PLoS ONE: Snail Bidrager til vedligeholdelse af stamcelle-lignende fænotype Celler i Human kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

Snail, en potent repressor af E-cadherin udtryk, spiller en central rolle i epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) i epitelial kræft. For nylig, EMT og stemness programmer fundet bundet sammen. I den aktuelle undersøgelse blev udtryk for Sneglen og dens bidrag til kræft stamceller (CSC) markør udtryk, invasiv, selvfornyelse, clonogenicity, og tumorgenicitet af bugspytkirtelkræftceller undersøgt. Vores resultater viste, at sneglen blev højt udtrykt i CSC

høj cellelinie Panc-1. Stabil, korte hårnål RNA (shRNA) -medieret snail knockdown faldt invasion i Panc-1-celler, i overensstemmelse med øget E-cadherin-ekspression og dens translokation fra kernen til membranen. Snegl inaktivering i Panc-1 inhiberede også CSC markør ALDH ekspression, sammen med nedsat kugle og kolonidannende kapacitet, hvilket er meget konsistent med ekspressionen af ​​stamcelle forbundet transkriptionsfaktorer som Sox2 og Oct4. I muse xenograftmodeller, knockdown af sneglen førte til et reduceret antal tumorbærende mus og en reduceret gennemsnitlig størrelse af tumorer, som havde en stærkere membran farvning af E-cadherin og lettere farvning af Oct4. Kollektivt, disse resultater implicerer sneglen er påkrævet til opretholdelse af stamcelle-lignende fænotype i bugspytkirtelkræft, og inhibering af Snail kunne være en effektiv strategi til behandling af pancreascancer ved at målrette CSCS

Henvisning:. Zhou W, Lv R, Qi W, Wu D, Xu Y, Liu W, et al. (2014) Snail Bidrager til vedligeholdelse af stamcelle-lignende fænotype Celler i Human kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 9 (1): e87409. doi: 10,1371 /journal.pone.0087409

Redaktør: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, USA

Modtaget: Juli 9, 2013; Accepteret: December 24, 2013; Udgivet: 29 januar, 2014

Copyright: © 2014 Zhou, et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China [81001095]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bugspytkirtelkræft duktalt adenocarcinom er en meget aggressiv epitelial kræft med en rapporteret 5-års overlevelse på ca. 5% [1]. Kun 20% af bugspytkirtlen kræftpatienter er berettiget til kirurgisk resektion, og metastatisk sygdom ofte udvikler selv efter operationen, mens nuværende kemo- og radio-behandlinger er stort set ineffektive [2]. Derfor Forståelse af de molekylære begivenheder, der ligger til grund for udviklingen og progressionen af ​​kræft i bugspytkirtlen er et presserende behov, som måske nøglen til udviklingen af ​​mere effektive og nye terapeutiske strategier.

Et stigende mængde af videnskabelige beviser tyder på, at tumorer indeholder en lille subpopulation af celler, dvs. cancer stamceller-lignende celler (CSCS) eller cancer-initierende celler (CICS), som udviser en selvfornyende kapacitet, modstandsdygtig over for konventionel kemoterapi og er ansvarlige for behandlingssvigt, cancer tilbagefald og metastase [3 ]. Selvom CSCS hypotese antyder, at tumorer kan opstå fra stam- eller progenitorceller, undersøgelser fra nogle laboratorier indikerer, at epitelial-mesenkymale overgang (EMT), en udviklingsproces, hvor cellerne mister epiteliale karakteristika og erhverve mesenchymale egenskaber, såsom øget motilitet og invasion, kan udstyre celler med stamcelle lignende egenskaber [4] – [6].

