PLoS ONE: Den Handling mekanisme af Myc Inhibitor betegnes Omomyc Kan give fingerpeg om, hvordan man Target Myc for Cancer Therapy

Abstrakt

Seneste beviser peger på Myc – en mangefacetteret bHLHZip transkriptionsfaktor dereguleret i de fleste menneskelige kræftformer – som et prioriteret mål for terapi. Hvordan til at målrette Myc er mindre klart, givet sin deltagelse i en lang række vigtige funktioner i raske celler. Her rapporterer vi på handling mekanisme i Myc forstyrrende molekyle kaldt Omomyc, som viste forbløffende terapeutiske virkning i transgene mus kræftmodeller

in vivo

. Omomyc virkningsmekanisme er forskellig fra den, der kan opnås ved gen-knockout eller RNA-interferens, tilgange designet til at blokere alle funktioner af et genprodukt. Dette molekyle – i stedet – synes at forårsage en kant-specifik forstyrrelse, der ødelægger nogle protein-interaktioner af Myc-knudepunktet og holder andre intakt, med det resultat at omforme Myc transkriptom. Omomyc selektivt rettet mod Myc protein interaktioner: det binder c- og N-myc, Max og Miz-1, men ikke binder Mad eller vælg HLH proteiner. Konkret forhindrer Myc binding til promoter E-kasser og transaktivering af målgener samtidig bevare Miz-1 binding til initiativtagere og transrepression. Dette ledsages af brede epigenetiske ændringer såsom nedsat acetylering og forøget metylering på H3 lysin 9. I nærværelse af Omomyc er Myc interactome kanaliseres til undertrykkelse og dets aktivitet synes at skifte fra en pro-onkogen til en tumor undertrykkende én. Givet den ekstraordinære terapeutiske virkning af Omomyc i dyremodeller, antyder disse data at held målretning Myc til cancerterapi kan kræve en lignende dobbelt handling, for at undgå Myc /Max-binding til E-bokse og, samtidig, holde undertrykke gener der ville blive undertrykt af Myc

Henvisning:. Savino M, Annibali D, Carucci N, Favuzzi E, Cole MD, Evan GI, et al. (2011) Den virkningsmekanisme af Myc Inhibitor betegnes Omomyc Kan give fingerpeg om, hvordan man Target Myc for Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (7): e22284. doi: 10,1371 /journal.pone.0022284

Redaktør: Laszlo Tora, Institut for Genetik og molekylær- og cellebiologi, Frankrig

Modtaget: November 2, 2010; Accepteret: 23 juni 2011; Udgivet: 21 Jul 2011

Copyright: © 2011 Savino et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra AIRC, ASI, MIUR og Fondazione Guido Berlucchi (SN), en Bjørn Necessities Pediatric Cancer Foundation tilskud (LS), en CNR kortsigtet mobilitet fællesskab (SN) og ved CNR – Sapienza University ph.d.-stipendier (MS, DA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

myc transkriptionelle regulatorer – C-, N- og L-myc – er grundlæggende, helix-loop-helix, leucin-zipper (bHLHZip) proteiner, der binder til en matrix af genomiske sider for at enten inducere eller undertrykke transskription af gener er vigtige for cellevækst, metabolisme og differentiering [1] – [4]. Disse faktorer – især c-myc og N-myc – er dereguleret i størstedelen af ​​humane cancere. Dette er normalt ikke grund til

