PLoS ONE: En ligand Peptide Motiv Udvalgt fra en kræftpatient er en receptor-interagerende site inden human interleukin-11

Abstrakt

Interleukin-11 (IL-11) er en pleiotropisk cytokin godkendt af FDA mod kemoterapi-induceret trombocytopeni. Fra et kombinatorisk selektion i en cancerpatient, isoleret vi en IL-11-lignende peptid mapping til domæne I af IL-11 (sekvens CGRRAGGSC). Selv om dette motiv har ligand attributter, er det ikke inden for de tidligere karakteriserede interagerende steder. Her udvikle og validere in-tandem bindingsanalyser, site-directed mutagenese og NMR-spektroskopi til at vise (i) peptidefterligninger et receptor-bindende site inden IL-11, (ii) binding af CGRRAGGSC til IL-11Rα er funktionelt vi relevant, (iii) Arg

4 og Ser

8 er de vigtigste rester medierer interaktionen, og (iv) IL-11-lignende motiv inducerer celleproliferation gennem STAT3-aktivering. Disse strukturelle og funktionelle resultater afdække et endnu ukendt receptor-bindingssted i human IL-11. I betragtning af, at IL-11Rα er blevet foreslået som et mål i human cancer, vores resultater giver fingerpeg til rationel udformning af målrettede lægemidler

Henvisning:. Cardó-Vila M, Zurita AJ, Giordano RJ, Sun J, Rangel R, Guzman-Rojas L, et al. (2008) En ligand peptid Motiv Udvalgt fra en kræftpatient er en receptor-interagerende site inden human interleukin-11. PLoS ONE 3 (10): e3452. doi: 10,1371 /journal.pone.0003452

Redaktør: Maxim Antopolsky, University of Helsinki, Finland

Modtaget: 23, 2008; Accepteret: September 24, 2008; Udgivet: 20 Oktober 2008

Copyright: © 2008 Cardó-Vila et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Specialized Program i Research Excellence (SPORE) af National Cancer Institute (til WA og RP), fra det amerikanske Department of Defense (til MGK, WA, og RP), og ved prisuddelinger fra Prostata Cancer Foundation den Marcus Foundation og Gillson-Longenbaugh Foundation (til WA og RP). MCV modtog en postdoc stipendium fra Susan G. Komen Breast Cancer Foundation. AJZ modtog en postdoc stipendium fra Instituto de Salud Carlos III (Spanien); RR er en Scholar fra Odyssey Program for The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center. CDA modtog en predoctoral stipendium fra National Research Council (Brasilien). FCLA og APV modtaget støtte fra Rio de Janeiro Research Support Foundation og National Research Council (Brasilien). De finansieringsorganer havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

Phage display muliggør identifikation af vævsspecifikke eller angiogenese-relaterede molekylære signaturer på blodkar og derved muliggør ligand-directed levering [1] – [10]. Tidligere viste vi, ved direkte screening af et kombinatorisk peptidbibliotek i en cancerpatient, at de selektive målsøgende peptider lokaliserede ikke-tilfældigt til specifikke organer [1]; vi også identificeret et cyklisk peptid (sekvens CGRRAGGSC) målretning prostata vaskulatur og prostatacancer som en interleukin-11 (IL-11) mimic [1], [2]. I en anden linje af undersøgelse, Kang et al. [11] foreslået en central rolle for IL-11-vejen i den genetiske progression af maligne tumorer metastatiske til knogle. Aktivering af medlemmer af signaltransduktion og aktivator af transkription (STAT)-familien, især STAT3, blev afsløret nedstrøms som en konsekvens af bindingen af ​​IL-11 til dets tilsvarende receptor [12].