EMT induceres ved undertrykkelse af E-cadherinekspression af EMT regulatorer som Snail, Slug, og Twist. Sneglen familie af zink-finger transkriptionelle repressorer direkte undertrykker E-cadherin in vitro og in vivo via en interaktion mellem deres COOH-terminale region og 5′-CACCTG-3′-sekvensen i E-cadherin promotoren [7]. I humane colorektale cancerceller, blev overekspression af sneglen rapporteret at inducere ikke blot EMT men også en CSC-lignende fænotype, hvilket forstærkede cellemigration og invasion in vitro og en stigning i metastase-dannelse in vivo [8]. Undersøgelser har også vist, at sneglen spiller en væsentlig rolle i progressionen og metastatiske proces af human pancreascancer [9], [10]. I kliniske omgivelser, har snail overekspression tidligere været forbundet med dårligere prognose og en mere invasiv fænotype i mange maligniteter [11] – [13]. Der er dog nogle få rapporter om sammenhængen mellem sneglen udtryk og gevinsten af ​​kræft i bugspytkirtlen stamceller egenskaber. Vi evaluerede derfor sneglen funktion på stamceller markør udtryk, selvfornyelse kapacitet i bugspytkirtelkræft cellelinje in vitro og xenotransplantattumorer dannelse in vivo. Vores arbejde viser, at genregulering medieret af Snail kan støtte human pancreas vækst kræft ved at opretholde bugspytkirtelkræft knoglemarven.

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige bugspytkirtlen cancercellelinier Panc-1 og BxPC-3 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Celler blev dyrket og opretholdt i DMEM-medium tilsat 10% føtalt bovint serum (Gibco /Invitrogen, CA), penicillin-streptomycin (Flow Laboratories, Rockville, MD). Begge cellelinier blev opretholdt i en fugtig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO2. Gross cellemorfologi for tilstedeværelse eller fravær af morfologiske karakteristika i overensstemmelse med EMT blev vurderet ved to observatører blindet for de behandlingsbetingelser. Billeder af cellelinjer blev taget med et Nikon Eclipse TS100 omvendt mikroskop og Pro-Microscan kamera (Oplenic).

Evaluering af aldehyd dehydrogenase aktivitet

Aldefluor substrat (2,5 pi, Aldagen, Inc., Durham, NC) blev sat til 1 x 10

6 tumorceller i 500 pi assaypuffer og inkuberet i 60 minutter ved 37 ° C. Celler blev analyseret på et FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Behandling af celler med 5 pi af ALDH inhibitoren diethylamino-benzaldehyd (DEAB) tjente som negativ kontrol. Lentivirusvektorer uden fluorescens blev anvendt til celletransfektion under FACS-analyse.

Sphere formation assay

Sphere formation assay blev udført som beskrevet andetsteds [14]. Kort fortalt blev celler udpladet i seks-brønds ultralav montagepladerne (Corning Inc., Corning, NY) ved en densitet på 1.000 celler /ml i DMEM suppleret med 1% N2-supplement (Gibco, Grand jord, NY), 2% B27 supplement (Gibco, Grand Island, NY), 20 ng /ml human blodplade vækstfaktor (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (PeproTech, Rocky Hill, NJ) og 1% antibiotisk-antimycotisk (Invitrogen) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO2. Sphere-kulturer blev passeret efter 7~10 dage. Til passage sfærer blev mediet fjernet og sfærer blev opsamlet og inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter i 0,05% trypsin (Solarbio, Beijing, Kina) og observeret under mikroskop for at kontrollere dissociation. De opnåede fra dissociation celler blev sigtet gennem en 40-um filter og talt ved counter hjælp trypanblåt før genudplade.

blød agar-assay

For at vurdere klonogene potentiale, det kolonidannelse assayet blev udført som følger. Hver brønd i en seks-brønds dyrkningsplade blev coatet med 2 ml bottom agar blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,6% (w /v) agar). Efter det nederste lag størknet, 2 ml topagar medium blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,3% (w /v) agar) indeholdende 1 x 10

4-celler blev tilsat, og skålene blev inkuberet ved 37 ° C i 3 uger. Plader blev farvet med 0,5 ml 0,005% krystalviolet i 1 time og derefter et dissektionsmikroskop blev anvendt til at tælle antallet af kolonier . 50 celler [15]

Transwell invasion assay

for invasion assay blev den 24-brønds plade Transwell system med et 8-um porestørrelse polycarbonat membranfilter (Corning Costar, Corning, NY), der anvendes. 1 × 10