Myc

genmutation, men resultaterne fra opstrøms mutationer påvirker andre onkogener eller tumor undertrykkere. Myc-aktivitet synes således at være nødvendig for udvikling og vedligeholdelse af de fleste tumorer, selv når initieres af andre årsager. I tumorer induceret af Myc opregulering i transgene mus, selv korte Myc deaktivering udløser tumorregression ledsaget af vækststandsning, differentiering og kollaps af tumoren karsystemet [5]. Myc opererer inden for et meget sammenhængende interactome netværk og en mulig strategi for at målrette Myc onkogen funktion er dominerende indblanding Myc protein interaktioner. I denne henseende Myc Oligomeriseringsdomænet – den bHLHZip regionen – til bevist kunne overvejende inhibere Myc transformerende evne i rotte embryo fibroblastceller [6], [7]. Dette domæne medierer direkte interaktion med Max og sekvensspecifik binding til specifikke konsensussekvenser – E- kasser – i promotorer af aktiverede målgener. Den bHLHZip domæne er også involveret i interaktionen med andre partnere – såsom Miz-1 – der formidler transkriptionel repression af Myc [4], [8]. At interferere med Myc protein-protein interaktioner, vi udviklet en dominant negativ molekyle ved indføring fire udvalgte mutationer i bHLHZip region af humant c-myc. Den resulterende 90 aminosyrer miniprotein – betegnet Omomyc for sin evne til at danne homodimerer – kan inhibere c-Myc /Max forening, at påvirke transkriptionel aktivering med c-Myc, og at forbedre c-Myc afhængig apoptose i vævskulturceller [9 ], [10]. Det blev vist at forhindre c-Myc induceret papillomatose

in vivo

uden at påvirke vævshomeostase [11] tyder en kapacitet på målretning tumorceller uden at beskadige normale væv.

Trods sin gennemtrængende rolle i den menneskelige kræft, Myc mødt med betydelig skepsis som et terapeutisk mål siden sit krav om spredning og vedligeholdelse af voksne stamceller rum rejst bekymring over giftigheden af ​​Myc hæmning for sunde væv [12], [13]. Delvis takket at arbejde på Omomyc potentiale Myc som et terapeutisk mål nu er etableret. Mange tvivl om selektivitet for tumorer er blevet fjernet af undersøgelser, der viser, at forbigående hæmning Myc i huden, intestinal epitel og andre væv ikke dramatisk ændre vævshomeostase [11], [14], [15]. Effekt og sikkerhed af Myc målretning

à la Omomyc

er blevet endegyldigt påvist ved reversibel udtryk for Omomyc i transgene modeller [16], [17]. Systemisk udtryk for Omomyc svækket proliferation i hurtigt delende væv, men dette var veltolereret; vævshomeostase blev opretholdt, ingen apoptose blev observeret i normale væv, og alle bivirkninger blev let vendt efter Omomyc fjernelse. I Ras-drevne lungetumorer, virkningen af ​​Omomyc var imponerende. Mus kontinuerligt udtrykker Omomyc undladt at udvikle lunge adenocarcinom. Hos mus, der tidligere havde udviklet fremskreden cancer, induktion af Omomyc udløste tumorregression som blev ledsaget af reduceret proliferation og øget apoptose af tumorvævet [16]. En analog anticancer virkning blev fundet i en abevirus 40 (SV40) -driven pancreas-ø tumormodel [17], i brystcancer (G. Evan, personlig meddelelse) og gliom (under forberedelse). Så manipulere Myc funktion på samme måde som Omomyc kan have potentiale af en effektiv anticancer strategi for forskellige tumortyper.

I betragtning af de slående egenskaber af dette molekyle, er det yderst relevant at belyse dets virkningsmekanisme. Omomyc biologiske effekter er simpelthen resultatet af

tout domstol

Myc funktion ablation, da det ville forekomme med Myc gen eller mRNA knockouts? Det er klart, at forklare de bemærkelsesværdige egenskaber af Omomyc er det vigtigt at forstå, om de følger af selektiv målretning af Myc interactome og hvordan de indflydelse på Myc aktiverede og fortrængte mål. Disse spørgsmål behandles i det foreliggende arbejde.

Vores data viser, at Omomyc ikke forårsager en global hæmning af Myc funktion, men fungerer som en kant-specifik forstyrrelse af Myc interactome, kanalisering dens aktivitet mod transrepression. Dette kan være nøglen til dens succes som et middel mod cancer.

