PLoS ONE: Forkhead Box Protein O3 Transskription Factor Negativt Regulerer Autophagy i humane cancerceller ved at hæmme Forkhead Box Protein O1 Expression og Cytosoliske Ophobning

Abstrakt

FoxO proteiner er vigtige regulatorer i cellulær metabolisme og indregnes som knudepunkter i flere signalveje, især dem, der involverer PI3K /AKT og mTOR. FoxO proteiner fungerer primært som transkriptionsfaktorer, men nylig undersøgelse tyder på, at cytosole FoxO1 deltager i reguleringen af ​​autofagi. I den aktuelle undersøgelse, finder vi, at cytosolisk FoxO1 faktisk stimulerer cellulær autofagi på flere cancer-cellelinjer, og at det regulerer ikke blot basal autophagy men også, at induceret af rapamycin og som reaktion på næringsstoffer afsavn. Disse resultater illustrerer betydningen af ​​FoxO1 i cellemetabolisme regulering uafhængig af dens transkriptionsfaktor funktion. I modsætning til FoxO1, finder vi den nært beslægtede FoxO3a er en negativ regulator af autofagi på flere cancer-cellelinjer, ikke tidligere indregnet funktion for dette protein, forskellig fra dens funktion i godartede fibroblast og muskelceller. Induktion af autophagy ved knockdown af FoxO3a viste sig ikke at være medieret gennem undertrykkelse af mTORC1 signalering; snarere blev den regulerende rolle FoxO3a på autofagi bestemt til at være gennem sin evne til transkriptionelt undertrykke FoxO1. Denne komplicerede samspil mellem FoxO1 og FoxO3a foreslår en kompleks checks- og balancer-forhold mellem FoxO3a og FoxO1 i reguleringen autofagi og cellemetabolisme

Henvisning:. Zhu WL, Tong H, Teh JT Wang M (2014) Forkhead Box Protein O3 Transskription Factor Negativt Regulerer Autophagy i humane cancerceller ved at hæmme Forkhead Box Protein O1 Expression og Cytosoliske Ophobning. PLoS ONE 9 (12): e115087. doi: 10,1371 /journal.pone.0115087

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget: Juli 17, 2014 Accepteret: November 18, 2014; Udgivet: December 29, 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Styrelsen for Videnskab, Teknologi og Forskning (A * STAR) og National Medical Research Council of Singapore. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Autophagy er en højt bevaret cellulær proces, central respons celle til ernæring /energi samt vækst faktor status [1], [2]. Korrekt, en af ​​de største opstrøms regulatorer af autofagi er PI3K-AKT-mTOR signalering, sensorer til vækstfaktorstimulering, aminosyre og celle energiniveauer der er centrale for cellevækst og proliferation [3] – [5]. Faktisk er autofagi reguleres parallelt med cellulær metabolisme og proliferation, danner en integreret reaktion på de ydre og indre miljø. For eksempel, når næringsstoffer og energi niveauer opfattes som lav, celledeling og anabolske aktivitet fald mens autofagi stiger til at give energi og makromolekyler til væsentlige cellefunktioner [6]. Mens inhibition af autofagi kan resultere i celledød, langvarig induktion af overdreven kataboliske aktivitet, såsom autophagy, kan også føre til celle død; begge disse processer kan udnyttes som nye fremgangsmåder til behandling af cancer [7] – [10]. Derfor en grundig forståelse af autophagy regulering i forskellige celle sammenhænge er vigtig i oprettelse af potentialet for terapeutisk manipulation af denne proces.

Forkhead kasse protein O transkriptionsfaktorer (Foxos) er evolutionært bevarede proteiner, der optager regulatoriske knuder i flere signalveje vigtige for den cellulære reaktion på ekstern energi, ernæring og vækstfaktor stimulationer. Som sådan er de involveret i reguleringen af ​​anabolske og katabolske tilstande af celler, og i vækst, spredning, og celledød beslutninger [11] – [17]. Det er ikke overraskende, derfor, at dysfunktion af disse proteiner indvirkninger på patologiske processer såsom diabetes, aldring og kræft [12], [16] – [19].