5-celler i 100 pi serumfrit medium blev tilsat til topkammeret coatet med Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA). Det nedre kammer indeholdt 10% FBS indeholdende medium. Cellerne blev inkuberet i 48 timer og celler, der havde invaderet gennem Matrigelcoatede membran blev fikseret og farvet med krystalviolet, derefter talt under et lysmikroskop i fire tilfældige felter i en blindet måde.

realtid RT-PCR-analyse for genekspression

for real-time RT-PCR-analyse, blev det totale RNA af celler ekstraheret ved anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af ækvivalente mængder af total RNA (1 ug) med tilfældige primere i en 20 pi revers transkriptase reaktionsblandingen (Promega, Madison, WI). Real-time PCR primere blev designet og indkøbt fra Ruisai Inc (Shanghai, Kina) som følger:

Snail, fremad (5′-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3 ‘)

og omvendt (5′ ATCTCCGGAGGTGGGATG-3 ‘);

Slug, fremad (5′-AGCGAACTGGACACACATAC-3′)

og omvendt (5′-TCTAGACTGGGCATCGCAG-3 ‘);

Twist 1 , fremad (5′-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 ‘)

og omvendt (5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3′);

ZEB1, fremad (5′-CGAGTCAGATGCAGAAAATGAGCAA-3 ‘)

og omvendt (5′-ACCCAGACTGCGTCACATGTCTT-3 ‘);

ZEB2, fremad (5′-GAGTTGATGCCTCGGCTATTGC-3′)

og omvendt (5’CTGGACATTGAGCTGCTTCGATC-3 ‘) ;.

GAPDH, fremad (5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3 ‘)

og omvendt (5’GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′)

forstærkningen blev udført i en totalvolumen på 20 ul indeholdende 1 ul af hver primer, 10 ul LightCycler FastStart DNA Master SYBR green i (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) og 1 ul af 1:10 fortyndet cDNA. PCR-reaktioner blev fremstillet in duplo og opvarmet til 95 ° C i 2 min efterfulgt af 40 cyklusser af denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing ved 55 ° C i 20 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 20 sek. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og blev beregnet på grundlag af

ΔΔCt metode. Den n-gange ændring i mRNA-ekspression bestemt i henhold til metoden af ​​2-

ΔΔCT.

Lentiviral-medieret RNAi af Snail

pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR vektor blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA). Dobbelt-strenget shRNAs rettet mod human Snail blev designet af BLOCK-i T ™ RNAi Designer. Målsekvensen 1 var 5′-GCCTAACTACAGCGAGCTG-3 ‘; målsekvens 2 var 5’-GGATCTCCAGGCTCGAAAG-3 ‘. Begge målrettede sekvenser blev verificeret som specifikke for Snail af Blast søge mod det humane genom. Universel ikke-targeting kontrol shRNA (sekvenser: 5’-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 ‘; 5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3’) blev anvendt som negativ kontrol. shRNAs blev syntetiseret og klonet i pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR, derefter overført til den lentivirale ekspressionsplasmid pLenti6 /V5-DEST med Gateway rekombinationsteknologi. Lentiviral produktion blev udført ved transfektion af 293-T celler med shRNA eller negativ kontrol-plasmid og emballering Mix (Invitrogen) i nærvær af POLOdeliverer ™ 3000 transfektionsreagens (Ruisai Inc, Shanghai, Kina). Supernatanter blev opsamlet 48 timer efter transfektion og blev derefter filtreret; de virale titere blev derefter bestemt ved real-time PCR. Subsammenflydende celler blev inficeret med lentivirus ved en infektionsmultiplicitet på 50 i nærvær af 8 ug /ml polybren (Sigma-Aldrich). Panc-1-celler med stabil silencing af Snail genet blev selekteret med 2 ug /ml Blasticidin i 4 uger. Derefter celler blev dyrket med 1 ug /ml Blasticidin. En anden negativ kontrol shRNA plasmid (sc-108.060) fra Santa Cruz Biotechnology, som koder en kodet shRNA sekvens, blev anvendt til kortvarig transfektion i overensstemmelse med protokollen.