Resultater

Omomyc selektivt rettet mod Myc interactome

Direkte fysisk interaktion med bHLHZip protein Max er afgørende for Myc funktion : Myc /Max-komplekset binder DNA – anerkende E-bokse – og fungerer som en transskriptionel aktivator [18]. Omomyc kan homodimerize, til dannelse heterodimerer med c-myc og Max-proteiner, og at interferere med c-Myc /Max-kompleksdannelse og binding til E-bokse in vitro [9], [10]. For bedre adresse Omomyc selektivitet undersøgte vi dens evne til at binde N-Myc – som deler væsentlig funktionel redundans med c-myc og har vigtige roller i tumordannelse i nervesystemet -, Mad – en strengt relateret bHLHZip faktor, der dimeriserer med Max, binder E-bokse og fungerer som transskriptionsrepressor [4] -, Heb og Id1 – to HLH-proteiner repræsenterer en stor familie af transkriptionelle regulatorer impliceret i udviklingsmæssige processer [19]. For at vurdere evnen til at binde N-Myc udførte vi immunopræcipitationer på 293T-celler ektopisk udtrykker Omomyc fusioneret til estrogenreceptoren ER ™ – Omomer [10] – sammen med FLAG tagged C- eller N-myc. Vi fandt, at Omomyc bundet til N-Myc ligeledes til c-Myc (figur 1A) efter aftale med det virtuelle identitet bHLHZip domæne aminosyresekvenser af Myc familiens proteiner. For at vurdere binding til Max, Mad og de to HLH proteiner Heb (en E protein) og ID1 vi udførte pull-down-analyser med GST-linked Max, Mad, Heb og Id1 på ekstrakter af 293T-celler ektopisk udtrykker FLAG-mærket Omomyc. Ud fra følgende betragtninger binding til Max var stærk som tidligere rapporteret [9], Omomyc binding til Mad var knap synlige og binding til Heb og Id1 var ikke målbart (figur 1B). Den svage signal i GST-Mad pull-down er sandsynligvis på grund af de meget høje niveauer af FLAG-Omomyc udtryk i de transficerede celler og ikke reflekterende fysiologisk samspil mellem de to proteiner. Sammenfattende fandt vi, at Omomyc bindingsspecificitet for Max og Mad proteiner var den samme som Myc. I lighed med Myc, betyder Omomyc ikke ud til at interagere med HLH proteiner og derfor ikke virke ved at forstyrre HLH protein netværk afgørende for differentiering kontrol [20] – [22]. Vi spurgte wether Omomyc interagerede med hypoxi-inducerbare faktor 1-alfa (HIF-1α), et protein, der fungerer som en master transkriptionel regulator af det adaptive respons på hypoxi, spiller en væsentlig rolle i tumorangiogenese og viser en betydelig samspil med Myc i reguleringen af ​​flere glycolytiske gener [23] – [25]. HIF-1α indeholder et bHLH-domæne og antagoniserer Myc ved binding til Max [24]. For at undersøge Omomyc binding til HIF-1α udførte vi immunopræcipitationer på 293T-celler ektopisk udtrykker FLAG tagged Omomyc sammen med HIF-1α. Vi fandt (Fig. 1C), som Omomyc ikke binder HIF-1α, mens Max gør som rapporteret. Tilsammen disse eksperimenter viser tydeligt, at Omomyc er Myc-Max-Mad netværk specifikke og – inden for dette netværk – selektivt påvirker Myc /Max dimerisering, der kræves for Myc binding til E-bokse og transaktivering af et stort antal gener

A) Omomyc binder c-myc og N-myc. Immunoblotting (WB) med FLAG og ER-antistoffer – som angivet – af immunoudfældninger udført med FLAG antistoffer på 293T celler transficeret med FLAG-c-myc eller FLAG-N-myc udtrykker vektorer sammen med Omomer udtrykke vektor. B) Omomyc binder Max men ikke Mad og to repræsentative HLH proteiner. Immunoblotting (WB) med FLAG antistoffer af GST pull-down assays udført med GST, GST-MAX, GST-MAD, GST-ID1 og GST-HEB (10 ìg hver) på 293T-celler transficeret med FLAG-Omomyc udtrykkende vektor. 293T-celler transficeret med ID2 eller FLAG-13i [65] udtrykkende vektorer blev anvendt som positiv kontrol for GST-HEB og GST-ID1 hhv. Uddrag fra bakterier, der udtrykker His-MAX blev anvendt som positive kontroller for GST-MAX og GST-MAD. C) Omomyc ikke binder HIF-1α. Immunoblotting (WB) med HIF-1a, Max og FLAG antistoffer – som angivet – af immunoudfældninger udført med FLAG antistoffer på 293T celler transficeret med HIF-1α, Max og FLAG-Omomyc udtrykker vektorer. D) Omomyc binder Miz-1. Immunoblotting (WB) med Miz-1 og ER-antistoffer – som angivet – af immunoudfældninger udført med Miz-1-antistoffer på 293T-celler cotransficeret med Miz-1 og Omomer udtrykker vektorer