FoxO proteiner er blevet rapporteret til at være regulatorer af cellulær autophagy, en proces, der er nært knyttet til anabolske /kataboliske tilstand af cellen. Flere undersøgelser har vist at FoxO3a især fremmer ekspression af autophagy gener, hvilket fører til øget autofagi [20] – [22]. Disse og andre resultater har ført til den opfattelse, at FoxO proteiner generelt er aktivatorer af autophagy gennem deres funktion som transkriptionsfaktorer [23], [24]. I denne opfattelse er de funktioner af forskellige FoxO proteiner sidestilles og overlapning med hensyn til fremme af autophagy, med vævsdistribution tegner sig for deres forskellige virkninger i bestemte celle sammenhænge. En vigtig fokus for reguleringen af ​​FoxO proteiner har været på deres cellulære lokalisering, som er reversibelt reguleret af deres post-translationelle modifikationer, primært den af ​​phosphorylering [25] – [28], og acetylering [29], [30] som svar til miljømæssige stimuli. Disse post-translationelle modifikationer er tæt forbundet med den cellulære lokalisering af FoxO proteiner og deres samspil med effektorer, og derfor anses for at være vigtige i regulering af aktiviteter af disse proteiner [31], [32]. Faktisk har nylige fund foreslået, at cytosolisk FoxO1 kan fremme autofagi, som reaktion på ernæringsmæssig stress, ved direkte interaktion med Atg7, hvilket viser de komplicerede roller for denne gruppe af proteiner i reguleringen autofagi [33].

Det var for nylig rapporterede, at FoxO3a kan fremme FoxO1-afhængig autofagi i humane embryonale nyre og muse embryonale fibroblastceller, som medieres af FoxO3a opregulering af PI3K-katalytiske underenhed, efterfølgende AKT aktivering og øget cytosolisk fordeling af FoxO1 [34]. I modsætning hertil fandt vi, at FoxO3a inhiberer snarere end forbedrer, autofagi i flere cancercellelinier. Endvidere synes FoxO3a undertrykkelse af autofagi at være medieret af ned-regulering af transskription af FoxO1, giver ny indsigt i de måder FoxO3a og FoxO1 kan interagere og udøver modsatrettede effekter på cellulær autofagi. Disse opdagelser har afsløret en uventet rolle FoxO3a i autophagy, og understreger de komplekse FoxO signalering og dets biologiske virkninger i forskellige celle sammenhænge.

Materialer og Metoder

Reagenser og antistoffer

Antistoffer genkender menneskelige GAPDH, FoxO1 (C29H4), FoxO3a (75D8), p-4EBP1 (T37 /46), p-S6 (S240 /244), Atg5, Flag, og histon H3 var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA); Antistoffer til LC3 (APG8A) var fra Abgent (San Diego, CA). Proteaseinhibitoren cocktail var fra Roche (Basel, Schweiz). Alle cellelinier, der anvendes i undersøgelsen blev opnået oprindeligt fra American Type Culture Collection.

Cell kultur og narkotikabehandling

Celler blev holdt ved 37 ° C med 5% CO

2 i DMEM (Invitrogen, North Andover, MA) suppleret med 10% FBS (Hyclone, Novato, CA), 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (Invitrogen). Yderligere behandling med forskellige inhibitorer, såsom rapamycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), cycloheximid (Sigma-Aldrich), og chloroquin (Sigma-Aldrich) blev udført i DMEM suppleret med 10% FBS; detaljerne for hver behandling tilstand, er angivet i de respektive figur legende. For forskellig sult behandling, celler kultur i serum fri, eller D-glucose fri medium, hhv.

