiske histologiske klassifikationer. Gastrisk carcinogenese er en multifaktoriel og flertrinsproces, der involverer aktivering af onkogener og inaktivere tumorsuppressorgener i forskellige stadier af mavekræft progression. Senest er flere nye onkogener og tumor-suppressor gener associeret med gastrisk cancer blevet identificeret. Derfor er det klinisk vigtigt at finde effektive nye mål for tidlig diagnosticering og effektiv behandling af gastrisk cancer.

AZGP1 (2-zink-glycoprotein 1, Zn-alpha 2-glycoprotein) er et 41 kDa opløseligt protein med en større histokompatibilitetskompleks-1 (MHC-1) -lignende fold i sin struktur, og det blev oprindeligt identificeret og oprenset i humant serum i 1961 [5]. Genet for AZGP1, overdraget til kromosomet 7q22.1 gennem fluorescerende hybridisering karyotypering, består af fire exoner og tre introner [6], [7]. Brug af immunhistokemiske undersøgelser har det vist sig, at AZGP1 hovedsagelig udtrykkes i epitelceller i bryst, prostata, leveren og forskellige andre gastrointestinale organer [8]. I overensstemmelse med sin produktion af sekretoriske epitelceller er AZGP1 findes i en række af kropsvæsker [9], [10], [11].

AZGP1 er en tværfaglig protein, der deltager i mange vigtige funktioner i menneskelige krop, herunder befrugtning [11], immunregulering [12] og lipid mobilisering [13], [14], [15]. AZGP1 er også forbundet med cancer kakeksi. AZGP1 har et højt niveau af aminosyresekvens-homologi med tumor-afledt lipid-mobiliserende faktor [14], og i en musemodel for AZGP1-producerende tumorer, AZGP1 stimuleret lipolyse i adipocytter fører til cachexia [16]. For nylig er det blevet vist, at AZGP1 også er involveret i carcinogenese og tumor differentiering. Protein- og mRNA-ekspression assays er vist forholdet mellem AZGP1 niveauer og histologiske af brystkræfttumorer [17], [18]. Desuden har mange undersøgelser antyder, at AZGP1 er en potentiel serum markør for prostatacancer [9], [19]. Desuden er det blevet vist, at AZGP1 fungerer som en hidtil ukendt tumor suppressor i pancreascancer [20]. Imidlertid har hidtil ekspressionen status AZGP1 og prognostisk værdi af dette protein i primære gastriske cancere ikke blevet rapporteret.

I denne undersøgelse analyserede vi AZGP1 ekspressionsniveau i gastriske cancere ved hjælp af real-time kvantitativ RT -PCR (QRT-PCR), western blotting og immunhistokemi. Desuden identificerede vi forholdet mellem AZGP1 udtryk og de klinisk-patologiske træk af mavekræft, og vi evaluerede den prognostiske værdi af AZGP1 udtryk for post-resektion overlevelse mavecancerpatienter.

Resultater

AZGP1 mRNA Expression Analyseret med QRT-PCR

De transkriptionelle niveauer af AZGP1 blev bestemt med QRT-PCR-assays under anvendelse af 35 par af resektion prøver (prøver tumor væv og matchede tilstødende ikke-tumor vævsprøver) fra mavens kræftpatienter. De AZGP1 mRNA niveauer blev signifikant reduceret i 28 (80%) tumor vævsprøver sammenlignet med matchede tilstødende ikke-tumor vævsprøver (

P

= 0,023, figur 1).

Relativ udtryk for AZGP1 i gastrisk cancer tumorvæv sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv (n = 35) vurderes ved QRT-PCR (

P

= 0,023).

AZGP1 Expression analyseret ved Western Blotting

AZGP1 proteinniveauer i de operativt fjernede gastriske cancer prøver blev bestemt ved western blotting. Resultaterne viste et bånd for AZGP1 ved 41 kDa, og mængden af ​​AZGP1 protein til stede blev målt ved densitometri og højde. I overensstemmelse med QRT-PCR-resultater, blev et fald i AZGP1 udtryk observeret i 25 (71,4%) af de gastriske tumorvæv sammenlignet med de matchede tilstødende ikke-tumorvæv (

P

= 0,019, figur 2A). Otte par repræsentative gastriske tumorvæv og den matchende tilstødende ikke-tumorvæv blev vist i figur 2B.