Et centralt aspekt af Myc. funktion er transrepression af talrige gener involveret i vækstkontrol, differentiering og tumor suppression [4]. Denne aktivitet synes ikke at implicere direkte Myc binding til E-bokse. Myc rekrutteres til initiativtagere til undertrykte gener kun indirekte, ved interaktion med proteiner, der direkte binder til disse initiativtagere. Den bedst kendte af dem er Miz-1, et zinkfinger-protein involveret i Myc afhængige undertrykkelse af cellecyklusinhibitorer – p15-INK4b (cyklin-afhængige kinase 4 inhibitor B) og p21 (CDKN1: cyclin-afhængig kinase inhibitor 1) – og i Myc afhængig apoptose som respons på vækstfaktor tilbagetrækning [26] – [29]. Formentlig i kompleks med Max, Myc kontakter Miz-1 N-terminale region gennem aminosyresteder D394 og S405 [28], som er placeret i HLH region. Da disse steder ikke er muteret i Omomyc, vi hypotese, at Omomyc bevaret evnen til at binde Miz-1. Vi testede denne mulighed via immunudfældning på 293T-celler ektopisk udtrykker Omomer og Miz-1. Figur 1D viser, at Omomyc direkte interagerer med Miz-1. Endogen Miz-1 blev rapporteret at akkumulere i cytoplasmaet af celler, med en mindre fraktion i kernen; Myc overekspression udløser nuklear translokation af Miz-1 og binding i diskrete inde i kernen foci [30]. For at undersøge interaktionen og intracellulær lokalisering af Omomyc, Omomyc /Miz-1 og Omomyc /c-myc-komplekser, transficerede vi 293T-celler med FLAG tagged Omomyc eller c-Myc udtrykkende plasmider sammen med plasmider, der udtrykker umærket Miz-1 og c-Myc, og påvist proteinlokalisering ved immunfluorescens med anti FLAG, c-Myc, og Miz-1-antistoffer (figur 2). I celler transficeret med enkelt ekspressionsplasmider, Miz-1 var hovedsagelig (ca. 90%) lokaliseret i cytoplasmaet som tidligere beskrevet [30], Myc var udelukkende til stede i kernen som forventet, og Omomyc var stort set i kernen (ca. 85% ) med en mindre del i cytoplasmaet (figur 2). Omomyc mangler kernelokaliseringssignalet af Myc proteiner: det kan komme ind i kernen på grund af sin lille størrelse eller ved dimerisering med endogen Myc eller Max. Når cotransficeret, mest Myc proteiner co-lokaliseret med Omomyc i kernen; en brøkdel af Omomyc forblev i cytoplasmaet – ikke er associeret med Myc – sandsynligvis på grund af et højere niveau af ekspression. Ektopisk Myc ekspression udløst nuklear translokation af Miz-1 (ca. 40%) og dannelse af diskrete subnuclear foci, som tidligere rapporteret [30]. Miz-1 blev delvist flyttet i kernen i nærvær af et overudtrykt Omomyc samt (ca. 35%). Endogen Miz-1 – som er til stede i lave mængder i celler [30] -. Vil formodentlig være hovedsagelig i kernen i nærvær af et overudtrykt Myc eller Omomyc

A) Immunofluorescens mikrofotografier af 293T-celler transficeret med Miz -1, c-Myc, FLAG-c-myc og FLAG-Omomyc udtrykkende plasmider – som anført ovenfor paneler – og farvet med antistoffer mod FLAG (grøn), Miz-1 (rød) og c-myc (rød) som angivet inde paneler. Kerner af de samme områder blev farvet i blåt med DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol). B) Kvantificering af forsøgene er vist i A), baseret på en undersøgelse af 15 mikroskopi felt og mindst tre biologiske replikater.