siRNA’er, primere og plasmider

siRNA-1 i FoxO1 (5’UUG UAC AGG UGU CUU CAC UUG GGU C-3 ‘), siRNA-1 i FoxO3a (5′-AUU GAC CAA ACU UCC CUG GUU AGG C-3′) og siRNA af Atg5 (5’-AUU CCA UGA GUU UCC GAU UGA UGG C 3 ‘) blev købt hos Invitrogen; siRNA-2 i FoxO1 (5’-ACA UGC UCA GCA GAC AUC UGC AGU U-3 ‘) [35] og FoxO3a (5′-GAG CUC UUG GUG GAU CAU C-3′) [36] blev syntetiseret fra Sigma- Aldrich. Forward og reverse primere til Real-time PCR var: FoxO1, 5’-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3 ‘og 5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′; FoxO3a, 5’-CTTCAAGGATAAGGGCGACAG-3 ‘og 5′-TCGTCCTGGACTTCATCCA AC-3′; Atg4c, 5’-GCAGGAGATTGGTATGGACCAGCT-3 ‘og 5′-GGATGCCTT GCTTCTTCAACTGCT-3′; LC3, 5’-AGACCTTCAAGCAGCGCCG-3 ‘og 5′-ACACTGACAATTTCATCCCG-3′; Atg7, 5’-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3 ‘og 5′-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3′; Atg12, 5’-TCTATGAGTGTTTTGGCAGTG-3 ‘og 5′-ATCACATCTGTTAAGTCTCTTGC-3′; Bnip3, 5’-GCCCGGGATGCAGGAGGAGA-3 ‘og 5′-GAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC-3′; 18S, 5’-AAGTTCGACCGTCTTC TCAGC-3 ‘og 5′-GTTGATTAAGTCCCTGCCCTTTG-3’. Flag-FoxO1 [37] og Flag-FoxO3a [38] ekspressionsplasmider blev indkøbt fra Addgene (Cambridge, MA). Flag-FoxO1-ΔDB (deletion af rester 208-220 af FoxO1) og Flag-FoxO3a-3a (alaninsubstitution af Thr 32, Ser 253 og Ser 315 FoxO3a) ekspressionsplasmider blev konstrueret ved anvendelse QuikChange II steddirigeret mutagenese kit (Stratagene , Santa Clara, CA). Flag-FoxO3a (r), som er bred typen FoxO3a protein kodet af cDNA resistente over siFoxO3a vi anvendt i undersøgelsen, blev genereret ved at mutere otte siRNA-1 i FoxO3a målretning basepar i vildtype-Flag-FoxO3a plasmidet under anvendelse QuikChange II mutagenese kit (Stratagene). Alle plasmider blev verificeret ved DNA-sekventering. Den tandem fluorescerende mRFPGFP-LC3 plasmid var en gave fra Dr. Tamotsu Yoshimori [39].

transfektion med siRNA eller ekspressionsvektorer

Transfektioner blev udført ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) baseret på producentens protokol ; De transficerede celler blev udsat for de ønskede behandlinger for 24-48 timer efter transfektion som beskrevet i respektive figurteksterne.

Cytosol-kerne fraktionering

Høstede celler blev suspenderet i kold buffer (100 mM Tris- HCI pH 7,6, 15 mM Mg (OAc)

2, 10 mM KOAc, 10 mM PMSF, 0,5% NP40, 1% protease inhibitor cocktail) og efterladt på is i 20 minutter, før centrifugering ved 2.500

g

i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatantfraktionen blev opsamlet som den cytoplasmatiske ekstrakt. Pelleten blev vasket en gang med den samme buffer før bliver suspenderet ved 4 ° C i kerner lyserer puffer (100 mM Tris-HCI pH 7,6, 42 mM NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM PMSF, 2% SDS, 1% protease inhibitor cocktail ). Efter 10 minutters inkubation på is blev suspensionen sonikeret i 3 minutter på is før centrifugering ved 12.000

g

i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatantfraktionen blev opsamlet som den nukleare ekstrakt.

immunblotting og analyse

Celler udsat for behandlingen er angivet i den relevante figur legenden blev høstet, lyseret, og proteinkoncentrationen bestemmes ifølge standard protokol. Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og immunblot-analyse blev udført under anvendelse af en forøget kemiluminescens procedure (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Konfokal imaging og analyse

Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd efterfulgt af permeabilisering med kold methanol. For celler gik gennem immunfluorescerende mærkning blev de fikserede, permeabiliserede celler inkuberet med blokeringsbuffer (5% normalt gedeserum, 0,3% Triton X-100 i PBS) i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af inkubation i passende fortyndet antistof i antistof fortyndingsbuffer (1% BSA, 0,3% Triton X-100 i PBS) natten over ved 4 ° C. Celler blev derefter vasket tre gange med PBS og efterfølgende inkuberet med enten FITC-gede-anti-kanin (1:1000) eller Rhodamin-ged anti-mus IgG sekundære antistoffer (1:1000) i givet fald i antistof fortynding buffer i 1 time ved stuetemperatur. Alle konfokale billeder blev taget med et Carl Zeiss LSM 710 konfokalt mikroskop (Oberkochen, Tyskland). Billeddata blev analyseret ved Metamorph Analysis Software (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA). Colokalisering effektivitet mRFP til den for GFP fluorescerende signaler blev målt under anvendelse ImageJ software.