(A) De relative AZGP1 protein ekspressionsniveauer blev signifikant reduceret i gastrisk cancer væv sammenlignet med den matchede tilstødende ikke- tumorform væv (n = 35,

P

= 0,019); (B) Repræsentative resultater af western blotting analyse af AZGP1 proteinekspression i otte gastrisk kræft væv (T) og de matchede tilstødende ikke-tumorform væv (N).

immunhistokemisk analyse af AZGP1 Expression i Gastric Cancer vævsprøver og dets forhold til den klinisk-patologisk Features

for at bekræfte de molekylærbiologiske resultater og undersøge klinisk-patologiske de prognostiske roller AZGP1 udtryk, vi udførte immunhistokemisk analyse i 248 paraffinindlejrede mavekræft sektioner. Den positive ekspression af AZGP1 blev lokaliseret til cytoplasmaet (figur S1). Blandt de 248 mavekræft prøver, 117 (47,2%) viste høj AZGP1 udtryk (AZGP1 ++ eller AZGP1 +++), mens de resterende 131 sager (52,8%), der vises lav AZGP1 udtryk (AZGP1- eller AZGP1 +) (Figur 3, tabel 1). Normale gastrisk væv viste den stærkeste AZGP1 positiv farvning (figur 3A)

(A) Normale gastrisk væv, scoret som AZGP1 (+++). (B) gastrisk kræft, scoret som AZGP1 (+++) ; (C) gastrisk cancer, scoret som AZGP1 (++), (D) gastrisk cancer, scoret som AZGP1 (+); og (E) mavekræft, scoret som AZGP1 (-). Original forstørrelse: A – D × 200.

Baseret på de kategorier, som vi definerede i de førnævnte metoder, viste data, at den lave udtryk for AZGP1 var signifikant korreleret med tumor placering (

P

= 0,011), histologisk bedømmelse (

P

= 0,005) og T fase (

P

= 0,008), men ikke med alder, køn, tumorstørrelse, radikal resektion, nodal status (N stadium) eller metastase status (M stadium). Mikrografierne er vist i figur 3.

Sammenhæng mellem AZGP1 Expression Baseret på Immunhistokemi og Patient Survival

Den mediane overlevelse af de 248 mavecancerpatienter var 45 måneder (interval 2-89 måneder) . Den samlede overlevelsesrate og 5-årige overlevelsesrate var signifikant forbedret i høj AZGP1 udtryk gruppe end den lave udtryk gruppen [64,2% vs. 49,5% (samlet overlevelse) og 65,1% vs. 50,4% (5-års overlevelse), henholdsvis

P

= 0,009, figur 4].

lav udtryk for AZGP1 korreleret med dårlig patient overlevelse. Patienter i den høje AZGP1 udtryk udviste signifikant bedre overlevelse end den lave AZGP1 udtrykket gruppe (log-rank test:

P =

0,009).

Univariate og Multivariate analyser

univariate og multivariate analyser blev udført for at sammenligne virkningen af ​​AZGP1 udtryk og andre klinisk-patologiske parametre på prognose. Baseret på en univariat analyse, der omfattede alle 248 patienter blev 8 faktorer sig at have statistisk signifikante associationer med den samlede overlevelse. Denne analyse tog følgende faktorer i betragtning: tumor placering, tumor størrelse, histologisk kvalitet, AZGP1 udtryk niveauer, TNM stadie (7. udgave TNM klassifikation), og hvorvidt en radikal resektion blev udført (tabel 2). Alle 8 faktorer indgik i en multivariat Cox proportionel risiko model til at justere for effekten af ​​de kovariater. Baseret på denne model, tumor placering, AZGP1 ekspressionsniveauer, T scenen og N stadium af tumoren blev bekræftet som uafhængige prognostiske faktorer (tabel 2).