Alt i alt, disse resultater viser, at forstyrrelse af Myc interactome af Omomyc resultater ikke kun fra hæmning af Myc binding til Max – som er nødvendig for E-box binding og transaktivering – men også fra interaktionen af ​​Omomyc med Miz-1, et Myc bindende partner involveret i transrepression

Omomyc påvirker. transkriptionel respons af fibroblaster til serum stimulation

Myc proteiner er i stand til at binde til 10-20% af genomisk loci og til at modulere ekspression af hundreder til tusinder af gener. Omomyc blev vist at forringe transaktivering af Myc aktiverede målgenet

cad

i Rat1 fibroblaster og ikke at påvirke nedregulering af Myc undertrykte target

GADD45

[10]. For at få et indblik i udbredte genekspression ændringer påvirket af Omomyc, vi analyserede transkriptionelle respons på serum stimulering af Rat1 fibroblaster stabilt inficeret med en Omomer producerer eller en tom retrovirus (Rat1-Omomer og Rat1-kontrol celler, henholdsvis som beskrevet i [ ,,,0],10]). c-Myc er kendt for at blive nedreguleret af serum sult og skarpt induceret af serum tilsætning – sammen med en række andre umiddelbare tidlige gener – toppede efter 1 til 2 timer; c-Myc-induktion har en rolle i cellecyklus genindførsel [31] – [33]. Bortset fra celleproliferation, serum respons af fibroblaster integrerer andre processer – e. g. sårheling [34] – og serum regulerede gener indbefatter gener, som reguleres af Myc samt gener, der ikke er. Celler blev serum-udsultet før serumstimulering og mRNA-ekspression blev analyseret på tidspunktet for serum re-tilsætning (tid 0) og 90 ‘derefter – til tidspunktet, hvor Myc-induktion er maksimal – således at induktion af en direkte Myc mål bør nøje følge ekspressionen af ​​Myc. mRNA-ekspression blev analyseret via et oligonukleotid array med prober til ca. 7.000 sekvenser i fuld længde og 1.000 EST (udtrykte sekvensmærker) klynger. Dataene er tilgængelige i databasen GEO med efter tiltrædelsen nummer: GSE25039. Relativ mRNA ekspression værdier (Fold ændringer) blev beregnet ved at tage som reference Rat1-kontrol celler ved tid 0; Kun gener viser en gange ændring på mindst +3 (opreguleres gener) eller -3 (nedreguleret gener) blev taget i betragtning. På tidspunktet for serumstimulering, Omomer udtrykke og styre Rat1 celler udviste en næsten identisk genekspressionsprofil (figur 3, øverst). På 90 min af serum induktion 111 sekvenser blev opreguleret og 96 nedreguleret i Rat1-kontrol celler. Påfaldende, blev en udtalt nedregulering findes i Rat1-Omomer celler: så mange af 516-gensekvenser blev nedreguleret og 143 opreguleret (tabel S1). Samlet, det samlede antal af sekvenser, hvis ekspression var op eller nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​Omomyc efter 90 min af serum stimulation udgjorde 8,2% af proberne på arrayet. Blandt sekvenserne nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​Omomyc, 475 repræsenterede gener med kendt GeneID (gen identifier) ​​og 41 andre transkriberede regioner. For at finde ud af, om gener nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​Omomyc også blev valideret Myc mål, vi sammenlignede dem til det sæt af gener opført i Myc Cancer Gene database (www.myccancergene.org), en samling af Myc responsive gener identificeret i uafhængige undersøgelser gennem en række teknikker [35]. 115 (24%) af de 475 gener nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​Omomyc optaget i Myc målgenet database: 45 blev opført som opreguleres og 35 som nedreguleres af Myc, mens op eller nedregulering af de resterende 35 gener var ukendt. At påpege direkte Myc mål inden listen over gener nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​Omomyc blev listen krydset med dem fra to studier, der brugte chip analyse til at definere genom bred promotor belægning af Myc i embryonale stamceller (ES) celler [36], [37]. 31,5% af de gener nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​Omomyc havde initiativtagere, der blev rapporteret til at være bundet direkte af Myc i ES-celler (P-værdi: 1,3 × 10

