PLoS ONE: Etablering af en patient-afledt ortotopisk xenograft (PDOX) Model af HER-2-positive Livmoderhalskræft Udtrykker Klinisk Metastatisk Mønster

Abstrakt

Planocellulært karcinom i livmoderhalsen, meget udbredt i udviklingslandene, er ofte metastatisk og behandlingsresistent med ingen standard behandling protokol. Vores laboratorium pioner patienten-afledte ortotopisk xenograft (PDOX) nøgen musemodel med teknikken af ​​kirurgisk ortotopisk implantation (SOI). I modsætning til subkutane transplantation patient-afledt xenograft (PDX) modeller, PDOX modeller metastaserer. Vigtigst, metastase mønster korrelerer til patienten. I nærværende rapport, beskriver vi udviklingen af ​​en PDOX model af HER-2-positive livmoderhalskræft. Metastase efter SOI i nøgne mus omfattede peritoneal formidling, levermetastaser, lunge metastase samt lymfeknudemetastaser afspejler den metastatiske mønster i donor patient. Metastase blev påvist i 4 af 6 nøgne mus med primære tumorer. Primære tumorer og metastaser i nøgne mus havde histologiske strukturer ligner den oprindelige tumor og blev farvet med et anti-HER-2-antistof i det samme mønster som patientens cancer. Den metastatiske mønster, histologi og HER-2 tumor udtryk for patienten blev således bevaret i PDOX modellen. I modsætning hertil subkutan transplantation af patientens cervikale tumorer resulterede i primær vækst, men ikke metastase

Henvisning:. Hiroshima Y, Zhang Y, Zhang N, Maawy A, Mii S, Yamamoto M, et al. (2015) Etablering af en Model Patient-Afledt ortotopisk xenograft (PDOX) af HER-2-positive Livmoderhalskræft Udtrykker Klinisk Metastatisk Mønster. PLoS ONE 10 (2): e0117417. doi: 10,1371 /journal.pone.0117417

Academic Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: August 21, 2014 Accepteret: December 22, 2014; Publiceret: 17 feb 2015

Copyright: © 2015 Hiroshima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet delvist af National Cancer Institute tilskud numre CA CA132971 og CA142669 og JSP’er KAKENHI tilskud numrene 26830081 til YH, 26462070 til IE og 24592009 til KT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Yong Zhang og Nan Zhang er medarbejdere i AntiCancer Inc. Yukihiko Hiroshima, Mako Yamamoto, Shinji Miwa, shuya Yano, Takashi Murakami og Robert M. Hoffman er ubetalte datterselskaber af AntiCancer Inc. Sumiyuki Mii, Fuminari Uehara, Masashi Momiyama og Takashi Chishima var tidligere afdelinger af AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. markedsfører dyremodeller for kræft. Der er ikke andre konkurrerende interesser. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Medforfatter, Robert M.Hoffman, er en PLoS ONE Editorial Board Medlem Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Livmoderhalskræft er verdensomspændende den anden mest almindelige kræftform hos kvinder med størstedelen af ​​pladecellekræft (SCC) [1] resulterer i 454,000 tilfælde og 200.000 dødsfald om året i 2010. Hyppige metastatiske steder er bækken lymfeknuder, para-aorta lymfeknuder, lunger, ekstra bækken lymfeknuder, lever og knogler [2]. Ca. 11.000 nye tilfælde og 3.870 dødsfald forekomme for cervikal carcinoma i USA [3]. Stage og nodal metastaser er relateret til den samlede overlevelse [4]. Kemoterapi lægemidler, der anvendes for livmoderhalskræft omfatter: paclitaxel, carboplatin, cisplatin, bleomycin, mitomycin-C, vincristin og irinotecan [5]. Retinoider og interferon i kombination med cytotoksisk kemoterapi, har vist sig at være effektiv [6]. Imidlertid er der ingen standard behandling for metastatisk livmoderhalskræft. Derfor kunne en patient-lignende musemodel af livmoderhalskræft være meget nyttig.

Vores laboratorium pioner patienten-afledte ortotopisk xenograft (PDOX) nøgen musemodel med teknikken af ​​kirurgisk ortotopisk implantation (SOI) [7- 21]. I modsætning til subkutan transplantation patient-afledte xenograft (PDX) modeller, PDOX modeller metastaserer. Vigtigst, metastase mønster korrelerer til patienten.

Histologisk intakte humane colon-cancer prøvemateriale kirurgisk fra patienter blev implanteret ved SOI til colon eller coecum af nøgne mus. Omfattende vækst på colon i 13 af 20 tilfælde af implanterede patientens colontumorer blev observeret med efterfølgende regionalt, lymfe-knude, og levermetastaser, samt generel abdominal carcinomatose [7].