Western blot-analyse

For hele celle proteinekstraktion blev celler lyseret med iskold RIPA puffer indeholdende 1 mM PMSF og centrifugeret ved 14.000 g i 5 min. Supernatant indeholdende det isolerede protein blev kvantificeret ved en kommercielt tilgængelig modificeret Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Western blot proteinprøver blev fremstillet ved kogning isolerede proteiner med denaturerende prøvepuffer. Lige store mængder protein blev opløst ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev derefter blokeret med 5% fedtfri tørmælk i TBS og 0,1% Tween 20 i 1 time og probet med det egnede primære antistof natten over ved 4 ° C. Membranerne blev derefter vasket og inkuberet med det passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev derefter vasket og proteinbånd blev visualiseret ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt forøget kemiluminescens (ECL) kit (Thermo Scientific). For at kontrollere rigtigheden af ​​lastning af protein isoleret fra hel-cellelysat blev blots strippet, vasket og testet igen med GAPDH antistof (Bioworld) som en belastning kontrol. Billeder blev visualiseret ved anvendelse af ECL Detection System (Amersham, Arlington Heights, IL). Antistoffer anvendt til Western blot-analyser var som følger: kanin mAb anti-snail, kanin mAb-anti-E-Cadherin, kanin mAb anti-vimentin, kanin mAb anti-Bmi1, kanin mAb anti-Nanog, kanin mAb anti-Oct4, kanin mAb anti-Sox2 (Cell Signaling Technology, Inc.). Densitometri af Western blots blev analyseret ved hjælp af Image J software.

immunfluorescensmikroskopi

Celler blev dyrket på dækglas, fikseret i 4% formaldehyd i PBS i 10 minutter, permeabiliseret med 0,2% Triton X -100 i 10 min, og blokeret i 10% gedeserum i PBS-0,2% Tween i 1 time. Dækglas blev inkuberet med E-cadherin antistof (BD Biosciences, 1:200 fortynding) i blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask af cellerne med PBS-0,2% Tween, inkuberede vi cellerne i 1 time med gede-anti-kanin IgG Alexa 594 (1:1000 fortynding; Invitrogen). Kerner blev modfarvet med DAPI. Objektglassene blev vasket grundigt med PBS og monteret med Fluoromount-G. Prøverne blev fotograferet ved hjælp immunofluorescens mikroskop.

In vivo analyse af tumorvækst

Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Zhejiang University School of Medicine (ZYXK2010-0149). Enkelte celler suspensioner (2 × 10

5 i et samlet volumen på 100 pi 1/1 (v /v) PBS /Matrigel) injiceret subkutant i højre og venstre midabdominal område af mandlige nøgne mus (BALB /c-stamme ) i alderen 8 uger. Tumorstørrelsen overvåget dagligt med passere og tumorvolumenet blev beregnet ifølge formlen (længde x bredde

2) /2. Dyr undergik obduktion på 28 dage efter celleimplantation og tumorvækst blev vurderet.

Immunhistokemi analyse af xenograftvæv

De subkutane tumorer dannet i mus blev fikseret i 10% phosphatpufret formalin og indlejres i paraffin. 4 um tykke snit blev afparaffiniseret under anvendelse xylen og hydreret ved en gradvist stigende ethanol vaske. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset med 10-minutters inkubation i 3% H

2O

2. Efter inkubering med blokerende opløsning i 30 minutter, blev snit inkuberet med primært antistof fra BD Biosciences (anti-sneglen, 1:200 fortynding, anti-E-cadherin, 1:200 fortynding og anti-Oct4, 1:300 fortynding) til 1 time, et biotinyleret sekundært antistof i 20 minutter og derefter med streptavidin-peberrodsperoxidase (HRP) i 10 minutter. Antistoffet blev visualiseret med diaminobenzidin (DAB) chromogen, og §§ blev modfarvet med H 0,05