-24) sammenlignet med 19% i sit fravær (P- værdi: 3 × 10

-2). I alt 44,4% af Omomyc nedreguleret gener viste sig at være ægte Myc mål ifølge enten Myc målgener database eller opførelse af Myc bundne initiativtagere i ES-celler (Venn-diagram: Figur 4A). Gener er fælles for alle tre grupper er grupperet i en dimension i figur 4B. Et så stort – omend ufuldstændige – overlap blandt gener, hvis nedregulering var forbundet til Omomer aktivering i Rat1 fibroblaster og valideret Myc mål er stærkt signifikant. At overlapningen er ufuldstændig, er i overensstemmelse med andre analyser af udtryk og beregningsmæssigt afledte gen sæt [38], [39], og det kan være skyldes til dels andre effekter af serum. Figur 3 (midten) viser klassificeringen i funktionelle kategorier baseret på GO (Gene ontologi) vilkår. Som rapporteret for gener associeret med c-Myc-aktivitet [36], [40], [41], gener ramt af Omomyc falder i flere funktionelle grupper, der involverer vækst, metabolisme, celle signalveje, cellecyklusprogression, og apoptose. Især blev generne nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​Omomyc beriget i kategorier – nukleotid og nukleinsyre metabolisme – som er overrepræsenteret blandt målene opreguleres ved c-Myc [36], [40] – [42], støtter begrebet Omomyc som en inhibitor af Myc medieret transaktivering (fig 3, nederst). Mål, der vides at være opreguleret af Myc og fundet at være nedreguleres af Omomyc indbefatter gener der koder for proteiner er direkte involveret i oversættelse og ribosom montage – såsom translationsinitiering faktor Eif3s9, oversættelsen elongeringsfaktor Eef1a1, og det ribosomale protein L3 og S4 – samt som gener, der koder metaboliske enzymer – isocitratdehydrogenase 2, lactat dehydrogenase B og phosphoglyceratkinase 1 -, proteiner involveret i cellecyklusprogression – det anafase-fremmende kompleks subunit Anapc5, cyclin B1 og cyclin D1 -, ​​ATPase /DNA helicase TIP49 (Ruvbl1) , og det strukturelle kromatin protein HMGB1. HMGB1 har en vigtig rolle i kromatin remodellering og er en mediator af inflammation, hvis overekspression er forbundet med mange tumortyper [43]. TIP49 er en vigtig Myc cofaktor, der er involveret i Myc transskriptionelle og onkogene funktioner [44]. Adskillige gener fundet at være nedreguleres af Omomyc og kendt for at være Myc undertrykt mål koder for proteiner involveret i signalveje, celleadhæsion og transskription – såsom Akt1, erbB2, c-Jun og fibroblastvækstfaktorreceptor FGFR1 – mens

Mxi1

koder for et protein, som interagerer med Max og negativt regulerer Myc funktion.

Mxi1

undertrykkes af Myc [45], men aktiveres af HIF-1α [46], [47]. Fejl i dette gen er blevet rapporteret i prostatakræft og i en delmængde af glioblastomer [48], [49].

Omomyc fremmer nedregulering af talrige gener. Top. Mange flere gener blev nedreguleret i Rat1 celler, der udtrykker Omomer (Omomer) end i celler, som ikke (kontrol) ved 90 ‘efter serumstimulering af Rat1 fibroblaster i nærvær af tamoxifen. Antallet af opregulerede gener var ens. Rat1-kontrol celler i tiden 0 blev taget som reference. Mellemøsten. Distribution i forskellige biologisk proces klasser – baseret på Gene ontologi klassifikation – af gener nedreguleret ved 90 ‘efter serum stimulering i Omomer og kontrol celler. Bund. Gener relateret til nukleotid og nukleinsyre metabolisme er den mest markant overrepræsenteret – som beregnet af Panther software -. Blandt de gener, nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​Omomyc (Omomer cellerne i nærvær af tamoxifen)

