PLoS ONE: CD44 Splice Variant v8-10 som en markør af serøs kræft i æggestokkene Prognose

Abstrakt

CD44 er et transmembrane hyaluronsyre receptor gen, der koder over 100 forskellige vævsspecifikke proteinisoformer. Den mest allestedsnærværende, CD44 standard, har været anvendt som en kræft stamcellemarkør i æggestokkene og andre kræftformer. Ekspression af epitelial CD44 variant indeholder exon v8-10 (CD44v8-10) er blevet forbundet med mere kemoterapi og metastatiske tumorer i mave og brystkræft, men dens rolle i kræft i æggestokkene er ukendt; vi derfor undersøgt dets anvendelse som en prognostisk markør i denne sygdom. Genekspressionsprofilerne af 254 tumorprøver fra The Cancer Genome Atlas RNAseqV2 blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​CD44-isoformer. En tendens til længere overlevelse blev observeret hos patienter med høj ekspression af CD44-isoformer, der omfatter exons v8-10. Immunohistokemisk (IHC) analyse af tumorer for tilstedeværelse af CD44v8-10 blev udført på en uafhængig kohorte af 210 patienter med high-grade serøs ovariecancer bruger tumorvæv microarray. Patient stratificering baseret på software analyse af farvning afslørede en statistisk signifikant stigning i overlevelse hos patienter med de højeste niveauer af transmembranprotein ekspression (top 10 eller 20%) sammenlignet med dem med den laveste ekspression (nederste 10 og 20%) (p = 0,0181 , p = 0,0262 henholdsvis). Ekspression af CD44v8-10 i primære æggestokkene cancercellelinier var korreleret med en overvejende epithelial fænotype karakteriseret ved høj ekspression af epiteliale markører og lav ekspression af mesenchymale markører ved qPCR, Western blot, og IHC. Omvendt påvisning af proteolytisk spaltet og opløselige ekstracellulære domæne af CD44v8-10 i patientens ascites prøver var korreleret med signifikant dårligere prognose (p 0,05). Derfor kan tilstedeværelsen af ​​transmembrane CD44v8-10 på overfladen af ​​primære tumorceller være en markør for en yderst epiteltumor med bedre prognose mens enzymatisk spaltning af CD44v8-10, som påvist ved tilstedeværelsen af ​​det opløselige ekstracellulære domæne i ascitesvæske, kan være indikerer en mere metastatisk sygdom og værre prognose

Henvisning:. Sosulski a, Horn H, Zhang L, Coletti C, Vathipadiekal V, Castro CM, et al. (2016) CD44 Splice Variant v8-10 som en markør af serøs kræft i æggestokkene Prognose. PLoS ONE 11 (6): e0156595. doi: 10,1371 /journal.pone.0156595

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

Modtaget: September 28, 2015; Accepteret: 17. maj 2016 Udgivet: Juni 2, 2016

Copyright: © 2016 Sosulski et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer eller på TCGA hjemmeside på https://cancergenome.nih.gov/

finansiering:. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. han forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest almindelige dødsårsag blandt kvinder med gynækologisk kræft på verdensplan, med den høje dødelighed tilskrives den fremskredent stadium, på hvilket det er diagnosticeret, typisk længe efter intraperitoneal metastatisk spredning har fundet sted [1]. For metastase at forekomme, ovariecancerceller ændrer ofte ekspression af proteiner involveret i ekstracellulær matrix interaktion, såsom CD44, til at modulere invasion [2, 3]. Som et cellulært adhæsionsmolekyle og et stort ekstracellulært glycoprotein har hyaluronsyre receptor CD44 været impliceret i tumorinvasion og metastase i bryst-, lunge-, og gastrointestinale cancere [2].