Resultater

Snail udtryk og stamceller markør ALDH i pancreas cellelinjer

Under lup, var BxPC-3 celler morfologisk epitelial i naturen. I modsætning hertil Panc-1-celler var blandede populationer af epitel- og tenformede mesenchymal type celler (Figur 1 A). Ved hjælp af flowcytometri, dårligt differentieret cellelinie Panc-1 blev karakteriseret som CSC

høj celle med mere ALDH

stor befolkning, mens veldifferentieret cellelinje BxPC-3 som CSC

lav celle med mindre ALDH

stor befolkning (figur 1 B). Sphere dannelse assay viste også, at Panc-1 dannes flere og større kugler end BxPC-3 har (Figur 1 A). For at få indblik i den afgørende rolle EMT regulatorer undersøgte vi den basale udtryk for Snail, Slug, Twist1, ZEB1 og ZEB2 i Panc-1 og BxPC-3. Især real-time RT-PCR-analyser viste, at Panc-1-celler havde en signifikant højere ekspression af Sneglen og ZEB1 mRNA (ca. 6 gange og 4 gange henholdsvis P 0,01) i sammenligning med BxPC-3-celler (figur 1 C). Der var en sammenhæng mellem dårlig differentiering, Sneglen og ZEB1 ekspressionsniveauerne og kugle-dannende kapacitet i disse to bugspytkirtelkræft cellelinjer. Vi valgte Panc-1-cellelinien til senere snail dæmpende eksperimenter på grund af sin relativt høje ekspressionsniveau af Sneglen og fremragende lentiviral transfektionseffektivitet.

A. Morfologi Panc-1 og BxPC-3 celler og deres kugler. Bemærk, at Panc-1 celler har flere spindel-formet mesenkymale befolkninger og kan danne mere og større sfærer. ** P 0,01 sammenlignet med BxPC-3. B. ALDH aktivitet i Panc-1 og BxPC-3-celler. Dot plots af celler analyseret ved flowcytometri for ALDH aktivitet. Celler blev behandlet med Aldefluor substrat i nærvær eller fravær af ALDH inhibitor DEAB. Efter behandling blev prøverne analyseret ved flowcytometri for tilstedeværelsen af ​​ALDH

høje celler. Værdierne præsenteres er gennemsnittene af tre uafhængige forsøg. C. Real-time RT-PCR quantifing Snail, Slug, Twist1, ZEB1, og ZEB2 mRNA-ekspression i Panc-1 og BxPC-3 celler. Søjlediagrammer viser forholdet mellem ekspressionsniveauet i Panc-1-celler til at i BxPC-3-celler. ** P. 0,01

Snail inducerer EMT-lignende forandringer i bugspytkirtelkræft celle

For at undersøge, hvilken rolle Snail i EMT induktion og CSC generation, vi producerede et stabilt Snail knockdown Panc-1 cellelinje (Panc-1 /shSnail) ved lentiviral transfektion.

To uafhængige stabile shSnail-udtrykkende kloner (S1, S2) og en stabil negativ kontrol shRNA klon (NC) blev analyseret for sneglen mRNA-ekspression . S1 og S2 viste op til 80% nedregulering af Snail mRNA-niveauer, hvorimod kontrol-klonen ikke udviste nogen signifikant reduktion i sneglen mRNA (figur 2A). Vi valgte S1 klon som Panc-1 /shSnail for følgende eksperiment på grund af dens højere grad af Snail lyddæmpning. Knockdown af Snail i Panc-1-celler blev bekræftet ved Western blot-analyse (Figur 2B og C). Kanin mAb-anti-Snail blev valideret i forhold cellelysater fra Panc-1, MIA-PaCa2, BxPC-3, og Capan-1 cellelinier. Farvningsmønstret var ligner tidligere offentliggjorte data (figur S1) [9], [16]. For at udelukke heterogenitet skyldes stabil transfektion og selektion protokol, brugte vi en anden negativ kontrol shRNA plasmid (sc-108.060) for transient transfektion. Real-time RT-PCR og Western blot viste ingen signifikant forskel i Snail ekspression mellem stabilt og transient transficerede kontrol- kloner (figur S2).