A) Venn diagram, der illustrerer overlapningen mellem gener nedreguleres ved Omomyc i den foreliggende undersøgelse, gener opført som Myc mål i Myc målgenet database (www.myccancergene.org), og gener rapporteret at være direkte bundet af c-myc i ES celler [29], [38]. Inden for Myc målgenet database og de ES-datasæt blev kun gener, der havde en sonde på Affymetrix U34A arrayet tages i betragtning. B) Overlappende, bona fide Myc målgener blev udvundet fra vores datasæt og grupperet i en dimension. C) Relativ ekspressionsniveau (Fold Skift) – målt ved real time PCR ved 90 min efter serumstimulering i nærvær eller fravær af 4-OHT – af

CCND1

,

Eif3s9

,

PGK1

,

Akt1

,

ErbB2

,

Gadd45a

,

Mxi1

mRNA i vildtype (til venstre) og Myc null (til højre) Rat1 celler, der udtrykker tamoxifen inducerbar Omomyc (Omomer).

CCND1

,

Eif3s9

,

PGK1

repræsenterer Myc aktiverede mål;

Akt1

,

ErbB2

,

Gadd45a

,

Mxi1

repræsenterer Myc undertrykt mål. Udtryk på tidspunktet for serum tilføjelse (tid 0) blev taget som reference for beregningen af ​​Fold Change.

For yderligere at validere vores resultater, vi udførte Real Time PCR-analyser i vildtype og Myc null Rat1 fibroblaster udtrykker tamoxifen inducerbar Omomyc (figur 4C). Vi sammenlignede – ved 0 og 90 minutter af serum stimulation – ekspressionsniveauerne af en udvalgt prøve af gener påvirkes af serum stimulation, som vides at være enten undertrykkes –

Gadd45a

,

Mxi1

,

erbB2

,

Akt1

– eller aktiveret –

PGK1

,

Eif3s9

,

CCND1

– ved Myc [40], [45 ], [50]. Disse gener, som enhver gen, er ikke eksklusive mål Myc og andre transkriptionsfaktorer moduleret eller ej ved serum kan bidrage til deres regulering. Vi fandt, at ekspressionsniveauerne af de undertrykte mål

Gadd45a

,

Mxi1

,

ErbB2

Akt1

i vildtype Rat1 celler var upåvirkede eller endda mere undertrykt i overværelse af Omomyc mens opregulering af de aktiverede mål

PGK1

,

Eif3s9

CCND1

blev kompromitteret (figur 4C, til venstre). I de Myc nul-celler, fandt vi, at Omomyc ikke afgørende påvirket ekspression af undertrykte og forringede ikke opregulering af de aktiverede mål (figur 4C, højre). Derfor effekten af ​​Omomyc på transskription af Myc aktiverede mål synes at kræve nogle aktivitet Myc.

Alt i alt disse resultater viser, at Omomyc ikke globalt hæmmer Myc funktion i transkriptionel regulering af målgener og foreslå, at det selektivt forstyrrer den Myc transkriptomet ved at hæmme Myc medieret transaktivering og bevare Myc medieret repression.

Omomyc differentielt påvirker transaktivering og undertrykkelse ved at påvirke Myc binding at målrette genpromotorer

for at undersøge de mekanismer, der er involveret i genregulering af Omomyc udførte vi luciferasereporter og chromatin immunopræcipitation (chip) assays af to gener kodende for nucleolar protein nucleolin og cyclin-afhængig kinase inhibitor p21 henholdsvis repræsenterer ægte og direkte mål for Myc medieret aktivering og repression [51], [52]. c-Myc er i stand til at aktivere

nucleolin

transkription via to stærkt konserverede E-bokse i intron 1 [51]. For at teste evnen af ​​Omomyc at inhibere Myc medieret transkriptionel aktivering, udførte vi reporterassays i 293T-celler transficeret med luciferasereporterplasmid pNucL14 [51] – indeholder muse

nucleolin

promotor, exon 1, intron 1 og første 8 nt af exon 2 – sammen med forskellige kombinationer af FLAG-c-myc og Omomyc ekspressionsplasmider (figur 5A). Vi fandt, at Omomyc inhiberede Myc medieret aktivering af luciferase reporter på en dosisafhængig måde, mens det ikke påvirker dens basale aktivitet. For at teste, om hæmning af

nucleolin

transaktivering med Omomyc skyldtes en reduktion af promotor binding, vi målte mængden af ​​Myc bundet til