CD44 kodes af højst 20 exons, hvoraf 10 er nævnt som variant exons. Standarden isoform (CD44s) indeholder kun 10 exoner, herunder de første 5 exoner af 5′-enden og de sidste 5 exoner af 3′-enden, således mangler de variante exoner i midten, benævnt v1-V10 eller exoner 5a -15 i standard nomenklatur [1, 4, 5]. CD44s er den mest allestedsnærværende isoform, bredt udtrykt på overfladen af ​​de fleste væv og alle hematopoieitic celler, hvor den er ansvarlig for lymfocyt homing og andre celle-celle og celle-ekstracellulær matrix interaktioner. Et stort antal alternativ splejsning isoformer af CD44 eksisterer som indeholder en kombination af variant exons (V1 gennem V10) indsat i juxtamembrane ekstracellulære region under kontrollen af ​​epitelial splejsning regulatoriske proteiner (EPSF) 1 og 2 [6]. Mange CD44 variant isoformer har vævsspecifikke udtryk; CD44v8-10 udtrykkes i epitelvæv og i epitel-type carcinomer i bugspytkirtlen, prostata, bryst, lunge og [7], hvor det er blevet grundigt undersøgt som en specifik markør af maligne celler, med forøget ekspression observeret under gastrisk carcinogenese i en murin model og i adenom til carcinom progression i human colorektal cancer [8-10] og gastriske cancere [11].

CD44s og CD44 variant isoformer er blevet impliceret i lægemiddelresistens og identificeret som stamcellemarkører [ ,,,0],12]. I kræft i æggestokkene, undersøgelser ved hjælp af udtryk for CD44s og dets variant isoformer i at vurdere prognose har produceret modstridende resultater, med nogle viste reduceret prognose, og andre forbedrede prognose, eller ingen effekt [13]. Imidlertid har undersøgelser af isoformer indeholder forskellige individuelle variant exons i kræft i æggestokkene generelt foreslået forbedret samlet overlevelse i forbindelse med splejsning isoformer af CD44 [14]. Den epitel splejsningsvariant 8-10, udtrykke v8, v9 og v10 sammen, er ikke blevet undersøgt i høj kvalitet serøs ovariecancer; Derfor er det pålidelighed og gennemførlighed forudsige prognosen blev undersøgt i dette studie.

Materialer og metoder

Den Cancer Genome Atlas (TCGA) dataanalyse

Expression data (niveau 3 ) på dokumenterede CD44s og CD44 variant isoformer for tumorer i æggestokkene serøs cystadenocarcinoma blev analyseret i en kohorte af 255 emner i TCGA (efter censurere prøver fra tilbagevendende tumorer og kun at fokusere på høj kvalitet sygdom (G2 og G3)). Vi brugte Level 3 data for at undgå re-analysere de rå datasæt; for yderligere information se den originale publikation [15]. Baseret på den annotation fil for RNAseqV2 analyse (S1 Table) definerede vi en CD44 isoform som v8-10 indeholder exoner CHR11: 35.229.652-35.229.753: +, CHR11: 35.231.512-35.231.601: + og CHR11: 35.232.793-35.232.996: +. Survival analyse af øverste og nederste 10% baseret på betyde udtryk for de tre (v8-10) exons, blev kørt ved hjælp af “overlevelse” og “survMisc” pakke i R. Konkret vi brugte supremum (Renyi) version af log-rank test, som er designet til analyse af krydse overlevelseskurver.