Selvom IL 11 blev oprindeligt karakteriseret som et cytokin med trombopoietisk aktivitet, blev det senere vist sig at have pleiotrope virkninger i flere væv [13]. Rekombinant IL-11 er en FDA-godkendt lægemiddel (oprelvekin; Neumega®) anvendes mod kemoterapi-induceret trombocytopeni (https://www.fda.gov/cder/biologics/products/opregen112597.htm) [14]. Sammen med mere end 10 andre fire-helix bundle cytokiner, herunder interleukin-6 (IL-6), leukæmi-inhiberende faktor (LIF), ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), oncostatin-M (OSM), og cardiotrophin-1 (CT- 1), IL-11 hører til gp130 eller IL-6-typen [15], [16]. Disse cytokiner fremkalde reaktioner ved samling af oligomere signalsystemer komplekser, der indeholder den transmembrane receptor gp130. Strukturen af ​​IL-11 har været genstand for molekylære modellering og mutageneseundersøgelser [17] – [21]. Forskning har vist, at IL-11 indeholder tre kendte receptor-bindingssteder (I, II og III). Stedet I i IL-11 binder til cytokinet-receptor homologiregion (CHR) i domænerne 2 og 3 (D2-D3) af IL-11Rα, hvorimod sites II og III interagerer med to separate områder af gp130-homodimer: CHR ( D2-D3, sted II) og Ig-lignende domæne (D1, sted III) [22] – [24]. Men ingen direkte strukturel analyse er tilgængelig for enten IL-11 eller signaleringen kompleks. Faktisk mens X-ray struktur af IL-6-receptor-kompleks som en hexamer IL-6 /IL-6Ra /gp130 ternære kompleks er blevet indført som en model for IL-11 [25] – [27], nøjagtigheden af denne ekstrapolation faktisk er udfordret, fordi IL-11 og IL-6 aksjer ingen signifikant lighed i primær struktur og interagere med forskellige receptorer formentlig gennem forskellige mekanismer [28]. En ligand-induceret overgang fra et aktivt tetramert kompleks (herunder en gp130 dimer) til en inaktiv hexamere kompleks er blevet foreslået til IL-11 [28], [29]. Reagere på IL-11 er begrænset til celler, der udtrykker IL-11Rα foruden gp130. Analogt med IL-6-receptor α (IL-6Ra) og IL-6 er det blevet postuleret, at IL-11Rα “præsenterer” IL-11 til gp130, som er ansat som en homodimer og fører til dannelsen af ​​en så -kaldet højaffinitets-IL-11-receptorkomplekset. Denne aktive kompleks er den initierende trin i aktiveringen af ​​Janus kinase (JAK) /TYK tyrosinkinaser, som igen phosphorylerer tyrosinrester i den cytoplasmatiske region af gp130; disse efterfølgende virke som docking sites for medlemmer af STAT-familien af ​​transkriptionsfaktorer, fx STAT3 [12], [13], [17].

Selv om in vivo-valgte homing motiv CGRRAGGSC havde bestemt ligand- specifikke attributter [1], [2], den tilsvarende placering inden det native cytokin er ikke i en etableret interagerende sted mellem IL-11 og IL-11Rα [17] – [28]. Vi hypotese og efterfølgende bekræftet, at dette peptid motiv fungerer som et nyt bindingssted inden IL-11. Tandem mutagenese, bindende analyser, kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, og signaltransduktion analyse kraftigt støtte den konklusion, at dette peptid sekvens er faktisk en tidligere ukendt receptor-interagerende site inden human IL-11.

resultater Salg

udvalgte sekvens-binding til IL-11-receptorkomplekset er specifik og ikke omfatter gp130

Vi har tidligere konstateret, at fag, der udviser motivet CGRRAGGSC interagerer specifikt med IL-11Rα; denne interaktion blev inhiberet af rekombinant IL-11 i en koncentrationsafhængig måde, men ikke af IL-1β [1], [2]. Fordi den funktionelle IL-11-receptorkomplekset synes at være en multi-heterodimer sammensat af IL-11, IL-11Rα og gp130 [15], vi først evalueret, om den valgte IL-11-lignende motiv [1], [2] ville binde til IL-11Rα, at gp130, eller til begge. Til dette formål, vi coatede plader med følgende protein: IL-11Rα, gp130, eller leptin-receptoren (en uafhængig gp130 partner). Bovint serumalbumin (BSA) tjente som en negativ kontrol for bindingsassayet (figur 1A). CGRRAGGSC-fag bandt ikke over baggrundsniveauer til immobiliseret gp130, i forhold til dens signifikant binding til humant IL-11Rα (figur 1A), data, der angiver ingen fag-binding til gp130 alene. Desuden CGRRAGGSC-fag-binding til leptin-receptor eller til BSA var fuldstændig identisk med den for ikke-målrettede kontrol-fag. Disse resultater fastslår, at CGRRAGGSC peptid kun binder til IL-11Rα i receptorkomplekset når enkelte subunits analyseres. Dernæst viste, at CGRRAGGSC-fag-binding til IL-11Rα medieres af IL-11-lignende motiv, fordi syntetisk CGRRAGGSC inhiberede binding af den beslægtede fag i en koncentrationsafhængig måde (figur 1B).