A. Snegl mRNA-ekspression af stabile shSnail-udtrykkende (S1, S2) og negativ kontrol shRNA-udtrykkende (NC) Panc-1-kloner. Værdier er gennemsnit og standardafvigelser af tredobbelte målinger. ** P 0,01 sammenlignet med NC. B. Western blot, der viser epitel-mesenchymale markører Sneglen, Slug, Twist1, ZEB1, ZEB2, E-cadherin og vimentin i Panc-1-celler transficeret med lentivirus-medieret negativ kontrol shRNA (Panc-1 /NC) eller shSnail (Panc-1 /shSnail). GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. C. Kvantificering af protein niveauer af Snail, Slug, Twist1, ZEB1, ZEB2, E-cadherin og vimentin i Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail celler. * P 0,05, ** P. 0,01

Efter lentivirus infektion, blindet efterforskere observerede forskelle i brutto- udseende celler. Stabil infektion af Panc-1-celler ved shSnail signifikant øget intercellulær adhæsion og brolagte-lignende form, i sammenligning med kontrolceller (figur 3A). Dernæst evalueres vi ekspressionen og lokaliseringen af ​​E-cadherin hjælp immunfluorescensfarvning. Sammenlignet med Panc-1 /NC-celler, havde Panc-1 /shSnail celler forøgede niveauer af ekspression af E-cadherin og flytning af E-cadherin fra nukleare kammer til celleplasmamembranen (figur 3B). Disse ændringer var typiske for celler med en epitelial fænotype, hvilket indikerer, at cellerne undergår mesenchymale-til-epitel overgang (MET) efter Snail nedregulering. For yderligere at bekræfte observationen, vurderede vi ekspressionen af ​​epitelial adhæsionsmolekyle E-cadherin, mesenchymal cellemarkør vimentin og andre EMT transkriptionsfaktorer Slug, Twist1, ZEB1 og ZEB2 ved Western blotting på cellelysater. Som forventet efter silencing af Snail i Panc-1, blev ekspression af E-cadherin observeret at stige. Omvendt blev et fald i ekspressionen af ​​vimentin og ZEB1 observeret efter Snail knockdown. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i protein niveauer af Slug, Twist1 og ZEB2 (figur 2 B, C). Disse resultater viser en klar sammenhæng mellem Sneglen og E-cadherin, og også foreslå en direkte eller indirekte interaktion mellem sneglen og ZEB1, som begge have potentiale til at undertrykke E-cadherin transkription.

A. Morfologiske ændringer af Panc-1-celler efter Snail lyddæmpning vise nogen ændring i den cellulære vækst mønster fra en mesenchymal mod en epitelial fænotype. B. Immunfluorescensfarvning til ekspression og cellulære lokalisering af E-cadherin i stabile kloner af Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail. Nuclear-DNA blev påvist ved DAPI-farvning. Stabil snail knockdown fører til en forøget ekspression af E-cadherin og dets translokation fra kernen til membranen. C. Snail nedregulering hæmmer Panc-1 invasiv i in vitro Matrigel invasion analyser. ** P 0,01 sammenlignet med Panc-1 /NC. Data, der vises her, er middelværdien ± SD af tre eksperimenter.

Snail øger celle invasion evne i bugspytkirtelkræft celle

Da de processer af EMT har været forbundet med celle invasion, vi næste spurgte, om Snail udtryk har en vis effekt på celle invasion kapacitet i bugspytkirtelkræftceller. Brug af Matrigel in vitro invasion assay, fandt vi Panc-1-celler med snail lyddæmpning havde reduceret kapacitet for invasion sammenlignet med kontrolceller (figur 3 C). Disse data bekræfter, at Snail udtryk øger invasive kapacitet bugspytkirtelkræftceller, og inaktivering af Snail fører til MET med mindre invasive egenskaber.