tumorvæv Micro-array-analyser

En anden kohorte af 210 høj kvalitet æggestokkene serøse cystadenocarcinoma patienter indlagt på Massachusetts General Hospital og Brigham og kvinders Hospital Dana Farber Cancer center mellem 1993-2009 [16] blev undersøgt under intern revision board (IRB) godkendte protokoller (MGH2007P00001918 eller DFCI 02-051). Tumor kerneprøver (3 mm) blev opnået ved indledende debulking kirurgi, scorede ifølge Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique (Figo) retningslinjer, og blev formalin-fikseret og paraffin-indstøbt. Alle tumorer biopsier, kasserede de-identificerede ascites prøver, og tilsvarende patientinformation blev indsamlet under IRB-godkendte protokoller efter skriftligt informeret samtykke blev opnået. Hver ny paraffinblok indeholdt 24 tilfældigt fordelte tumor kerner, med mindst 2 kerner per patient, og blev snittet på 7 mikron tykkelse som tidligere beskrevet [17]. Immunhistokemi blev udført på objektglas med tumor microarray (TMA) sektioner som tidligere offentliggjort [16], inden de blev blokeret af en opløsning af 1% bovint serumalbumin (BSA) med 2% donkey serum i phosphatbufret saltvand (PBS) i 1 time ved stue temperatur, inkuberes med et antistof mod CD44v8-10 (CD44v9 RV3) [4] ved 1: 12.500 natten over i et fugtigt kammer ved 4 ° C, vasket med PBS og inkuberet under anvendelse af en sekundær gede-anti-rotte-peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret antistof ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) ved 1: 200 i 1,5 time ved stuetemperatur. Objektglas blev skyllet og farvet med en diaminobenzidin (DAB) opløsning, modfarvet med hematoxylin (Dako, Carpinteria CA), dehydreret, og dækglas før bliver scannet og digitaliseret med et Scanscope (Leica, Buffalo Grove IL) og analyseret med Aperio Imagescope software (Leica, Buffalo Grove IL). Positivitet og Intensitet (PI) scoringer blev beregnet som produktet af farvet område fraktion (positivitet) og dens intensitet. Med henblik på farvningen analyse undersøgte vi kun kerner, hvor mere end 50% af vævet forblev intakt på objektglasset. Baseret på dette kriterium havde vi 6 patienter, for hvem vi beregnet PI score ved hjælp af en enkelt kerne, og 203, hvor vi tog den gennemsnitlige PI score fra 2 kerner, i alt 209 patienter analyseret. Patient overlevelse blev beregnet ud fra datoen for diagnose til dato for død eller indgang til hospice pleje, når de ikke tilgængelige, og konverteret fra dage til måneder ved at dividere antallet af dage med 30. Samlet overlevelse blev analyseret ved Kaplan-Meier plots og statistisk signifikans udledt af log-rank test. Korrelationer til kliniske parametre blev foretaget under anvendelse af chi-square-analyse. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism 6 software (Graphpad, La Jolla CA).

cellelinier

En række primære æggestokkene kræftceller stammer fra patientens ascites, pr IRB-godkendt protokol (# 2007P001918 /MGH) [16]. Kort beskrevet efter centrifugering af ascitesvæsken blev cellepellets indført i vævskultur under to forskellige betingelser (adhærente og sfæroid). I adhærente kulturer blev celler holdt ved fuldstændig konfluens i flere uger til flere måneder indtil stramme epiteliale cellekloner blev observeret. Kontaminerende celletyper (leukocytter, mesothelial og fibroblastceller) blev fjernet ved gentagen partiel trypsinfordøjelse indtil der kunne observeres nogen kontaminerende celletyper. Efterfølgende blev cellerne passeret mindst 5 gange ved 1:10 fortynding at udlede stabil homogen cellelinje. Alternativt, for kugleformede kulturer (angivet med de-SPH suffiks), blev cellerne udpladet i regelmæssige kolber i 24 timer og ikke-adhærente celler blev opsamlet og overført til nye ultralav vedhæftede kolber, mens vedhæftede celler blev kasseret. Sfæroide kulturer blev passeret ved dissociation og fortyndet 1:10 i mindst 5 passager at udlede stabile homogene cellelinjer. Panelet af primære cellelinjer består af 16 serøse epitelial ovariecancer (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW-SPH, ptAO, ptAO-SPH, PTD, PTH, ptAI, pKD1, PKD2, ptAL- SPH, ptAM-SPH, Ptak-SPH), en endometrioide epiteliale cancere (ptAP-SPH), og én mucinøs epitelial ovariecancer (PTG), dyrket i vedhængende og /eller sfæroid dyrkningsbetingelser.

Primære cellelinjer var opretholdes i cellekultur i monolag i DMEM: F12-medium med 10% FFBS 1% penicillin /streptomycin, 1% L-glutamin (Corning, New York NY) eller som ikke-adhærente sfærer i serumfrit tumor sfære medier [16] på 37C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2. Derudover, ovariecancer etablerede cellelinier OVCAR5 [18] og OVCAR8 [19], blev opretholdt i DMEM-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) 1% penicillin /streptomycin, 1% L-glutamin (Corning, New York NY).