( A) CGRRAGGSC-fag-binding til de individuelle receptor komponenter af IL-11-receptorkomplekset: IL-11Rα og gp130. Leptinreceptor og BSA tjente som negative kontroller for binding. (B) Koncentration-afhængig binding inhibering af CGRRAGGSC-fagen til IL-11Rα af det beslægtede syntetiske peptid. Barer repræsenterer gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM).

NMR spektroskopi af det målrettede peptid-receptor interaktion

NMR er et særligt velegnet metode til at studere medium-til-lave affinitetsbinding [30], [31], som det ofte er tilfældet for interaktionen mellem peptidligander identificeret ved fag-display (f.eks CGRRAGGSC peptid og IL-11Rα). Ved at måle små ændringer i NMR parametre liganden (såsom kemiske skift og relaksationstider) kan man probebinding hændelser, der forekommer på uM til mM koncentrationsområde på grund af den hurtige udveksling mellem den bundne konformation og fri form af liganden. Når den hurtige udveksling regiment er nået et overskud af ligand (mM) i løbet af receptoren (uM) kan anvendes til målingerne. Hurtig udveksling betingelse er ofte til stede i bindende undersøgelser med peptider udvalgt fra fag-display-biblioteker grund af deres middel til lav affinitet område [30] – [32]. Således at karakterisere det strukturelle grundlag af samspillet mellem peptid CGRRAGGSC og IL-11Rα, vi anvendte NMR-spektroskopi [30], [32]. Vi begyndte ved at analysere den strukturelle opførsel af den frie syntetisk peptid CGRRAGGSC ved proton NMR. Den endimensionale (1D-

1 H-NMR) spektrum viste hovedlinjerne ved 25 ° C (figur S1A) indikerer tilstedeværelsen af ​​konformationel udveksling mellem flere CGRRAGGSC konformere. Selvom resonans linje blev mere defineret ved 5 ° C, konformationel udveksling varede ved lave temperaturer (fig S1a); ja, forekomsten af ​​flere konformere er ikke ualmindelige i denne indstilling og har ikke udelukket studiet af ligand-receptor-interaktioner [30]. I tilfælde af CGRRAGGSC peptid næsten alle resonanser i spektrene blev utvetydigt er tillagt de enkelte rester af peptidet baseret på todimensionale proton spektre (2D-

1 H-NMR) TOCSY- og NOESY (tabel S1 og S2).

efter at have karakteriseret den strukturelle opførsel af CGRRAGGSC peptid i opløsning og overdraget sine resonanser i NMR-spektrene, vi næste nedsat bindingsassays [30] for at få indsigt i basis for receptorbinding til liganden peptid. Spektret af frie CGRRAGGSC blev sammenlignet med de for CGRRAGGSC i nærvær af IL-11Rα (under et molært overskud af peptid med ~16-, 33- og 66-fold), og ændringer i kemisk forskydning (Δδ) blev analyseret (figur 2A). Selvom den præcise kortlægning af resterne i CGRRAGGSC ikke kunne opnås fra 1D-

1 H-NMR-spektre på grund af receptor peak overlap, samspillet mellem CGRRAGGSC og IL-11Rα resulterede i kemiske skift ændringer og nye spin-systemer (figur 2A -C). Sådanne ændringer er tegn på bindende og er tankevækkende, at flere rester bidrager til interaktion. Endvidere bindende ligevægt var afhængig af peptidkoncentration og i overensstemmelse med en hurtig kurs (us spænder) på grund af resonanser frie og bundne former af peptidet blev påvist som de gennemsnitlige bånd (figur 2A).