Discussion

mavekræft fortsat et af de mest dødbringende menneskelige maligniteter. Selv med fremskridt inden for diagnosticering og terapi, er prognosen for mavecancer stadig trist [1], [21]. Det kliniske udfald af mavekræft afhænger af en række tumor egenskaber, såsom tumorvækst, differentiering, invasion og metastase fjernt, som er reguleret af en række beslægtede gener. Derfor er det den generelle opfattelse, at genetiske ændringer, der fører til aktivering af onkogener og inaktivering af tumorsuppressorer er de underliggende årsager til kræft patogenese. Den sekventielle gevinst på onkogener og tab af tumorsuppressorer giver det nødvendige grundlag for den trinvise progression af solide tumorer fra start til transformation og tumorprogression [22], [23], [24]. Tidligere AZGP1 er blevet rapporteret at besidde tumor suppressive egenskaber i brystcancer, prostatacancer, pancreascancer og nogle andre maligne tumorer [17], [20], [25]; dog rolle AZGP1 i primær mavekræft er endnu ikke blevet evalueret. Vores undersøgelse viste, at AZGP1 ekspression blev signifikant reduceret på både mRNA og protein niveauer i tumorvæv prøver sammenlignet med ekspression i matchede tilstødende ikke-tumor vævsprøver. I overensstemmelse med vores undersøgelse, Brysk MM et al. også vist, at de AZGP1 er højere i normale orale væv end i orale tumorer [26]. Gagnon S et al. også vist, at AZGP1 var til stede i godartede hyperplastiske kirtler i 91,1% af tilfældene, men kun 40,7% (dårligt differentieret komponent) til 48,5% (godt differentieret komponent) af prostata adenokarcinomer og kun 8% af metastaser [27]. Disse undersøgelsens resultater understøtter den hypotese, at AZGP1 kan tjene som en tumor suppressor i nogle kræftformer.

For yderligere at validere denne reduktion af AZGP1 udtryk i primær gastrisk kræft, vi udførte immunhistokemisk analyse med en kanin anti-hAZGP1 antistof. Vi observerede lavere ekspression af AZGP1 immunofarvning i proximal eller total gastrisk cancer sammenlignet med fjerne mavekræft væv. Nogle undersøgelser har vist, at proksimale gastrisk kræftpatienter har en dårligere overlevelse end fjerne mavecancerpatienter [28]. Disse data antydede, at den lave ekspression af AZGP1 i mavekræft er forbundet med flere maligne fænotyper. Desuden har vi opdaget, at nedsat ekspression af AZGP1 var forbundet med dårligt differentieret adenocarcinomer (G3 vs. G1 /G2), hvilket indikerer, at AZGP1 kan inducere differentieringen af ​​mavekræft. Disse resultater er i overensstemmelse med resultaterne fra Diez et al. [17], [18] der beskrev en sammenhæng mellem høj AZGP1 udtryk og høje niveauer af differentiering i brystkræft. Lignende resultater er også blevet rapporteret for prostatacancer [19], brystcancer og pancreascancer [26]. Desuden har vi opdaget, at den lave udtryk for AZGP1 var forbundet med fremskreden T scene. Disse resultater antydede, at den lave ekspression af AZGP1 kan fremme tumorvækst. I overensstemmelse med vores undersøgelse, Irmak S et al. foreslog, at AZGP1 er relateret til udviklingen af ​​overfladisk blærecancer og dets omdannelse til en invasiv fænotype [29]. Disse fund kollektivt indikerer en vigtig rolle for AZGP1 i differentieringen og væksten af ​​mavekræft.

Brug af Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, patienter i vores undersøgelse med lav AZGP1 udtryk havde en betydeligt kortere samlet overlevelse end dem med høj ekspressionsniveauer. Univariate analyser viste, at nedsat ekspression af AZGP1 i gastrisk cancer væv var signifikant associeret med den samlede overlevelsesrate og 5-årige overlevelsesrate. Multivariat analyse viste, at AZGP1 ekspression, sammen med nogle traditionelle prognostiske faktorer som placering af tumor, T scenen og N stadium var uafhængige risikofaktorer i prognosen af ​​mavecancerpatienter. Disse resultater antydede, at AZGP1 kunne tjene som en ny indikator for prognose i mavecancerpatienter efter kirurgisk resektion.

De molekylære mekanismer i AZGP1 s tumor undertrykkende egenskaber er stadig uklart. AZGP1 tilhører makroglobulin familien, en gammel og evolutionært konservativ link af immunsystemet. Zorin NA et al. foreslog, at kapaciteten for macroglobulins for binding hydrolaser gør inhibering af enzym-medieret tumorinvasion muligt [30]. Samtidig kan et overskud af makroglobulin /hydrolase komplekser aktiverer apoptose [31]. Han N et al. rapporterede, at AZGP1 også nedregulerer cyclin-afhængig kinase, der er ansvarlig for regulering af G2-M overgang, et hastighedsbegrænsende trin i cellecyklussen. Dette antyder, at AZGP1 indirekte spiller en rolle i at hindre tumorudvikling [32]. AZGP1 blev foreslået som en tumorsuppressor i bugspytkirtelkræft af Kong B. et al. Deres undersøgelse antydede, at AZGP1 genet inducerer mesenchymal-til-epitel transdifferentiering ved at inhibere TGF-b-medieret ERK-signalering [20]. Den funktionelle rolle og mekanismer i AZGP1 i mavekræft brug for yderligere undersøgelse.