Q-PCR og principal komponent analyse

Kvantitativ PCR blev udført på primære cellelinjer afledt af patienternes ascites (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW-sph , ptAO-sph, PTG, PTD, PTH, pKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH), og på de etablerede epitelial kræft i æggestokkene cellelinjer OVCAR-5 og OVCAR-8. Cellepellets blev opnået efter centrifugering, vasket med phosphatbufret saltvand (PBS), og nedfrosset ved -80 ° C, indtil RNA-ekstraktion under anvendelse af et Qiagen RNeasy Mini Kit (Germantown, MD) og kvantificeret ved NanoDrop. cDNA revers transkriberet under anvendelse af 500 ng af RNA per prøve med Superscript III First Strand Synthesis Super Mix (Invitrogen, Carlsbad CA), og qPCR blev udført i etablerede producenter af epitelial til mesenkymale transformation (EMT) og pluripotensbestemmende herunder CD44s, CD44v8-10 [ ,,,0],20], vimentin, E-cadherin, ESRP1, Zeb1, Lin-28, Sox-2, Oct-4, N-cadherin, og EpCAM, med GAPDH som en intern standard. Relativ udtryk blev udledt ved bestemmelsen af ​​tærskelværdien cyklus (Ct), og beregnes ved hjælp 2 ^ -ΔCt transformation normaliseret til GAPDH Ct. Principal komponent analyse (PCA) blev udført under anvendelse af disse genekspression værdier efter log transformation under anvendelse af “FactoMineR” pakke i R. PSA med mesenkymale samt epiteliale markører klart adskilt på den første komponent, mens EMT og pluripotente markører var vinkelret på den anden komponent, men ikke til at skelne fra hinanden.

Western Analyse

Cell pellets høstet fra et panel af primære patient ascites cellelinier (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW -SPh, ptAO, ptAO-sph, PTD, PTH, ptAI, pKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH, Ptak-SPH) og 2 etablerede kræft cellelinier (OVCAR-5 og OVCAR-8) blev vasket to gange med 10 ml iskold PBS og helcelleekstrakter fremstillet i 1x lysepuffer (Cell Signaling Technology, Danvers MA) i sterilt vand indeholdende en proteaseinhibitor cocktail (Roche Indianapolis, IN) og phosphatase inhibitor tabletter (Roche, Indianapolis IN). Totalt protein pr lysat blev opnået under anvendelse af et Pierce bicinchoninsyre-assay (BCA) protein kvantificering kit (Thermoscientific, Rockford IL), og ens mængder af proteiner (15ug) reduceret, indlæst i hver bane, og adskilt af NuPAGE 4-12% geler ( Life Technologies, Carlsbad CA). Proteiner blev overført til Immobilon polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica MA), blokeret i 5% fedtfri mælk opløst i en tris-pufret saltvand og tween 20 (TBST) opløsning, og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C for at detektere fuld længde transmembrane eller intracellulært protein med primært antistof rotte-anti CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) [8], eller mus anti CD44s (R + D, Minneapolis MN) (1: 500), kanin anti vimentin (ABCAM, Cambridge MA) (1: 1000), eller kanin-anti-E-cadherin (ABCAM, Cambridge MA) (1: 10.000) antistoffer, hver fortyndet i 5% fedtfri mælk i TBST. PVDF-membraner blev derefter vasket med TBST og inkuberet med et passende sekundært antistof, enten et anti kanin (Cell Signaling teknologi, Danvers MA), anti mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA), eller anti rotte (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) antistof konjugeret til et peberrodsperoxidase indikator, hver ved 1: 10.000 i 5% mælk i TBST-opløsning i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev igen vasket i TBST og behandlet med Pico ECL ™ kemiluminescens-substrat for protein visualisering (Thermoscientific, Rockford IL). Relativ protein overflod blev målt ved densitometri af Western blot bands og normaliseret for lige protein pålæsning med B-actin tæthed af Image J software analyse.

Patient ascites blev opnået fra friske terapeutiske paracenteses, pr IRB-godkendt protokol (# 2007P001918 /MGH). 1 ml ascitesvæske supernatant prøver blev behandlet med lyd, centrifugeret ved maksimal hastighed i 10 minutter for at fjerne, og fortyndet 1:50 i lysisbuffer forud for kørsel på en western blot som beskrevet ovenfor. Membraner blev inkuberet med rotte-anti CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) eller muse anti CD44s (R + D, Minneapolis MN) (1: 500) natten over ved 4 ° C og fremkaldt som ovenfor under anvendelse femto ECL ™ kemiluminescens-substrat (Thermoscientific, Rockford IL) for at bestemme tilstedeværelsen af ​​opløselig spaltet og udskilt ekstracellulært domæne af CD44v8-10 og CD44s udskilles til patient ascitesvæske. Som loading kontrol anvendte vi anti-humant IgG tung og let kæde peberrodsperoxidase-konjugat 1: 20.000 (Life Technologies, Carlsbad CA). Billeder blev fanget af BioRad XR Gel Doc billede lab software (BioRad, Hercules CA) og analyseret ved Image-J som en procent af IgG let kæde overflod. Shed proteinniveau blev derefter forbundet med patientens overlevelse, med endepunkter være dato for død eller indgang til hospice pleje, når ikke tilgængelig.