( A) Effekt af CGRRAGGSC peptid koncentration efter biding til IL-11Rα. Amid region 1D-

1 H-NMR-spektre af stigende molære koncentrationer af peptidet CGRRAGGSC binding til IL-11Rα (6 uM) er vist (blå). CGRRAGGSC peptid alene (400 uM) og spektret af IL-11Rα alene er også vist (i rød og sort, henholdsvis). Udseendet af arginin sidekæde- resonanser (ikke set i spektret af alene peptidet) er indikeret (*). (B) Kemiske skift ændringer induceret på CGRRAGGSC resonanser ved at binde til IL-11Rα. Den 2D-

1H-NMR TOCSY spektre af CGRRAGGSC (400 uM) enten alene (sort) eller i nærværelse af 6 pM IL-11Rα (rød) er vist. Single-ledes og dobbelt-ledes pile angiver kemiske skift ændringer og fremkomsten af ​​nye spin-systemer, henholdsvis. (C) Sammensætning af amid region 1D-

1 H-NMR og tilsvarende 2D-

1H-NMR TOCSY spektrene for CGRRAGGSC peptid ved 5 ° C (til venstre), ved 25 ° C (i midten) og ved 25 ° C i nærvær af IL-11Rα (højre). Cirklerne med stiplede linier og pilen indikerer arginin resonanser.

For at beregne de enkelte kemiske skift ændringer (Δδ) fremkaldt af IL-11Rα på hver af de hydrogenatomer i CGRRAGGSC sammenlignede vi den enkelte 2D –

1H-NMR TOCSY spektre opnået i fravær og nærvær af IL-11Rα (molært peptid overskud ~66-fold) (Figur 2B og tabel 1). Disse spektre blev også anvendt til analyse af nyt spin systemer (figur 2B og 2C). I 2D-

1H-NMR TOCSY receptoren NMR-signalet blev filtreret under 80 ms spin-lås, hvilket resulterer i en renere analyse af kemisk skift perturbation. Vi observerede, at de fleste individuelle resonanser i CGRRAGGSC viste signifikant Δδ efter binding til IL-11Rα (figur 2B og tabel 1), et resultat indikerer, at næsten alle rester i CGRRAGGSC deltage i binding til receptoren i en direkte eller indirekte måde. Den mest fremtrædende Δδ ( 10 Hz) involverede α-hydrogenatomer i Gly

7 og af Cys-resterne (som ikke kunne utvetydigt tildelte og her omtales som Cys

1/9). Men Δδ 5 Hz for rester Cys

1, Gly

2, Gly

6, Ser

8, og Cys

9 var også bemærkelsesværdigt. De nye spinsystemer observeret i 1D-

1 H-NMR-spektre (figur 2A) optrådte også i TOCSY spektre, og blev tildelt til Cys

1/9, Arg

3/4, og Ala

5 (figur 2B, dobbelt-ledes pile). Disse nye spin-systemer kort til peptid region, der gennemgår en kompleks konformationel ligevægt i fri form. Dette resultat antyder, at ved binding til IL-11Rα, bliver segmentet Cys-ss-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala i CGRRAGGSC konformationsbegrænset, hvilket resulterer i en gevinst-of-struktur og tilsvarende tab af frihed for CGRRAGGSC i den bundne tilstand. Konsekvent blev lignende resultater observeret ved at sammenligne 1D-

1 H-NMR og 2D-

1H-NMR TOCSY spektre af CGRRAGGSC ved 5 ° C og 25 ° C (figur 2C). Arg

3, Arg

4 og Ala

kunne kun påvises 5 resonanser i spektrene ved 5 ° C (figur 2C, venstre panel), men ikke i spektrene ved 25 ° C (figur 2C, middle panel), igen vejledende at konformationel variabilitet spiller en rolle, når der detekteres sådanne spin-systemer, som for nylig er blevet rapporteret [31], [33] – [35]. Men efter binding til IL-11Rα, resonanser svarende til Arg

3, Arg

4 og Ala

5 blev også observeret i spektrene ved 25 ° C (figur 2C, højre panel).

tilsammen vores NMR data indikerer, at konformationel variabilitet spiller en strukturel rolle i CGRRAGGSC peptid interaktion med IL-11Rα og foreslå, at: (i) de fleste rester i CGRRAGGSC ændre deres konformation efter binding til IL-11Rα, ( ii) Cys-ss-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala-domænet af peptidet undergår en receptor-afhængig gain-of-struktur, (iii) motivet Gly-Gly-Ser-Cys-ss-Cys omfatter en kandidat websted til direkte interaktion af peptidet med IL-11Rα, og (iv), at resterne Gly

7 og Ser

8, efter aftale med de mutationsmønstre undersøgelser (beskrevet nedenfor), der også er relevante for binding.