Kvantitativ PCR-assay

Celler udsat for siRNA knockdown eller gen overekspression protokoller blev høstet efter standardprotokol. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Efterfølgende blev første streng cDNA syntetiseret under standardbetingelser med Superscript første streng syntese System (Invitrogen). Kvantitativ PCR blev udført med CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA). Mængden af ​​afskriften blev normaliseret til niveauet for ribosomale proteiner 18S.

Dataanalyse

Statistiske forskelle blev vurderet af Students

t

test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved p 0,05 (*) og

s

0,01 (**)

Resultater

FoxO3a negativt regulerer autofagi, i modsætning til FoxO1. som fremmer autophagy

Flere rapporter har vist, at inddragelsen af ​​FoxO proteiner i reguleringen autophagy, men den præcise måde af denne forordning og de roller, forskellige FoxO proteiner kan spille i denne proces, især roller forskellige FoxO proteiner i forskellige celle sammenhæng kræver yderligere afklaring. Suppression af FoxO1 niveauer i prostata cancer PC3 celler ved siRNA knockdown inhiberede cellulær autofagi, både under basale betingelser, og at induceret af rapamycin (fig. 1A) eller serum og glucose deprivation (fig. 1B). To siRNA’er rettet FoxO1 undertrykt autofagi i PC3 celler, som vurderet af LC3-II niveauer, hvilket tyder på et mål specifik effekt af denne forordning (Fig. 1C). Disse data er i overensstemmelse med den opfattelse, at FoxO1 er en positiv regulator af autofagi [23], [33], [34]. For at undersøge den rolle, FoxO3a i PC3-celler, blev lignende undersøgelser udført under anvendelse af siRNA målretning FoxO3a. Overraskende blev en modsat effekt observeret ved undertrykkelse af FoxO3a udtryk; siRNA’er rettet mod FoxO3a forbedret basal autofagi samt at induceret af rapamycin, målt ved lipiderede LC3 niveauer (Fig. 1D). Denne reduktion af FoxO3a udtryk yderligere forbedret autofagi induceret af enten serum eller glucose sult (fig. 1E), hvilket tyder på en generel inddragelse af FoxO3a i reguleringen af ​​autophagy som reaktion på ernæring og vækst signaler i PC3 kræftceller. Induktion af autophagy af FoxO3a undertrykkelse blev valideret med to FoxO3a målrettet siRNA’er (fig. 1 F), mindske sandsynligheden for dette er en off-target effekt. Tidligere undersøgelser i myotuber og fibroblaster har vist, at FoxO3a spiller en vigtig rolle i at fremme autofagi [20], [34]; derfor dette resultat tyder komplekse og celle kontekst-specifikke roller FoxO3a i reguleringen af ​​autofagi. Det virkede sandsynligt, at der er markante forskelle mellem muskler og fibroblastceller og epitel-afledte kræftceller i denne forordning. For at bestemme, om den overraskende negative regulering af autophagy af FoxO3a var begrænset til PC3 prostatacancerceller undersøgte vi virkningen af ​​FoxO3a lyddæmpning i HCT116 kolon og MDA-MB-231 brystkræft cellelinier. Svarende til observation i PC3-celler, knockdown af FoxO3a førte til LC3-II elevation i begge cellelinier (fig. 2A), hvilket viser denne negative regulering af autophagy ved FoxO3a er ikke begrænset til en enkelt cancercellelinie.

(A) Immunoblotanalyse af lysater fra PC3-celler transficeret med kontrol siRNA (siLuc), eller at målrette FoxO1 (siFoxO1), med eller uden rapamycin behandling. PC3-celler blev transficeret med det anførte siRNA i 48 timer før efterfølgende behandling med DMSO, 20 nM eller 100 nm rapamycin (Rap) i 24 timer forud for høst og forarbejdning. (B) PC3-celler blev transficeret med det anførte siRNA i 48 timer forud for medier ændring, hvorefter cellerne blev underkastet de angivne vækstbetingelser; disse betingelser er DMEM i nærvær (Normal) eller fravær af 10% FBS (serum -), eller i fravær af D-glucose (med 10% FBS), som angivet. Celler blev høstet 6 timer efter udsættelse for disse betingelser, og bearbejdet til immunoblotanalyse af indikerer proteiner. (C) Knockdown af FoxO1 med to målrettet siRNA’er undertrykker autofagi i PC3 celler. (D, E, F) viser lignende procedurer undersøgelse som (A, B, C), men med siRNAs målrettet FoxO3a i PC3-celler. Alle forsøg er blevet udført tre gange med lignende resultater.