SOI af histologisk intakt pancreas -cancer prøver til nøgen-mus bugspytkirtlen, resulterede i et metastatisk mønster, der ligner den kliniske mønster herunder lokal tumorvækst, der strækker sig til maven og tolvfingertarmen, metastaser til leveren og regionale lymfeknuder, og fjernmetastaser til binyrerne, membran og mediastinale lymfeknuder. En 100% take rate blev demonstreret i 5 tilfælde, af i alt 17 mus transplanteret, 15 understøttede tumorvækst. Immunohistokemisk analyse af de transplanterede humane pankreatiske tumorer udviste et lignende mønster af ekspression tumorassocieret glycoprotein 72 og carcinoembryonisk antigen i de transplanterede tumorer og den oprindelige kirurgisk biopsi [8].

Histologisk-intakte patientprøver af ovariecancer var udviklet af SOI under kapslen af ​​den nøgne mus æggestok. Tumorerne voksede lokalt med en efterfølgende patient-lignende metastatisk mønster, herunder parietal peritoneum, colon, omentum, og ascites [10].

Histologisk-intakt patient brysttumorvæv blev transplanteret til den brystfedtpuden af ​​nøgen mus ved SOI hvor tumorvævet voksede udførligt og metastaseret til lungen [11].

En patient-lignende metastatisk model af human lungecancer konstrueret blev udviklet med SOI via torakotomi i immunsvækkede mus [9]. Tumorer blev transplanteret ind i venstre lunge i alle disse forsøgsdyr. Den venstre lunge blev anvendt til tumorimplantation af 2 grunde: (1) tab af lungefunktion er mindre i den venstre lunge end i højre lunge under kirurgi. De venstre-lunge-opererede dyr overlever proceduren bedre. (2) Den venstre lunge hos mus har en lap, så tumorer til let at udvikle sig efter implantation [9]. Når en dårligt differentieret store celle pladecellekræft celler patient tumor 2268 blev implanteret til venstre lunge af SOI direkte fra kirurgi, 5 ud af 5 mus produceres lokalt dyrkede tumorer, i en gennemsnitlig tid på 61 dage. Modsat-lunge-metastaser indtraf, samt lymfe-node metastaser. De primære tumorer og metastaser i mus opretholdt deres store-celle-squamous-cellemorfologi. Når subkutant implanterede tumorer voksede kun lokalt i 2 af 4 dyr og blev ikke observeret nogen metastaser [9].

I et klinisk korrelativ undersøgelse af 20 tilfælde af mavekræft, der voksede i nøgne mus, 5 havde kliniske levermetastaser og alle 5 tilfælde resulterede i levermetastaser i nøgne mus. Af de 20 tilfælde, 6 havde klinisk peritoneal inddragelse af deres tumor, og af disse, 5 resulterede i peritoneal metastase i de nøgne mus. Der var statistisk signifikante korrelationer til både levermetastaser og peritoneal involvering mellem patienter og mus [12].

I denne rapport beskriver vi udviklingen af ​​en PDOX model af HER-2-positive livmoderhalskræft med en metastatisk mønster, der svarer til patientens donor.

Materialer og metoder

Dyr

Female atymiske (

nu /nu

) NCR nøgne mus (AntiCancer, Inc. , San Diego, CA), 4-6 uger gamle, blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev holdt i en barriere facilitet under HEPA filtrering. Mus blev fodret med autoklaveret laboratorium gnaver kost. Alle mus kirurgiske procedurer og billeddannelse blev udført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injektion af en 0,02 ml opløsning af 50% ketamin, 38% xylazin, og 12% acepromazinmaleat. Alle dyr blev udført med et anticancer Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) -protokol specifikt er godkendt til denne undersøgelse, og i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er beskrevet i National Institute of Health Guide for pasning og anvendelse af dyr under Assurance Number A3873-1.

Prøvetagning

patienten forudsat skriftligt informeret samtykke og tumor prøve blev indkøbt under godkendelsen af ​​Institutional Review Board of University of California San Diego.

orthotopisk og subkutant implantation af patient afledt xenograftmodel af livmoderhalskræft

tumorvæv blev opnået fra HER-2-positive livmoderhalskræft patient på kirurgi og skåret i fragmenter (3-mm

3) og transplanteres subkutant i nøgne mus både subkutant og orthotopisk.

i ortotopisk transplantation blev en lille midtlinjeincision (6- til 10-mm) fremstillet mod underlivet af musen gennem huden og peritoneum. Livmoderen blev blotlagt gennem denne incision, og en enkelt tumor fragment (3 mm

3) blev syet på livmoderhalsen af ​​livmoderen under anvendelse 8-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon; Ethicon Inc., NJ, USA). Ved afslutningen blev livmoderen returneres til abdomen, og snittet blev lukket i et lag under anvendelse af 6-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon) [7, 13].