Funktionel analyse af vildtype og steddirigerede IL-11 mutanter

i tidligere arbejde, har andre forskere produceret rekombinante proteiner indeholdende punktmutationer at afsløre funktionelle egenskaber af native IL-11; især, er ikke blevet rapporteret punktmutationer i stedet indeholder den CGRRAGGSC sekvens [17] – [21]. Således yderligere at påvise, at resterne 112-117 repræsenterer en protein-interagerende site, vi først forsøgte at generere en serie af rekombinante site-styret alanin-scan mutanter af motivet RRAGGS inden human IL-11.

de DNA-sekventering (data ikke vist) og SDS-PAGE-analyse (figur 3A) viste, at vildtype og mutant IL-11 rekombinante proteiner blev produceret med den forventede molekylvægt, en række IL-11 mutanter præsenteret sterisk hindring og misfoldning aberrances . Sådan iboende teknisk begrænsning af enhver mutationel undersøgelse fremgår af manglende epitop tilgængelighed observeret i forsøg med anti-IL11-antistoffer (figur 3B og data ikke vist). Trods disse potentielle problemer, vi næste brugte ELISA til at vurdere egenskaberne for IL-11 punktmutanter (resterne 112-117) for deres evne til at binde til IL-11Rα. Mutation af resterne Arg

113 (R113A), Gly

115 (G115A), og Ser

117 (S117A) markant reduceret binding af IL-11 til receptoren, i forhold til vildtype-sekvensen ( 86, 71, og 86% bindende hæmning, henholdsvis), hvorimod mutation af rester Arg

112 (R112A) og Gly

116 (G116A) producerede kun en moderat effekt (43 og 29% bindende hæmning, henholdsvis) ( figur 3C). Disse data indikerer, at de fleste af de rester i RRAGGS motivet deltage i bindingen til IL-11Rα; dog Gly

115 og Ser

117 sandsynligvis de vigtigste rester medierende ligand-receptor interaktion. Således i overensstemmelse med vores arbejdshypotese, mutanter de alanin-scan viste reduceret, dog specifik binding til den tilsvarende receptor, IL-11Rα (figur 3C).

(A) Oprensede rekombinante proteiner blev analyseret ved Coomassie farvning. (B) Western blot-analyser med polyklonalt anti-IL-11 og anti-GST-antistoffer. (C) Rekombinante GST fusionsproteiner (alaninscanning mutanter af resterne 112-117 af IL-11, vildtype IL-11, GST alene eller rhIL-11) blev coatet i tre eksemplarer natten over og inkuberet med IL-11Rα. Binding blev påvist med anti-Fc-antistof. Barer repræsenterer gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM).

rolle rest Arg

113 er noget problematisk at vurdere fra ELISA, fordi denne mutation påvirkede reaktiviteten af ​​anti-IL -11 antistoffer. For at udelukke den mulighed, at den observerede reduktion i binding af IL-11 mutanter til IL-11Rα var sekundære til misfoldning af fuld-længde proteinet og /eller sterisk hindring, vi udtænkt en alternativ ligand-receptor assay baseret på site- mutagenese af peptid-målrettede fag. Single-rest alaninscanningsmutagenese af CGRRAGGSC fag blev fremstillet og binding af hver fag til immobiliseret IL-11Rα blev testet i et funktionelt assay (tabel 2). Mutation af Arg

4, Gly

7 og Ser

8 rester i CGRRAGGSC fag ophævede binding til receptoren (tabel 2), hvorimod mutation af rester Arg

3 og Gly

6 ikke inhibere binding men nedsatte CGRRAGGSC-receptor-interaktionen med over 70%. Disse data er i overensstemmelse med NMR og IL-11 site-styret mutagenese undersøgelser og viser, at de fleste rester i RRAGGS motivet deltage i samspillet med IL-11Rα. Endvidere dataene identificerer en central rolle for Ser

8 rest i CGRRAGGSC (svarende til Ser

117 af IL-11) i binding til receptoren og viser, at begge glycinrester er vigtige for interaktion med IL- 11Rα. Afslutningsvis resterne 112-117 i human IL-11 omfatter en strukturel og funktionel site for interaktionen af ​​proteinet med dets receptor.