(A) PC3, MDA-MB-231, og HCT116-celler blev transficeret med kontrol siRNA (siLuc), eller at målrette FoxO3a (siFoxO3a). Efterfølgende blev disse celler eksponeret for styre køretøjet eller 50 uM chloroquin 72 timer efter transfektion i 3 timer før cellelysater forberedelse til immunoblotanalyse af de angivne proteiner. (B) Konfokal mikroskopi af MDA-MB231 celle stabilt udtrykker tandem fluorescerende mRFP-GFP-LC3 efter transfektion ved enten kontrol eller FoxO3a siRNA. Billeder blev taget 72 timer efter transfektion af det angivne siRNA. (C) Kvantitativ analyse af billederne fra forsøget vist i panel B ved hjælp MetaMorph software til at bestemme det gennemsnitlige antal RFP-positive partikler per celle i kontrol (siLuc) og siFoxO3a behandlede celler. (D) colokalisering analyse af RFP og GFP fra eksperimentet beskrevet i panel B til vurdering autophagic progression. RFP og GFP colokalisering angivet med Pearson koefficienter blev analyseret ved ImageJ software. I både (C) og (D), 50 celler blev analyseret for hver betingelse. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.E.M. ( “**”,

s

0,01), og detaljerede metoder er beskrevet i eksperimentelle procedurer. (E) PC3 celler blev transficeret med kontrol siRNA (siLuc), eller at målrette Atg5 (siAtg5), FoxO3a (siFoxO3a), eller en kombination af begge, som angivet. Celler blev høstet 72 timer efter transfektion og lysaterne blev forarbejdet til analyse.

Mønstret for alene LC3-I og LC3-II-niveauer ikke er tilstrækkelig til at illustrere den faktiske autophagy proces, som enten øget initiering af autophagy eller nedsat progression af autophagy til lysosomal nedbrydning systemet kan føre til forhøjelse af LC3-II niveauerne. For at præcisere, hvilken rolle FoxO3a i denne proces, vi bestemt virkningen af ​​FoxO3a lyddæmpning på faktisk autophagy flux ved hjælp af to metoder. En fremgangsmåde involverede behandling af cellerne med chloroquin i nærvær af FoxO3a knockdown, som blev foretaget i alle tre cancercellelinier, dvs. PC3, MDA-MB-231 og HCT116-celler. Undertrykkelse af FoxO3a resulterede i akkumulering af LC3-II i disse celler; og tilsætningen af ​​chloroquin yderligere øget LC3-II-niveauer, hvilket antyder, at FoxO3a suppression øget LC3-II gennem autophagy induktion (fig. 2A). Den anden fremgangsmåde involverede måling af progressionen af ​​autophagosomes i de sure autophagolysosomes ved konfokal billeddannelse. MDA-MB-231-celler, der stabilt udtrykker den tandem fluorescens protein mRFP-GFP-LC3 blev transficeret med FoxO3a siRNA eller kontrol siRNA; efterfølgende blev co-lokalisering af GFP med RFP, en indikator for autophagosome-lysosom fusion og proteinnedbrydning, undersøgt [39]. GFP-fluorescens er labil under sure betingelser; derfor tabet af grønne fluorescens, der er observeret som flytning af RFP fra GFP sporer stigende surhedsgrad i autophagosomes som de udvikle sig til autophagolysosomes. I dette system FoxO3a silencing ikke kun ført til øget LC3 positive foci, men også til væsentlig reduktion i GFP co-lokalisering med RFP, afspejler status for øget autofagi flux (fig. 2B, 2C, 2D). Endvidere siRNA-medieret reduktion af Atg5 niveauer hæmmede autofagi induceret af FoxO3a knockdown (fig. 2E), der beviser, at undertrykkelse af FoxO3a fremme autophagy induktion i en Atg5 afhængig måde. Disse data klart fastslå, at mens FoxO1 fremmer autophagy som forventet, FoxO3a regulerer negativt processen i disse cancerceller, spiller en modsat rolle.