Snail forbedrer stamcelle lignende egenskaber i bugspytkirtelkræftceller

Som Snail er stærkt udtrykt i CSC

højt i forhold til CSC

lave celler, undersøgte vi derfor, om Snail kan påvirke ekspressionen af ​​stamcelle markør ALDH. Snegl tavshed Panc-1-celler viste et signifikant fald i ALDH

stor befolkning (1,60%) i sammenligning med deres kontrol modstykker (6,01%) (figur 4 A). Dernæst brugte vi in ​​vitro sfære dannelse assay for at undersøge, om Snail deltager i CSC fornyelse på seriel passage. Vi viste, at Snail ikke kun knockdown påvirket den indledende dannelse af kugler, men også ført til en løbende reduktion af sfære numre i de efterfølgende generationer. Kolonidannelse test viste også, at nedregulering af Snail signifikant blokeret kolonivækst af Panc-1-celler (figur 4 B). Disse eksperimenter implicerer, at Snail har en vigtig rolle i reguleringen af ​​pancreas CSC indhold og er nødvendig for selvfornyende kapacitet.

A. Snail nedregulering formindsker ALDH

stor befolkning i Panc-1 celler. Dot plots af celler analyseret ved flowcytometri for ALDH aktivitet. Værdierne præsenteres er gennemsnittene af tre uafhængige forsøg. B. snail silencing signifikant hæmmer evnen af ​​kugle-dannelse med seriepassage og evne til clonogenicity i Panc-1-celler. Repræsentative billeder af koloni vises over kolonnen diagram. Lignende forsøg blev gentaget tre gange. ** P 0,01, sammenlignet med Panc-1 /NC. C. Western blot-analyse af celleekstrakter fra Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail celler til Bmi1, Nanog, Sox2, og Oct4 ekspression. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. D. Kvantificering af protein niveauer af Bmi1, Nanog, Sox2, og Oct4 i Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail celler. * P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med Panc-1 /NC

Snail øger ekspressionen af ​​stamcelle associeret transkriptionsfaktorer

Som Snail udtryk har en vis forbindelse med. CSC indhold, brugte vi Western blotting for at bestemme, om Snail ekspression har roller i skiftende ekspression af Bmi1, Nanog, Sox2, og Oct4, som er nødvendige for at opretholde pluripotens i stamceller. Som vist i figur 4 C og D, lentiviral medieret transfektion af Snail shRNA inducerede en dramatisk reduktion i ekspressionen af ​​Sox2 og Oct4 (P 0,05 og P 0,01, henholdsvis) i Panc-1-celler, der var i overensstemmelse med tabet af CSC fænotype, hvilket tyder på, at ekspressionen af ​​disse faktorer kan være vigtigt at Snail-induceret CSC dannelse i bugspytkirtelkræftceller.

Snail forbedrer bugspytkirtelkræft celle tumorigenicitet in vivo

Da vores in vitro-undersøgelser antydet at Snail spiller en regulerende rolle i bugspytkirtelkræft celle invasion og CSC dannelse, vi implanteret subkutant lige mange Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail i nøgne mus og målte resulterende tumorvækst. Når det injiceres 2 × 10

5-celler, Panc-1 /NC havde 100% (8/8) tumordannelse mens kun 2/8 mus injiceret med Panc-1 /shSnail viste pankreastumor indpodning. Endvidere blev en tendens til forsinket tumordannelse og et fald i tumorstørrelser observeret i tumorer afledt af Snail silencing celler sammenlignet med dem fra kontrolceller (figur 5A). Immunhistokemi af tumorer viste en lighter farvning af Sneglen og Oct4, mens en stærkere membran farvning af E-cadherin i Panc-1 /shSnail tumorer, i forhold til dem af Panc-1 /NC tumorer (figur 5B). Disse data er i overensstemmelse med vores in vitro observationer og støtte den rolle, Snail i opretholdelsen af ​​pancreas CSC rum.

A. Grafisk fremstilling af vækstrater på subkutane xenotransplantattumorer hjælp celler af Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail. 2 × 10

5 i hver celle blev transplanteret i otte mus pr gruppe. Alle mus i Panc-1 /NC-gruppen, mens kun 2 mus i Panc-1 /shSnail gruppe havde tumordannelse. B. Ekspression af Snail, E-cadherin, og Oct4 i xenotransplantattumorer. Repræsentative eksempler på sneglen, E-cadherin, og Oct4 ekspression bestemt ved immunohistokemi. Stærkt positiv Snail ekspression er til stede i kernen og cytoplasmaet af Panc-1 /NC tumorer (a), men ikke i Panc-1 /shSnail tumorer (b). Ekspression af E-cadherin er svag og heterogen i Panc-1 /NC tumorer (c), men mere intensiv i membranen af ​​Panc-1 /shSnail tumorer (d). Lavere niveau af Oct4 ekspression er til stede i Panc-1 /shSnail tumorer (f), sammenlignet med den for Panc-1 /NC tumorer (e). Scale barer: 10 um