Det syntetiske peptid CGRRAGGSC inducerer celleproliferation

Efter at have vist, at motivet RRAGGS betegner et relevant sted i human IL-11, vi fortsatte med at afgøre, om den tilsvarende syntetisk peptid er biologisk aktive. IL-11 inducerer koncentrationsafhængig proliferation ved inkubering med human TF-1-leukæmiceller ([36] og data ikke vist). Således har vi vurderet om de tilsvarende syntetiske CGRRAGGSC peptidefterligninger IL-11 i sin stimulering af disse celler efter binding til IL-11Rα. Vi først udsat TF-1-celler til CGRRAGGSC peptidet i nærvær eller fravær af enten IL-11 eller GM-CSF (positiv kontrol) under forudbestemte betingelser, hvor IL-11 inducerer optimal celleproliferation. Opløseligt CGRRAGGSC peptid inducerede en potent vækstfremmende stimulerende virkning på TF-1-celler, alene og i nærvær af IL-11 (figur 4A, venstre panel) eller GM-CSF (data ikke vist), hvorimod der ikke blev observeret nogen virkning på kontrol ( ikke-IL-11Rα-udtrykkende) celler (figur 4A, højre panel) [2]. Dette peptid-inducerede proliferative virkning var mere udtalt for CGRRAGGSC plus IL-11 eller CGRRAGGSC alene end for CGRRAGGSC plus GM-CSF (data ikke vist); et ubeslægtet cyklisk kontrol peptid viste ikke detekterbare virkninger i sig selv eller i kombination med IL-11. Dernæst at vurdere, om CGRRAGGSC proliferation er afhængig af celleoverfladen IL-11Rα, brugte vi den tilsvarende opløselig receptor, sIL-11Rα, som en molekylær lokkedue for peptid binding. Celleproliferation induceret af CGRRAGGSC var lavere i nærværelse af sIL-11Rα (t-test, P 0,005), men ikke i nærvær af en kontrol opløselig receptor (figur 4B). Af note, var mindre inhibering observeret, når cellerne blev dyrket med CGRRAGGSC, sIL-11Rα og IL-11, data indikerer, at CGRRAGGSC kan interagere med det komplekse IL-11-sIL-11Rα (figur 4B). Disse resultater viser, at det syntetiske peptid CGRRAGGSC kan inducere celleproliferation i sig selv, eventuelt virker som en IL-11Rα-stimulatorisk ligand.

(A) Koncentrationsafhængig proliferativ respons på CGRRAGGSC vises på IL-11Rα-udtrykkende humane TF-1 leukæmiceller i fravær eller nærvær af IL-11 (venstre panel). Ingen reaktion observeres på ikke-IL-11Rα-udtrykkende kontrolceller (højre panel). (B) Opløseligt IL-11Rα-medieret inhibering af den proliferative virkning induceret af 150 uM CGRRAGGSC peptid (og med IL-11). * T-test, P 0,005. Barer repræsenterer gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM).

STAT3 fosforylering medierer CGRRAGGSC celleproliferation

IL-11 binding til IL-11Rα og glycoprotein 130 (gp130) medierer signaltransduktion gennem STAT3-aktivering; derfor, vi næste vurderet, om CGRRAGGSC peptid kan stimulere celledeling ved aktivering af samme vej. Til det formål undersøgte vi ligand-medieret STAT3-aktivering i serum-udsultede TF-1-celler inkuberet i nærvær af IL-11, CGRRAGGSC peptid eller et ubeslægtet cyklisk kontrol peptid. Trods serumudsultning blev svag STAT3 (P-Tyr

705) baseline aktivering detekteres i ikke-stimulerede TF-1-celler (figur 5). Tyve minutters inkubation med enten CGRRAGGSC eller IL-11 (positiv kontrol) førte til STAT3 phosphorylering (figur 5A), som steg i en koncentrationsafhængig måde (figur 5B). Lignende effekter blev observeret for IL-11 i kombination med CGRRAGGSC eller et ubeslægtet cyklisk peptid (men ikke alene kontrol peptid) (figur 5A). Disse data afdække en potentiel molekylær mekanisme bag CGRRAGGSC proliferation via aktivering af IL-11-receptorkomplekset gennem STAT3 og viser, at dette websted under IL-11 er funktionelt aktivt for binding og signaltransduktion.