For yderligere at teste hypotesen om, at FoxO3a er en negativ regulator af autophagy i kræftcellen linier, blev en målspecifik redning studie udført i PC3-celler ved ektopisk ekspression af FoxO3a (r), der koder for det samme protein sekvens som vildtype FoxO3a men indeholdt stille mutationer, der gør det modstandsdygtigt over for FoxO3a siRNA. Immunoblotanalyse påvist, at ektopisk ekspression af FoxO3a (r) undertrykt både basal autofagi og autofagi induceret af FoxO3a knockdown, i forhold til produktionen i de celler, der udtrykker vektor kontrol (fig. 3A). Værd at bemærke, ekspression af en form for FoxO3a, kaldet FoxO3a-3A (ikke phosphoryleres af AKT), som udelukkende lokaliseret til kernen [20], inhiberede autofagi så meget som vildtype FoxO3a der lokaliseret både i kernen og i cytosol (fig. 3B). Disse resultater antydede, at FoxO3a negativt regulerer autophagy gennem dets nukleare, sandsynligvis transkriptionel funktion

(A) PC3 celler blev transficeret med enten kontrol siRNA eller at målrette FoxO3a.; hver gruppe af celler blev også co-transficeret med enten ektopisk ekspression vektorkontrol eller denne udtrykkelige FoxO3a (r). Cellelysaterne blev høstet for immunblot 72 timer efter transfektion. (B) PC3-celler blev transficeret med 3 forskellige ekspressionsplasmider, som er vektor-Flag kontrol, Flag-FoxO3a eller Flag-FoxO3a-3A, henholdsvis; cellelysaterne blev forberedt 72 timer efter transfektion for immunoblotanalyse af de angivne proteiner.

FoxO3a regulering af autofagi medieres af FoxO1

Det blev bemærket, at knockdown af FoxO3a resulterede i en stigning på FoxO1 proteinniveau (fig. 4A), at hæve den mulighed, at FoxO1 medierer autophagy induktion virkning fra FoxO3a undertrykkelse. At undersøge forholdet mellem FoxO1 og FoxO3a i reguleringen af ​​autophagy, vi samtidigt undertrykt udtryk for disse to proteiner. Samtidig knockdown af FoxO1 ikke kun hæmmede basal autophagy som forventet, men også helt afskaffet højden af ​​autofagi induceret af FoxO3a knockdown (fig. 4A), hvilket tyder på, at FoxO1 er uundværlig i autophagy induktion som følge af FoxO3a undertrykkelse. Transfektion af to forskellige siRNA’er rettet mod FoxO3a begge resulterede i forhøjet FoxO1 proteinniveau (fig. 4B), som gør muligheden for off-target effekter af siRNA’er en usandsynlig scenario. Konsekvent på virkningen på protein niveauer, vurdering af transskription af real-time PCR viste en stigning på FoxO1 udtryk med FoxO3a knockdown (fig. 4C), hvilket tyder på, at FoxO3a transkriptionelt regulerer FoxO1 niveau. Endvidere behandling af celler med cycloheximid samtidig med FoxO3a knockdown elimineret stigningen i FoxO1 proteinniveau (fig. 4D), hvilket giver yderligere bevis for FoxO3a regulering af ekspressionen, ikke stabilitet FoxO1. Tilsammen understøtter disse data konklusionerne, at stigningen i FoxO1 følge af FoxO3a knockdown sandsynligvis resultatet af den øgede transkription og syntese af FoxO1.

(A) PC3 celler blev transficeret med siRNA for luciferase (siLuc) , FoxO1 (siFoxO1), eller FoxO3a (siFoxO3a) eller kombinationer, som indikeret. Celler blev høstet 72 timer efter transfektion, og cellelysater forarbejdet til immunoblotanalyse af de angivne proteiner. (B) FoxO3a knockdown med to FoxO3a målrettet siRNA at illustrere indvirkningen på FoxO1 proteinniveau. (C) Real-time PCR-analyse af FoxO1 og FoxO3a mRNA niveauer i kontrol siRNA (grå) eller FoxO3a siRNA (sort) transfekterede celler. Celler blev høstet og forarbejdet 48 timer efter transfektion; 18S ribosomalt RNA blev analyseret som normalisering kontrol. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. ( “**”,