Immunhistokemi af epitel og mesenchymale markører i PDXa eksplanterede tumorer

Patient- afledte xenotransplantater fra ascites (PDXa), hvor der er etableret ved at implantere 5 millioner celler med lav passage primære linjer (ptAP-sph, PTW, ptAM-sph, PTH, ptAB-SPH, PTD) resuspenderes 1: 1 i Matrigel (Corning, New York NY ) og implanteres subkutant i flankerne af NOD /SCID /IL2RGamma Jax ™ mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor ME) under en IACUC-godkendt forsøgsprotokol (# 2009N000033) [16]. OVCAR5 tumorer blev udledt ved hjælp en identisk xenografting protokol hjælp 1 million celler. Resulterende tumorer blev fikseret i 4% paraformaldehyd, indlejret i paraffin, og snit på 7 mikrometer tykkelse på Fisher Scientific

Probe On plus

objektglas (Fisher Scientific, New York NY). Objektglas blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i alkohol, og microwaved i pufret natriumcitrat (0,01 M) for antigen hentning i 5 minutter ved høj effekt, 10 minutter ved 10% effekt, og 10 minutter ved 20% effekt, derefter skyllet i destilleret vand . Objektglas blev behandlet med 3% hydrogenperoxid, vasket og blokeret under anvendelse af en opløsning af 1% BSA med 2% føtalt kalveserum (FCS) i PBS i 1 time ved stuetemperatur, derefter inkuberet med CD44v8-10 antistof (RV3 rotte monoklonalt) (1: 12.500), og sammenlignet med dem inkuberet med CD44s (R + D, Minneapolis MN, monoklonalt muse 16ug /ml), anti E-cadherin antistof (ABCAM, Cambridge MA, kanin) (1: 500), eller anti vimentin antistof (ABCAM, Cambridge MA, kanin) (1: 500) natten over i et fugtigt kammer ved 4 ° C. Efter inkubering med et gede-anti-rotte-HRP-antistof (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX), æsel-anti-muse HRP eller æsel-anti-kanin-HRP-antistof (1: 200) (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA) i 1,5 timer ved temperatur blev objektglassene skyllet og farvet med en DAB-opløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis MO), og modfarvet med hematoxylin (Dako, Carpinteria CA), dehydreret, og dækglas. Repræsentative mikrografer blev opnået for rumlig sammenligning af proteiner, der tidligere detekteret ved Western analyse af de primære cellelinier hvorfra tumorerne blev dyrket.

Resultater Salg

Ekspression af CD44 variant isoformer indeholdende exon 8 til 10 ( V8-10) mRNA i The cancer Genome Atlas (TCGA) RNAseqV2 kræft i æggestokkene datasæt

for at bestemme mRNA ekspressionsniveauer af CD44s og dets variant V8-10 indeholder isoformer (fig 1A) i serøse tumorer i æggestokkene, vi analyserede den RNAseqV2 ressource fra TCGA, som omfatter en kohorte af 255 Grade 2 og 3 tumorprøver. Udtrykket enkelte exons V8, V9, og V10 korrelerer kraftigt i alle prøver, som også kan ses i de “standard” exon 1-5 og 15-18 (S1 Fig), hvilket tyder på at de er overvejende udtrykt som en blok af v8 -10. Endvidere exoner V8-10 synes at være den mest udbredte af alle variable exoner, hvilket tyder cd44v8-10 indeholdende isoformer er de fremherskende alternativt splejsede transkripter af CD44 (Fig 1B). Patienterne blev stratificeret baseret på gennemsnitlige mRNA-ekspressionsniveauer af exons V8-10 i deres tumor og opdelt i høje og lave udtrykke grupper (top og bund 10%), hvorfra og Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev genereret indikerer en signifikant bedre prognose i høj expressers (p = 0,035) (fig 1C). For at bestemme den relative bidrag af hvert enkelt isoform indeholder exons v8-10 vi sammenlignede deres samlede udtryk og skønnede indflydelse på overlevelse. En tendens til øget overlevelse blev observeret for alle, men én CD44 isoformer indeholder V8-10, selv om ingen var signifikante i isolation (S2 Fig). Multivariat analyse ved hjælp af Cox proportional hazard ratio model viste, at kun alder havde en betydelig indvirkning på den samlede overlevelse (Tabel 1).