(A) proliferation af humane TF-1 leukæmiceller induceret af CGRRAGGSC er forbundet med STAT3 phosphorylering, som vurderet med et anti-STAT3-P-Tyr

705-antistof. (B) CGRRAGGSC peptid-induceret aktivering af STAT3 er koncentrationsafhængig. Ingen effekt observeres med en kontrol-peptid. At undgå inter-eksperimentelle variation, blev lysatet delt i to: halvdelen af ​​lysatet blev immunoblottet med et anti-STAT3-P-Tyr

705-antistof, mens den anden halvdel tjente at bestemme det samlede beløb for STAT3 (som et surrogat for protein belastning) med en specifik anti-STAT3 antistof. Bemærk, at de kommercielle HeLa celleekstrakter tjener som kontrol viser kun α-STAT3 band.

Diskussion

Gennem direkte valg af peptid-biblioteker i patienter [1], [37], [38], isoleret vi en ligand peptid efterligner IL-11 fra prostata vaskulatur [1] og foreslog IL-11Rα som et mål under progressionen af ​​prostatacancer [2]. Her valgte vi at udforske de strukturelle og funktionelle egenskaber af denne formodede protein-protein-interaktion, fordi den aktuelt kendte bindingssteder inden human IL-11 [22] – [24] omfatter ikke den valgte peptidsekvens inden det native protein (figur 6) .

Pilehoveder indikerer human IL-11 rester forudsagt (ved stedsrettet mutagenese) for at være ligand-receptor binding sites; solide farver angiver rester, der er kritiske for binding [17] – [21]. Rester 112-117 svarende til IL-11-lignende motiv [1], [2], der er beskrevet i dette arbejde er fremhævet med gult. Den grundlæggende ordning af human IL-11, som vist her, er blevet ændret fra reference [47].

Vi brugte komplementære strategier såsom site-directed mutagenese og NMR-baserede undersøgelser for at fastslå, at alle seks rester af RRAGGS motivet sandsynligvis kræves for binding til IL-11Rα. Fordi NMR-analyse ikke utvetydigt afslører hvilke af argininrester (Arg

3 eller Arg

4) deltager i receptorbinding, blev undersøgelser baseret på målrettet fag alaninscanning og IL-11 site-directed mutagenese angivet. I begge tilfælde, Arg

4 viste sig at være nøglen rest. Alle tre metoder også foreslået, at Gly og Ser-rester bidrager til niveauet af IL-11Rα binding af ligander. Faktisk Ser

8 mutation afskaffet bindingen af ​​CGRRAGGSC til IL-11Rα; den Δδ observeret i Ser

8 induceret ved binding til IL-11Rα bekræftet dette resultat.

Vi har forsøgt at generere og fortolke molekylære modeller af IL-11 baseret på høj opløsning strukturelle studier rådighed til andre gp130 -type cytokiner, herunder IL-6 [21], [39] og CNTF [21], [40] og om mutagenese af IL-6, CNTF og LIF [41] – [43]. I tilfælde af bindingsstedet for IL-11Rα eller sted I, rettet mutagenese af specifikke rester ved C-terminalen af ​​helix D og AB-sløjfen fastslået, at disse regioner deltager i receptorbinding og cytokin-medieret bioaktivitet [17] – [ ,,,0],21], der er analog med IL-6 [39]. Begge placeringer er placeret tæt på hinanden i disse modeller og besætte den C-terminale ende af fire-helix bundt struktur, som ligger overfor BC-sløjfen. Lignende strukturelle og mutagenese-baserede undersøgelser af gp130-type cytokiner (VIL-6, CNTF og LIF) impliceret rester i BC-sløjfen i receptor anerkendelse og bioaktivitet [44] – [46]. Men sådanne rester var en del af sted II eller sted III (til interaktion med gp130 eller gp130 /LIF receptor), og ikke stedet I. Især demonstrerede krystalstrukturen af ​​IL-6-receptor-kompleks hexamer ingen rolle i IL-6-receptor binding til BC-sløjfen, som vender den N-terminale region af D2 i det andet gp130-molekylet [47]. Vore data viser, at CGRRAGGSC er et peptid efterligner af IL-11, og som sådan er i stand til at genkende og binde til IL-11Rα at aktivere cellesignalering og proliferation. Selv om det generelt antages, at modellen for cellen membranbundne IL-11-receptorkomplekset ville svare til den for IL-6 [26], [47], visse strukturelle karakteristika i de komplekse underenheder kan faktisk betydeligt. For eksempel bemærkede vi, at der findes fire urapporteret leucin-zippere inden IL-11 (tre af dem strækker sig fra BC-sløjfen gennem helix C, figur 6). De har ingen klar parallel blandt de fleste andre gp130-type cytokiner (kun OSM og CT-1 ser ud til at indeholde en af ​​disse regioner). Desuden er der to IL-11Rα membranbundne isoformer, som adskiller sig ved tilstedeværelsen eller fraværet af et cytoplasmatisk domæne, hvorimod IL-6Ra har kun én form med en længere cytoplasmatiske hale [48]. Sådanne isoformer kunne deltage i dannelsen af ​​en receptor kompleks i modsætning til dem observeret i IL-6Ra kompleksdannelse. Fremtidige detaljeret røntgenkrystallografi af IL-11-receptorkomplekset vil yderligere belyse disse fine strukturelle træk.