Som konklusion, vi først undersøgte ekspressionsniveauerne og prognostisk værdi AZGP1 i primære gastrisk kræft i denne undersøgelse. Vores undersøgelsens resultater antydede, at AZGP1 kunne tjene som kandidat tumorsuppressor og prognostisk biomarkør i primære gastrisk kræft og være et potentielt mål for terapeutisk intervention; Men de molekylære mekanismer involveret i reguleringen af ​​AZGP1 i mavekræft berettiger yderligere undersøgelser.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne forskning blev godkendt af den etiske komité for Sun Yat-sen University Cancer center, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient involveret i undersøgelsen.

Menneskelig vævsprøve

s

i alt 35 parrede kræft og matchede tilstødende noncancerous maveslimhinden væv blev indsamlet fra gastrisk kræftpatienter i gastrektomi på Sun Yat-sen University Cancer center fra 2010 til 2011. Efter kirurgisk resektion blev de friske væv straks nedsænket i RNAlater (Ambion, Inc., USA) for at undgå RNA-nedbrydning, opbevaret ved 4 ° C natten over for at tillade grundig indtrængen af ​​RNAlater i vævet og derefter nedfrosset ved -80 ° C indtil RNA og protein-ekstraktion blev udført. Yderligere 248 paraffinindlejrede primære gastrisk karcinom prøver, der var blevet indsamlet mellem 2005 og 2007 blev opnået fra Sun Yat-sen University Cancer Center. Ingen af ​​disse patienter havde fået strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. Den histopatologiske type og stadium af mavekræft blev bestemt i henhold til kriterierne i World Health Organization klassificering og TNM scenen sat ud af Unionen for International Cancer Control.

Udvinding af Total RNA og Real-time kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) ifølge producentens protokol. Den totale RNA-koncentrationen blev vurderet ved at måle absorbansen ved 260 nm ved anvendelse af en NANO DROP spektrofotometer (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Revers transkription (RT) at syntetisere den første streng af cDNA blev udført under anvendelse af 2 ug totalt RNA behandlet med M-MLV revers transkriptase (Promega, USA) ifølge producentens anbefalinger. Det resulterende cDNA blev derefter underkastet kvantitativ reel-tid RT-PCR for evaluering af de relative mRNA-niveauer af AZGP1 og GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, som en intern kontrol) med følgende primere: AZGP1 fremad: 5′-GGAAGCAGGACAGCCAACTT 3 ‘, og revers: 5′-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3′; GAPDH fremad: 5’-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ‘, og omvendt: 5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’. Gene-specifik amplifikation blev udført under anvendelse af et ABI 7900HT realtids-PCR-systemet (Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA) med en 15-pi PCR-blanding indeholdende 0,5 pi cDNA, 7,5 pi 2 × SYBR Green Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA), og 200 nM af de passende oligonukleotidprimere. Blandingen blev forvarmet ved 95 ° C (10 min) og derefter amplificeret ved 95 ° C (30 sek) og 60 ° C (1 min) i 45 cykler. Kurven opløsning blev målt ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 15 sek og 95 ° C i 15 sek. Ct (tærskelcyklus) værdien af ​​hver prøve blev beregnet ud fra de tærskelværdier cykler med instrumentets software (SDS 2.3), og den relative ekspression af AZGP1 mRNA blev normaliseret til GAPDH værdi. Data blev analyseret ved hjælp af den komparative tærskel cyklus (2

-ΔCt) metode som den følgende formel: Relativ udtryk niveau = 2

-ΔCt = 2

-Ct (GAPDH) – 2

-Ct (AZGP1), hvor Ct (GAPDH) forstås Ct værdien af ​​GAPDH og Ct (AZGP1) forstås Ct værdi AZGP1.

Western Blotting Analysis

de homogeniserede mavekræft prøver, herunder tumor- og ikke væv, blev lyseret i RIPA-lysepuffer, og lysaterne blev høstet ved centrifugering (12.000 rpm) ved 4 ° C i 30 minutter. Ca. 20 ug protein prøver blev derefter separeret ved elektroforese i en 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel og overført til en polyvinylidenfluorid membraner. Efter blokering af de ikke-specifikke bindingssteder i 60 min med 5% fedtfri mælk blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med et kanin monoklonalt antistof mod AZGP1 (PTG Company, USA, ved en 1:200 fortynding). Membranerne blev derefter vasket tre gange med TBST (Tris-bufret saltvand med Tween-20) i 10 minutter og probet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret gede-anti-kanin IgG-antistof (Immunology Consultants Laboratory, USA, ved en 1: 2000 fortynding) ved 37 ° C i 1 time. Efter tre vaske blev membranerne udviklet af en forøget kemiluminescens-systemet (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Bandet intensitet blev målt ved densitometri under anvendelse af Mængde One software (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). De protein niveauer blev normaliseret til den for GAPDH opdaget ved hjælp af en muse-anti-humant GAPDH monoklonalt antistof (Shanghai Kangchen, Kina, på en 1:10000 fortynding).