nucleolin

promotor på 293T celler transficeret med

nucleolin

reporter, FLAG-c-myc og Omomyc udtrykker plasmider. Inddrivelse af

nucleolin

DNA copræcipiteret med Myc blev kvantificeret ved real-time PCR, ved anvendelse af primere placeret omkring de to E-bokse i

nucleolin

intron 1. Vi fandt, at Omomyc forårsagede en 40% reduktion af mængden af ​​promotoren bundet Myc (figur 5B, til venstre). Udover at konkurrere om Myc /Max forening, Omomyc er i stand til at danne homodimerer samt Omomyc /Maks dimerer: kun de sidstnævnte binder E-kasser

in vitro

med høj effektivitet [9]. Derfor Omomyc kan påvirke Myc binding til DNA via to samstemmende mekanismer: hæmning af Myc /Max dimerisering samt direkte konkurrence for E-boks bindende. For at vurdere sidstnævnte målte vi mængden af ​​Omomyc bundet til

nucleolin

promotoren i celler transfekteret med c-myc og FLAG-Omomyc udtrykkende plasmider (figur 5B, til højre). Vi fandt, at Omomyc specifikt blev rekrutteret til E-boxen indeholdende region i intron 1, og at den konkurrerede med c-Myc for binding til denne region. Tilsammen indikerer disse data, at Omomyc kan påvirke transaktivering med at udskille Myc i komplekser stand til at binde til E-kasser samt ved at handle – formentlig i samarbejde med Max -. Som kompetitiv inhibitor af Myc /Max komplekser til E-Box binding

A) Luciferaseaktivitet af musen

nucleolin

promoter reporter plasmid – pNucL14 – transficeret i 293T-celler sammen med FLAG-c-myc og Omomyc udtrykker vektorer. Data blev normaliseret ved cotransfektion af pRL-TK Renilla luciferase. Den basale aktivitet af reportergenet blev indstillet til en værdi på 100. B) Kvantitativ ChIP assay af Myc og Omomyc binding til

nucleolin

promotorregionen (NCL; grå søjler). Venstre: FLAG-c-Myc bindende i 293T-celler transficeret med

nucleolin

reporter pNucL14 sammen med FLAG-c-myc og Omomyc udtrykkende plasmider. Til højre: FLAG-Omomyc bindende i 293T celler transficeret med

nucleolin

reporter sammen med FLAG-Omomyc og c-myc udtrykker plasmider. En region af

luciferase

kodende sekvens (Luc, sorte søjler) blev anvendt som kontrol. Søjler repræsenterer procentdelen af ​​indført DNA immunopræcipiteret, efter baggrundssubtraktion. CHIP værdier er udtrykt som% af input DNA

For at undersøge, hvordan Omomyc kan virke til at understøtte Myc medieret repression, vi gennemførte analyser på det menneskelige

p21

promotor -. Specifikt sekvensen bestod mellem -194 og 16 fra det transkriptionelle startsted – hvor Myc er ansat af zinkfingerproteinet Miz-1 [27], [52]. Vi udførte reporter assays og fandt, at luciferaseekspression drevet af fuldlængde human

p21

promotor – p21Cip1-Luc [53] – blev inhiberet af c-myc og at Omomyc var synergisk med c-Myc (figur 6A ). Interessant – selv i mangel af en cotransficerede c-myc – Omomyc provokeret

p21

promotor undertrykkelse til niveauer svarende til dem, der forårsages af c-myc. Derfor Omomyc er i stand til at understøtte

p21

promotor undertrykkelse både i nærvær og fravær af en over-udtrykte c-myc. For at undersøge om dette var forbundet til øget promoter binding, udførte vi chip assays på 293T-celler transficeret med p21 reporter sammen med FLAG-Myc og stigende mængde Omomyc plasmid. Vi observerede, Omomyc markant forøget c-Myc-binding til -194 til +16 regionen (figur 6B, øverst). Interessant gensidig assay på celler transficeret med FLAG-Omomyc og stigende mængde af c-myc-plasmidet viste, at Omomyc var i stand til interaktion med den samme

p21

promotorregionen (figur 6B, nederst). I dette tilfælde har Myc overekspression ikke konkurrere med Omomyc bindende.