Tissue histologi

Tumor væv blev fjernet med omgivende normale væv ved resektion. Vævene blev fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin før sektionering og farvning. Vævssnit (3 um) blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i en ethanol-serien. Hematoxylin og eosin (H Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) ved 4 ° C natten over. Bindingen af ​​primære antistoffer blev påvist ved anvendelse af anti-kanin sekundære antistoffer og avidin /biotin /peberrodsperoxidasekompleks (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) i 30 minutter ved stuetemperatur. De mærkede antigener blev visualiseret med DAB kit (DAKO Cytomation). Endelig blev snittene modfarvet med hematoxylin og undersøgt under anvendelse af et BH-2 mikroskop (Olympus Corp., Tokyo, Japan) forsynet med en INFINITY1 2,0 megapixel CMOS digitalkamera (Lumenera Corporation, Ottawa, Canada). Alle billeder blev erhvervet ved hjælp INFINITY ANALYSÉR software (Lumenera Corporation) uden post-erhvervelse forarbejdning.

Statistisk analyse

PASWStatistics 18,0 (SPSS, Inc.) blev anvendt til statistiske analyser. Korrelationer blev undersøgt under anvendelse af Fishers eksakte test. En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant for alle sammenligninger.

Resultater og Diskussion

Den PDOX, men ikke PDX, model af livmoderhalskræft efterligner patienten metastatisk mønster

Efter subkutan transplantation i nøgne mus af patientens cervikale tumor, tumorvækst skete i 7 af 10 mus, men ingen metastaser forekom i nogen mus (tabel 1). Primære tumorer voksede i 6 af 8 nøgne mus efter ortotopisk implantation og metastase voksede i 4 mus (tabel 1). Metastase i nøgne mus omfattede peritoneal formidling, levermetastaser, lunge metastase samt para-aorta lymfeknudemetastase) (fig. 1) (tabel 2). Patienten havde metastaser i para-aorta lymfeknuder, peritoneum, lever og messentary. Derfor PDOX model efterlignede patienterne tumorer metastatisk mønster og den subkutane PDX modellen havde ingen metastaser. Vækstraten for den primære tumor var hurtig, fordobling i 10-15 dage i løbet af 36-dages vækst periode (fig. 2). Eksempler på størrelser og former af de forskellige metastase på forskellige organer var som følger: En rund levermetastaser (8,5 mm x 8,3 mm) (. Figur 1E); to lungemetastaser (1,3 mm x 1,0 mm [ovale]; 1,1 mm x 1,1 mm [rund]) (. Fig 1F); og to para-aorta lymfeknudemetastaser (4,0 mm x 2,3 mm [ovale] 4,6 mm × 2,1 mm [oval]) (Fig 1 H.). I fremtidige eksperimenter, vil vi overvåge væksten af ​​metastaser fra livmoderhalskræft ved intravital såvel som ikke-invasiv billeddannelse [15-17].

(A) Hele kroppen billeddannelse af den nøgen mus orthotopisk transplanteret patientens livmoderhalskræft prøven tre månedlige tidligere. Abdomen blev udspilet med tumoren. (B) Billeder fra laparotomi. Den store primære tumor blev fusioneret med peritonealt-formidlet tumorer (gule pile). Engorged knude i leveren er en levermetastase (blå pile). Peritoneal udbredelse blev fundet i subfreniske rum (hvide pile). (C) Billede torakotomi. To hvide knuder blev påvist i den nedre lap af højre lunge (sorte pile). (D) Udskårne eksemplarer af primær tumor. Den primære tumor blev fusioneret med peritonealt-disseminerede tumorer. (E) skåret levermetastaser prøver. Øverst til højre indsatte viser den afskårne overflade af tumor. (F) Udskårne lunge metastase prøver. To hvide knuder blev påvist i nedre lap af højre lunge (sorte pile). (G og H) Billeder af en nøgen mus udvikler para-aorta lymfeknudemetastase. Den primære tumor opslugt blæren (gule pile). Efter fjernelse af den primære tumor, kunne para-aorta lymfeknudemetastaser detekteres (sorte pile). SP: milt, STM: mave, SMI: tyndtarm, Eso: spiserør, KD: nyre. Scale barer, 10 mm

tumor diameter blev målt med skydelærer og volumen beregnes ved hjælp af følgende formel:.. 4 /3π ● (d /2)