A) Skematisk fremstilling af alternative splejsningsisoformer udtrykker variable exoner v8-v10. B) Fordeling af RNAseq2 udtryk data over 254 prøver til alle CD44 exons i TCGA ovariecancer datasæt. Prøver med ingen ekspression blev udeladt fra denne figur. C) Kaplan-Meier plot af overlevelseskurven sammenligne høj og lav CD44v8-10 udtrykkende prøver og tilhørende tabel med antallet af patienter ved hvert givet tidspunkt. Vi definerede den høje udtrykke sæt (rød) og den lave udtrykke sæt (sort) som prøverne med den højeste og laveste udtryk henholdsvis ved hjælp af top /bund 10% af expressers, med plottet udvidelse til 5 år. Søjler repræsenterer censureret datapunkter.

CD44v8-10 farvning i primære tumorer er forbundet med længere overlevelse i en uafhængig kohorte af 210 høj kvalitet serøse ovariecancerpatienter analyseret af tumor microarray immunhistokemi

for at bekræfte tendenser i analysen af ​​TCGA data tyder på en bedre prognose var forbundet med CD44v8-10 udtryk, besluttede vi at undersøge protein niveauer af CD44v8-10 i tumor biopsier. Overfladeekspression af det transmembrane CD44v8-10 protein blev analyseret i high-grade serøs ovariekarcinom ved immunhistokemi under anvendelse af et specifikt CD44v8-10 antistof i en tumor microarray indeholdende primære tumorprøver fra en kohorte af 210 patienter. Alle tumorer var af høj kvalitet serøs histologi med det store flertal (71%) noteres som mindst FIGO trin III, og grad 3 (89%) ved diagnose (tabel 2). Alle primære tumor microarray undersøgte prøver blev taget på tidspunktet for første debulking kirurgi. Diffus og fokal farvning blev observeret i søjleepitel af papiller, ofte i det basale lag (pile) (Fig 2A, 2B og 2C) af epitelet, men ikke i tumoren stroma i nogen af ​​de kerner (fig 2D), og altid på celleoverfladen i stedet for et intracellulært eller cytoplasmisk placering (fig 2B, indsats). Totale intensitet af positive pixels og samlede antal positive pixels, som bestemt ved Imagescope software, blev kombineret ind i en positiv intensitet score (PI), som blev gennemsnittet for de to repræsentative kerner per patient, og anvendes til patienten stratificering. Vi valgte de øverste og nederste 10 og 20 procent af patienterne til sammenligningen overlevelse forskelle mellem lave og høje expressers af CD44v8-10 transmembrane overfladeprotein, og fandt en signifikant stigning i overlevelse for både top 10% og 20% ​​af patienterne, der udtrykker høje niveauer af CD44v8-10, med en median overlevelse på 30 og 29 måneder sammenlignet med patienter, der udtrykker den laveste 10% (p = 0,0181) og 20% ​​(p = 0,0262), med en median overlevelse på 49 og 52 måneder (fig 2E) . Sammensætningen af ​​de øverste og nederste 10% og 20% ​​af patienterne var ens ved undersøgelsen kliniske parametre af FIGO kvalitet, tidspunkt og alder (S2 Table), med undtagelse af en forskel i det lille antal karakteren 2 patienter. Når denne population af grad 2 blev udelukket fra analysen at udelukke indflydelse disse sjældne lavere lønklasse tumorer, overlevelse forskel forblev signifikant mellem de højeste og laveste expressers af CD44v8-10 protein (S3 Fig).