Immunhistokemi Analyse

The vævssnit blev afparaffiniseret med dimethylbenzen og rehydreret gennem 100%, 95%, 90%, 80% og 70% ethanol. Efter tre vaske i PBS (phosphatpufret saltopløsning) blev objektglassene kogt i antigen-genvinding puffer indeholdende 0,01 M natriumcitrat-saltsyre (pH = 6,0) i 15 min i en mikrobølgeovn. Efter skylning med PBS blev vævssnit inkuberet med det primære antistof og objektglassene blev derefter skyllet i 3% peroxidase quenching-opløsning (Invitrogen) for at blokere endogen peroxidase. Snittene blev derefter inkuberet med et kanin-monoklonalt antistof mod AZGP1 (PTG Company, USA, ved en 1:200 fortynding) ved 4 ° C natten over og derefter inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) ved stuetemperatur i 30 min. Efter vask i PBS blev visualisering signal fremkaldt med 3, 3′-diaminobenzidin (DAB) opløsning, og alle dias blev modfarvet med hematoxylin. Som negative kontroller blev tilstødende sektioner behandlet som beskrevet ovenfor, bortset fra at de blev inkuberet natten over ved 4 ° C i blokeringsopløsning uden det primære antistof.

Prøverne blev analyseret ved tre observatører (Chunyu Huang, Lin Lv, og Jingjing Zhao), som blev blindet for patienternes kliniske resultater. Uoverensstemmelser mellem observatørerne blev fundet i mindre end 10% af de undersøgte dias, og konsensus blev nået efter yderligere gennemgang. Den samlede AZGP1 immunfarvning score blev beregnet som summen af ​​den procentvise positivitet (procentdelen af ​​de positivt farvede tumorceller) og farvningsintensitet. Den procent positivitet blev scoret som “0” ( 5%, negativ), “1” (5-25%, sporadisk), “2” (25-50%, fokal), eller “3” ( 50 %, diffuse). Den farvningsintensitet blev scoret som “0” (ingen farvning), “1” (svagt farvet), “2” (moderat farvet), eller “3” (stærkt farvet). Den samlede AZGP1 immunfarvning score varierede fra 0 til 9. Vi definerede AZGP1 ekspressionsniveauerne som følger: “-” for en score på 0-1, “+” for en score på 2-3, der blev defineret som lav udtryk; “++” For en score på 4-6, og “+++” for en score . 6, der blev defineret som høj ekspression

Opfølgning

postoperative opfølgning -up blev udført på vores ambulatorium og omfattede kliniske og laboratorieundersøgelser hver 3. måned i de første 2 år, hver 6. måned i tredje til femte år, og årligt i yderligere 5 år, eller indtil patienten død, alt efter hvad fandt sted først. Samlet overlevelse, der blev defineret som tiden fra den operation patientens død eller den sidste opfølgning, blev anvendt som et mål for prognose. Der var omkring 4% af patienterne mistede opfølgning.

Statistisk analyse

en parret-prøver t-test blev anvendt til at sammenligne de AZGP1 mRNA-niveauer i tumor vævsprøver og den tilstødende ikke de tumor vævsprøver.

χ

2 test for proportioner og Pearsons korrelationskoefficienter blev brugt til at analysere forholdet mellem AZGP1 udtryk og diverse klinisk-patologiske karakteristika. Total overlevelse kurver blev beregnet med Kaplan-Meier-metoden og blev analyseret med log-rank test. Cox proportional-hazard analyse blev anvendt til univariate og multivariate analyse til at undersøge effekten af ​​klinisk-patologiske variabler og AZGP1 udtryk på overlevelse. En to-sidet

P

-værdi 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført med SPSS-software (version 17,0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Støtte Information

Figur S1.

Immunhistokemisk påvisning af AZGP1 proteinekspression i gastrisk cancer væv. Den positive udtryk for AZGP1 blev lokaliseret til cytoplasmaet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0069155.s001

(TIF)