2 ● D /2

Histologi af den oprindelige tumor er bevaret i muse

Sheet-lignende vækst uden kirtel dannelse og stromale væv med fibroblastisk spredning, der trængte ind i reder carcinoma blev observeret i H E farvede snit af den oprindelige tumor (fig. 3A). Ovalt til tenformede cancerceller med høj nukleare /cytoplasma-forhold blev fundet i høj forstørrelse billeder (fig. 3B). I de immunfarvede sektioner med anti-HER-2-antistof, blev membranen og cytoplasma i cancerceller stærkt farves men ingen farvning blev fundet i det stromale væv (fig. 3C og 3D). Alle mus-dyrket livmoderhalskræft patient tumor herunder metastatiske tumorer havde histologiske strukturer ligner den oprindelige tumor og blev farvet med anti-humant HER-2-antistof (fig. 3E-3H), hvilket antyder, at modellen rekapitulerer de biologiske adfærd af den oprindelige tumor.

En PDOX model af HER-2-positiv metastatisk livmoderhalskræft, som viser metastatisk adfærd i hele muse kroppen, herunder leveren, lymfeknuderne, lunge, peritoneum, er ikke tidligere blevet rapporteret. Mere vigtigt er, at metastase mønster af PDOX tumor efterlignede den for patienten. Vi endvidere dokumenteret, at muse-dyrket tumorer rekapitulere karakter af den oprindelige patient tumor ved undersøgelse af ekspressionen status HER-2. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at primære tumorer og metastaser dyrket i mus blev farvet af anti-HER-2-antistof og sammenfattet histologiske strukturer af den oprindelige tumor (fig. 2). Forekomsten af ​​HER-2 positivitet i livmoderhalskræft blev rapporteret fra 1% til 21% [22], og overekspression af HER-2 er blevet associeret med flere fremskredne stadier og en dårligere prognose [23, 24].

(A) H & E-farvede del af den oprindelige patient tumor. (B) Stor forstørrelse foto af (A). (C) immunfarvet snit af den oprindelige patient tumor ved anvendelse af anti-HER-2-antistof. (D) med stor forstørrelse foto af (C). (E-H) H & E-farvede og immunfarvet snit af muse-dyrket tumorer. Øvre paneler er H & E-farvede snit og nedre paneler immunfarvet snit anvendelse af et anti-HER-2-antistof. Højre øverste mellemværker er høje forstørrelse billeder (skala barer: 25 pm) og mellemværker mellem øvre og nedre paneler er billeder af tumorer (skala søjler: 10 mm). Alle mus-dyrket tumorer, herunder subkutane tumorer (E), primær ortotopisk tumor (F), peritoneal-formidlet metastase (G) og levermetastaser (H) histologisk strukturer ligner det oprindelige patient tumor og blev farvet med et anti HER-2-antistof. Scale barer: 200 um (A, C, E-H) og 25 um (B og D)

PDOX model af livmoderhalskræft er beskrevet i denne rapport kunne have flere anvendelser:. For eksempel vi har for nylig brugt en PDOX nøgen musemodel af kræft i bugspytkirtlen og tyktarmskræft at udvikle teknikker til fluorescens-vejledt kirurgi [25-27]. En bugspytkirtelkræft PDOX nøgen musemodel blev brugt til at evaluere effekten af ​​tumor-targeting

Salmonella typhimurium

(

S

.

typhimurium

) A1-R stammen vi udvikler .

S

.

typhimurium

A1-R reducerede tumorvækst væsentligt i forhold til den ubehandlede kontrol [28].

S

.

typhimurium

A1-R, i kombination med anti-vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) behandling med bevacizumab (BEV), var aktiv i bugspytkirtelkræft PDOX [29].

Vi har også tidligere demonstreret zoledronsyre (ZA) er aktiv på bugspytkirtelkræft i en PDOX model på primær og metastatisk vækst [30].

således patient-efterligner PDOX model af livmoderhalskræft er beskrevet i denne rapport giver mange muligheder for opdagelsen af ​​hidtil ukendte effektive terapeutiske midler til dette aktuelt behandlingsresistente sygdom. Efter opdagelsen af ​​mere effektive terapeutiske midler kan PDOX model af livmoderhalskræft være mere nyttigt for individuel patient terapi. Nærværende rapport understreger også de kritiske fordele ved PDOX model over den subkutane PDX-modellen [31-34].

Tak

Dette papir er dedikeret til mindet om AR Moossa, MD