Faste paraffin indlejret væv microarray kerner blev farvet ved immunhistokemi anvendelse af et antistof mod CD44v9, scannet ved hjælp af en Aperio Scanscope, og analyseret ved hjælp af Aperio Imagescope software positive pixel algoritme. Repræsentative billeder taget ved høj (40x) power show basal epitelial farvning i a og c, mere diffus overflade epitelial farvning i b og negative stroma med isolerede positive epitelceller i d. e.) Samlet overlevelse af patienter med høj kvalitet serøs ovariecancer af CD44-variant udtryk. Venstre- højeste og laveste 10% udtryk variant og Højre- Højeste og laveste 20% af ekspressionen af ​​variant, viser betydelig samlet overlevelse i de højeste expressers med p = 0,0181 og p = 0,0262, henholdsvis.

Multivariate analyse af registrerede kliniske parametre, herunder alder, klasse, scene, debulking status, og CD44v8-10 farvning intensitet blev analyseret for deres effekt på prognosen (tabel 3).

alder havde den stærkeste indflydelse på prognosen, efterfulgt af CD44v9 farvningsintensitet af tumoren, mens FIGO stadieinddeling eller sortering og debulking status var ikke signifikant. Siden cox proportional hazard ratio (tabel 3) viste en afhængighed for alder og CD44v8-10 overflade markør udtryk, vi ønskede at udforske variabel sammenhæng ved hjælp af en fordomsfri patient lagdeling til at generere et beslutningstræ, som maksimerer prognostiske forskelle (figur 3). Vi stratificeret patientgrupper baseret på alder, FIGO stadie, Grading, debulking status, og CD44v8-10 udtryk. Den resulterende klassifikation viste, at patienter af 59,2 år ikke i væsentlig grad drage fordel af højere CD44-ekspression. Yngre patienter viser en stærk korrelation af bedre overlevelse, når der har høj CD44 overflade markør. Disse observationer forfine resultaterne fra cox hazard ratio model og definere et beslutningstræ, der kunne bruges klinisk til at maksimere den prognostiske magt CD44v8-10 tumor farvning (figur 3).

De patienter fra tumor-array sampleset blev stratificeret ved hjælp Age, CD44v9 farvningsintensitet (σ af CD44v9 udtryk), klasse, debulking status, og FIGO score. Multivariat analyse blev udført og effekt size rangeret til at generere en binær beslutningstræ at maksimere prognostisk magt i en saglig måde og tildele statistisk signifikans. Kun statistisk signifikante variabler (alder og CD44v9 farvning) vises sammen med deres effekt på den samlede patient overlevelse på Kaplan-Meier plot. Søjler repræsenterer censureret datapunkter.

Angivelse af CD44v8-10 korrelerer med en epitelial fænotype

Vi udførte principal komponent analyse (PCA) (FactoMiner) på mRNA-ekspression, som defineret af qPCR værdier på 2

-ΔCt normaliseret til GAPDH, i en række forskellige epitel- (EPCAM, ESPR1, E-cadherin) og mesenchymale (ZEB1, vimentin, N-cadherin) markører i et panel af 15 primære (ptAB, ptAB- SPH, ptAF, ptAF-sph, PTW, PTW-SPH, ptAO-sph, PTG, PTD, PTH, pKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH) og 2 etablerede æggestokkene kræft cellelinier (OVCAR5, OVCAR8). PCA bekræftede, at CD44v8-10 mRNA ekspression forbinder med andre epitel markører, mens CD44s udtryk korrelerer med mesenkymale markører i ovariecancer (Fig 4A). Angivelse af pluripotens markører (LIN28, Sox2, OCT4) var forbundet med hverken epiteliale eller mesenkymale markører, hvilket tyder stemness er uafhængig af epitelial eller mesenkymale status (Fig 4A).

A) Principal komponent analyse ved hjælp af qPCR relativ kvantificering af udtryk for epitel, mesenkymale og pluripotens markører i primære æggestokkene cancer cellelinjer. Farvede pile angiver retninger for hver gruppe af markører. B) Western-analyse af primære cellelinie proteinlysater til ekspression af CD44v8-10 protein under anvendelse af et monoklonalt rotte-antistof mod human CD44v8-10.