Diskussion

Vores undersøgelse viser, at Snail som er relateret til EMT af humane bugspytkirtelkræftceller også kan regulere ekspressionen af ​​stamcelle markører og pluripotens opretholde transkriptionsfaktorer. , modulerende selvfornyelse kapacitet og clonogenicity. Sammen med tumorimplantation undersøgelse, vores resultater viser, at aktiveringen af ​​sneglen er påkrævet til opretholdelse af cancer stamcellelignende egenskaber, som direkte påvirker tumorinitiering, vækst in vivo. Vi har overbevisende demonstreret, at hæmning af Snail kunne betragtes som en ny strategi for at forbedre de biologiske virkninger af anticancer og kemoforebyggende midler.

Forskere normalt identificerede CSCS fra kræft i bugspytkirtlen baseret på ekspressionen af ​​de celleoverfladeantigener som CD44 , CD24, epithelial-specifikt antigen (ESA), og CD133 [17] – [20]. Der er forskellige konklusioner i separate undersøgelser, hvilke mærketråden bedste beriger for pancreas CSCS. Imidlertid har nyere undersøgelser fundet, at cellepopulationer beriget med høj ALDH aktivitet alene er tilstrækkelige til effektiv tumor-initiering med forbedret tumorigent potentiale [21]. I vores eksperiment, knockdown af nøglen EMT inducer Snail faldt betydeligt i ALDH

høj cellepopulation. Disse data indikerer, at EMT forlener tumorceller med stamcellelignende egenskaber. Vores resultater er i overensstemmelse med den forskning fra Chen et al, som fandt ALDH

høje celler i hoved og hals skællede kræft har EMT skiftende og endogent co-udtrykte Snail. Endvidere knockdown af Snail ekspression faldt betydeligt ekspressionen af ​​ALDH, inhiberede cancer stamceller-lignende egenskaber [22]. Disse observationer blev yderligere bekræftet ved kugle-dannelse in vitro og tumorimplantation in vivo, hvor sneglen knockdown ført til mindre og mindre indpodning. Disse resultater er i overensstemmelse med de af Mani og kolleger [4], som har vist, at tvang ekspressionen af ​​EMT-associerede molekyler såsom Snail og Twist resultater i celler med en kræft stamcelle fænotype. EMT tilbyder en alternativ måde at generere cancer stamceller egenskaber fra differentierede epiteliale tumorceller. Denne hypotese af dedifferentiering understøttes af den nyligt beskrevne generation af pluripotente stamceller fra tilsyneladende terminalt differentierede somatiske celler [23].

Det er generelt betragtes som Sox2 og Oct4 er centrale transskription regulatorer af embryonale stamceller (ESC) selvfornyelse og pluripotens [24] – [26]. Akkumulerende beviser tyder på, at disse transkriptionsfaktorer af økonomiske og sociale råd er udtrykt af CSC-lignende celler i forskellige typer af kræft. Knockdown af disse gener kan føre til formindsket CSC fænotype, reducere klonogene og tumorgene kapaciteter af cancerceller. [27] – [29]. De er også tilstrækkeligt til at omprogrammere humane somatiske celler til pluripotente stamceller, der udviser de væsentlige karakteristika af økonomiske og sociale råd [23]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at ekspressionsniveauerne af Sox2 og Oct4 blev reduceret i Snail-silencing Panc-1-celler sammenlignet med kontrolceller. Dette antyder, at Snail fungerer som en hovedafbryderen under regulere pluripotente potentialer fra stamceller. Lignende resultater er fundet i andre undersøgelser, i hvilke høj ekspression af Oct4 og Nanog fremmer EMT, og er forbundet med lægemiddelresistens, tumormetastase og dårlig prognose i forskellige humane malignances. [30], [31].