s

0,01). (D) PC3-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller FoxO3a siRNA som angivet. Efter 48 h transfektion blev cellerne behandlet med enten DMSO kontrol eller 10 ug /ml cycloheximid i 24 timer som angivet, før de høstes for immunoblotanalyse af de angivne proteiner. Den FoxO1 /GAPDH-forholdet for hver betingelse er, som præsenteres efter band kvantificering af ImageJ. (E) Real-time PCR-analyse af endogen FoxO1 ekspressionsniveau i PC3-celler transficeret med enten kontrol plasmid (vektor) eller at udtrykke FoxO3a (r); i hver gruppe af plasmidet transficerede celler, enten kontrol siRNA eller FoxO3a siRNA blev samtidigt indført. Cellerne høstes til RNA-fremstilling og q-PCR-analyse 72 timer efter transfektion; FoxO1 transkriptniveauer blev analyseret som beskrevet i eksperimentelle procedurer. 18S blev anvendt som normalisering kontrol. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. ( “**”,

s

0,01). Alle forsøg er udført tre gange med lignende resultater.

For yderligere at undersøge den potentielle negative transkriptionel regulering af FoxO1 af FoxO3a, vi vurderet indvirkningen af ​​FoxO3a overekspression på endogene FoxO1 transskription. Når det indføres i PC3-celler, blev der observeret direkte virkning af FoxO3a (r) på FoxO1 ekspression, med eller uden samtidig knockdown af FoxO3a. Den inhiberende virkning af FoxO3a (r) på basal FoxO1 ekspression var beskeden, men signifikant. I modsætning hertil indføres FoxO3a (r) næsten fuldstændigt udslettet stigningen i FoxO1 transkription induceret af FoxO3a siRNA, bringer det tilbage til nær basisniveau (fig. 4E). Denne FoxO3a redning undersøgelse giver direkte bevis for FoxO3a hæmning af FoxO1 transskription i PC3 celler. Tilsammen disse resultater tyder på, at FoxO3a negativt regulerer cellulær autophagy ved at hæmme transskription af FoxO1, en positiv regulator af autofagi og cellemetabolisme.

Elevation i cytosolisk FoxO1, som følge af FoxO3a undertrykkelse, inducerer autofagi

det er veletableret, at FoxO1 positivt regulerer autophagy ved stigning transskriptionen af ​​visse autofagi gener [23], [24]. Imidlertid har nyere undersøgelser tilvejebragt overbevisende dokumentation for, at cytosolisk FoxO1 fremmer autophagy uafhængig af dets transskription regulatorisk aktivitet [33], [34]. Denne aktuelle undersøgelse hidtil har vist, at suppression af FoxO3a forøgede transkriptionen og total FoxO1protein plan, hvilket er årsagen til forhøjet autofagi. Det er imidlertid uklart, om denne FoxO1 afhængig autofagi skyldes primært dets nukleare eller cytosol funktion. Vi søger at definere dette spørgsmål ved anvendelse af et par forskellige tilgange. Fraktionering af PC3 cellelysat efter knockdown af FoxO3a afslørede en betydelig forhøjelse af cytosolisk FoxO1, mens mængden af ​​nukleart FoxO1 uændret (fig. 5A). Dette resultat antyder, at den forøgede FoxO1 følge af FoxO3a suppression meste ophobes i cytosolen. Vi spekulere, at denne overvejende cytosoliske forhøjelse af FoxO1 var den sandsynlige årsag til aktivering af autofagi efter FoxO3 knockdown, i overensstemmelse med nogle af de seneste rapporter [33], [34]. Overensstemmelse med fraktionering undersøgelsen, RT-PCR kvantificering af kendte FoxO target gener involveret i autofagi, såsom Atg4c, Atg7, LC3, Atg12, og Bnip3, viste ingen signifikant stigning i ekspression efter FoxO3a knockdown selvom FoxO1 var forhøjet som forventet (fig . 5B)