Tilsvarende ekspression af CD44v8-10 protein i patient-afledt celle line lysater ved Western-blot viste en tendens til co-ekspression af CD44v8-10 med E-cadherin, eller CD44s med vimentin, på en gensidigt udelukkende måde (fig 4B), bekræfter qPCR data indikerer, at CD44v8-10 er en epitel markør og CD44s en mesenchymal markør i høj kvalitet serøs kræft i æggestokkene.

for at bestemme den rumlige udtryk for CD44v8-10, og dens relation til de epitel eller mesenchymal tumor histologier, patient-afledte xenografter af ascites (PDXa s) [16] blev analyseret ved immunohistokemi (IHC). Samlet set tumorer dyrket

in vivo

sammenfattet epitel eller mesenkymale heterogenitet observeret i den primære cellelinje

in vitro

(Fig 4). Tumorer med en meget epitelial fænotype udtrykte lave niveauer af vimentin, der var begrænset til stromale celler (PTW, OVCAR5) og høje niveauer af CD44v8-10 ekspression, som var specifikke for celleoverfladen af ​​cancercellerne i tumoren (fig 5A, Indsæt). Omvendt, jo flere mesenkymale tumorer (PTH, PtAM kugler, og PtAB kugler) udtrykt vimentin i både epitelcancerceller samt stromale celler i tumoren, og havde meget lav ekspression af CD44v8-10 (Fig 5B). Tumorer af mellemprodukt fænotype med både epitel- og mesenchymale karakteristika havde ekspression af CD44v8-10 og vimentin i epitelcellerne samt stroma (Fig 5C).

Antibody farvning af vævssnit fra tumorer udviklet in vivo efter injektion med 1 til 5 millioner primære patient-afledt ovariecancer celler. Repræsentative snit fra tumorer afledt af OVCAR5, ptAP-SPH, Pt W (A), ptAM-SPH, PTH, ptAB-SPH (B) og PTD (C) er vist. CD44v8-10, og vimentin immunhistokemisk farvning er vist med hematoxylin kontrastfarve ved 100x forstørrelse. CD44v8-10 etiketter overfladen af ​​epiteliale kræftceller (indsæt), mens vimentin etiketter stromale celler i flere epiteliale tumorer og de fleste celler i flere mesenkymale tumorer (indsæt). Tumorer blev grupperet i epitel (A), mesenchymale (B) eller blandet fænotype (C) baseret på farvning.

Opløselig CD44v8-10 kan detekteres i supernatanten af ​​ascites prøver og korrelerer med dårligere prognose

Vi vurderede potentialet til at detektere det opløselige ekstracellulære domæne af CD44v8-10 som et spaltet fragment i ascitesvæske supernatanten under anvendelse af Western blot af 28 forskellige patientgrupper ascites prøver. Opløseligt spaltet CD44S er homogent udtrykkes i alle ascites prøver, herunder godartede kontroller, hvilket tyder det er en allestedsnærværende blodprotein. Interessant, den spaltede og kaste opløselige ekstracellulære domæne af CD44v8-10 var påviselig i 27 ud af 28 prøver af patientens æggestokkene ascites, med meget varierende niveauer, men var ikke påviselig i godartede liver ascites, tyder det kan være kræft-specifikke. Et repræsentativt Western blot af 6 patient ascites demonstreres i fig 6A. Proteinet overflod af det opløselige ekstracellulære domæne af CD44v8-10 blev målt ved densitometri af Western blot bands og normaliseret for lige protein pålæsning med IgG let kæde densitet af Image J software analyse. Efter stratificering af patienter baseret på CD44v8-10 niveauer, vi bemærkede en signifikant nedsat overlevelse hos patienter med høje niveauer af opløselig CD44v8-10 (top 50%) med en median overlevelse på 39 måneder versus 59.27 måned for bunden 50% (p . = 0,0481) (fig 6B)

A) ascites prøver (N = 28; 6 prøver vist som repræsentant) blev opnået fra patienter, der gennemgår terapeutisk paracentese, og undersøgt af western blotting for CD44v8-10, CD44s, og anti human IgG let kæde som en loading kontrol. Protein densitometri blev udført, og prøver blev analyseret for niveauer af ekspression af opløselig CD44v8-10 og adskilt i to lige store grupper af høje og lave CD44v8-10 niveauer.