Funktionelt IL-11 mimic peptid CGRRAGGSC viste biologiske virkninger der medieres af IL-11Rα (koncentrationsafhængig stimulering af celleproliferation) både i nærvær og i fravær af IL-11. Endvidere CGRRAGGSC-medieret celleproliferation i nærvær af sIL-11Rα blev reduceret, og i en større grad i nærvær af nativt IL-11, men blev ikke påvirket af et ikke-beslægtet kontrol-receptor. Baseret på disse resultater, kunne man spekulere på en interaktion mellem peptidet CGRRAGGSC og komplekset IL-11 /IL-11Rα. Faktisk var det opløselige peptid CGRRAGGSC sig at inducere STAT3 phosphorylering på den samme måde som IL-11 native cytokin. Disse resultater har biologisk præcedens i andre systemer. Wrighton et al. [49] isoleret peptider, der binder til og aktiverer erythropoietin-receptoren (EPOR); krystallografisk analyse af receptorkomplekset viste et peptid, der genererede et funktionelt symmetrisk arrangement af EPOR [50]. Cwirla et al. [51] valgt peptidagonister for thrombopoietin receptoren og foreslog en aktiveringsmekanisme. Nylige undersøgelser har også vist, at orienteringen og opholdstiden for ligand-receptorer skal overvejes til aktivering [52], [53]. Desuden peptider udvalgt til binding til bestemte receptorer binde til flere steder på receptoren og aktivering kan forekomme gennem konformationsændringer i stedet multimerisering [54].

Fra en supramolekylær synspunkt, IL-11 receptor kompleksdannelse er efter al sandsynlighed indviklet: liganden cytokin (IL-11) kan være nødvendigt at binde først til en præsenterende receptorunderenhed (IL-11Rα) og efterfølgende rekruttere en dimer af signaling underenheder (dvs. gp130). Undersøgelser af den tilknyttede IL-6-receptor-kompleks støtte den påstand, at foruddannede inaktive dimerer af receptorunderenheder eksisterer i cellemembraner [28], [55], [56]. Tidligere rapporter fastslået, at gp130-dimerisering ikke er tilstrækkelig for receptoraktivering, og at der kræves aktiv konformationel justering for en biologisk respons [14], [57] – [59]. Derfor er det muligt, at det opløselige peptid CGRRAGGSC i kompleks med IL-11Rα kunne styrke gp130-dimerisering og /eller inducere en signalering-kompetent konformation.

Styrken af ​​at kombinere forskellige funktionelle assays (steddirigeret mutagenese af native proteiner i tandem med ELISA plus peptid-alanin scanning i tandem med målrettet fag bindingsanalyser) med strukturelle studier (NMR-baserede spektroskopi af peptidet-receptor interaktion) kan overvinde nogle af de begrænsninger af mutationsmønstre studier ved bestemmelsen af ​​bindingssteder af ligand-receptor-interaktioner (såsom vanskelig gen /protein-ekspression og mutantprotein misfoldning eller sterisk hindring).

sammenfattende har vi vist, at (i) RRAGGS sekvensen (svarende til et sted i human IL-