(A) PC3-celler blev transficeret med siRNA for luciferaseaktivitet (-) eller FoxO3a (siFoxO3a) som angivet, og høstet til immunoblotanalyse af de angivne proteiner 72 timer efter transfektion.; se Eksperimentelle Procedurer for detaljer. Histone H3 og GAPDH blev brugt som lastning kontrolsystem for nukleare og cytosol proteiner, hhv. De band mængde nøgletal, FoxO1 /GAPDH og FoxO1 /histon H3, for hver betingelse blev opnået ved hjælp af ImageJ. (B) Real-time PCR-analyse for de relative ekspressionsniveauer for de anførte Autophagy gener 48 timer efter transfektion af PC3-celler med kontrol siRNA (sort) eller to forskellige siRNA’er rettet mod FoxO3a (lys og mørk grå, henholdsvis). Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. (C, D) Over-ekspressionen af ​​en transskription funktion inaktiv /cytosoliske form for FoxO1, FoxO1-ΔDB, øger autofagi. Mængderne af LC3 positiv vesikel af både PC3 (panel C) og H1299 (panel D) celler blev sammenlignet i den samme analyse mellem Flag-FoxO1-ΔDB over-udtrykkende celler og un-transficerede celler. FITC og rhodamin mærkede sekundære antistoffer blev anvendt til påvisning af anti-LC3 eller anti-Flag-tag, hhv. Den autophagy niveauet i hver celle population blev kvantificeret ved hjælp MetaMorph software; dataene blev plottet på den højre side af hvert panel. 50 celler blev analyseret for hver betingelse. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± S.E.M. ( “**”,

s

0,01).

For at direkte vurdere virkningen af ​​cytosolisk FoxO1 på autophagy i PC3 kræftceller, vi introducerede i celler en ekspressionsvektor indeholdende flag-tagget FoxO1 modificeret til at have en defekt DNA-bindende mutation, FoxO1-ΔDB [33]. Den FoxO1-ΔDB således udtrykkes, er ikke-funktionelt som en transskriptionsfaktor og interessant nok næsten udelukkende lokaliseret til cytosolen. I begge PC3-celler (fig. 5C) og H1299-celler (fig. 5D), Flag-FoxO1-ΔDB protein blev udelukkende lokaliseret til cytosolen som forventet [33] og Flag-FoxO1-ΔDB udtrykkende celler (rød) havde markant højere niveau af autophagosomes end de un-transfekterede celler. Billede analyse har vist statistisk signifikant stigning af autophagosome i celler, der udtrykker cytosolisk lokaliseret FoxO1. Disse data giver direkte beviser til støtte forestillingen om, at den cytosoliske ophobning af FoxO1 i disse cancerceller faktisk fremmer autofagi, uafhængigt af dets nukleare funktion.

Cytosoliske FoxO1-medieret induktion af autofagi er uafhængig af undertrykkelse af mTORC1 aktivitet

mTORC1 er en velkendt sensor til ernæring og vækstfaktor signalering; det hæmmer autophagy som reaktion på væksten signalering. Derfor undersøgte vi aktiviteten af ​​mTORC1 signalering når FoxO1 eller FoxO3a udtryk undertrykkes med siRNA. FoxO3a knockdown ført til en betydelig stigning af autophagy set ovenfor; ingen signifikante ændringer i mønstret for phospho-4EBP1 og phospho-S6 blev observeret i celler med FoxO3a knockdown mens autofagi markant blev induceret (fig. 6A, DMSO), hvilket antyder, at forøgelse af autofagi induceret af FoxO3a knockdown var sandsynligvis ikke gennem hæmning af mTORC1 . Værd at bemærke, FoxO1 knockdown-medieret nedregulering af autofagi blev ledsaget af en hæmning af mTORC1 signalering, baseret på både phospho-4EBP1 og phospho-S6 mønstre (fig. 6B, DMSO), som også støttede tanken om, at FoxO regulering af autofagi var ikke medieres via klassiske mTORC1 signalering i dette tilfælde. Salg

(A) PC3-celler blev transficeret med siRNA’er målretning FoxO3a som angivet. Efter 48 h transfektion blev cellerne udsat for rapamycin behandling i 24 timer før behandling til immunoblotanalyse af de angivne proteiner. (B) PC3-celler undergik lignende undersøgelse som beskrevet i (a), bortset siRNA targeting FoxO1 blev anvendt som angivet. Alle forsøg er udført tre gange med lignende resultater.

For yderligere at evaluere samspillet mellem mTOR signalering og FoxO-reguleret autophagy, vi kombineret enten FoxO3a eller FoxO1 knockdown med rapamycin behandling i PC3 celler. Rapamycin behandling alene blokeres effektivt mTORC1 funktion, men induceret autophagy i langt mindre omfang end induceret af FoxO3a knockdown.