PLoS ONE: Lav Mutation Burden i kræft i æggestokkene kan begrænse Utility af neoantigen-Målrettet Vaccines

Abstrakt

På grund af fremskridt inden for sekventering teknologi, somatisk muterede kræft antigener, eller neoantigener, er nu klart afgrænsede og er blevet tvingende mål for immunterapi. Især har neoantigen målrettet vacciner vist lovende i flere prækliniske og kliniske studier. Men til dato har neoantigen målrettet vaccine undersøgelser omfattede tumorer med usædvanligt høje mutation byrder. Det er fortsat uklart, om neoantigen målrettet vacciner vil være bredt anvendelig for kræft med mellemliggende lave mutation byrder, såsom kræft i æggestokkene. For at løse dette, vi vurderet, om et derivat af murine æggestokkene tumor model ID8 kunne målrettes med neoantigen vacciner. Vi udførte hele exome og transkriptom sekventering på ID8-G7 celler. Vi identificerede 92 somatiske mutationer, hvoraf 39 blev transskriberet, missense mutationer. For 17 top forudsagte MHC klasse I bindende mutationer, immuniserede vi mus subkutant med syntetiske lang peptidvacciner koder for relevante mutation. Syv af 17 vacciner inducerede robuste mutationsspecifikke CD4 og /eller CD8 T-cellereaktioner. Ingen af ​​vaccinerne forlængede overlevelsen af ​​tumorbærende mus enten profylaktisk eller terapeutisk indstilling. Desuden er ingen af ​​de neoantigen-specifikke T-cellelinjer anerkendte ID8-G7 tumorceller

in vitro

, hvilket indikerer, at de tilsvarende mutationer ikke gav anledning til

respektabelt

MHC-præsenterede epitoper. Derudover bioinformatisk analyse af The Cancer Genome Atlas data viste, at kun 12% (26/220) af HGSC tilfælde havde en ≥90% sandsynlighed for at huse mindst et autentisk, naturligt behandles og præsenteres neoantigen versus 51% (80/158) af lungecancere. Vores resultater fremhæve de begrænsninger på anvendelsen neoantigen målrettet vacciner til tumortyper med mellemliggende /lav mutation byrder

Henvisning:. Martin SD, Brown SD, Wick DA, Nielsen JS, Kroeger DR, Twumasi-Boateng K, et al. (2016) Lav Mutation Burden i kræft i æggestokkene kan begrænse Utility af neoantigen-målrettede Vacciner. PLoS ONE 11 (5): e0155189. doi: 10,1371 /journal.pone.0155189

Redaktør: Ali A. Ashkar, McMaster University, CANADA

Modtaget: Marts 1, 2016 Accepteret dateret 25. april 2016 Udgivet: 18. maj 2016

Copyright: © 2016 Martin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle sekventering data er frit tilgængelige på NCBI Sequence Læs Arkiv, tiltrædelse nummer: SRP069102. Alle andre data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research (SDM, RAH, Bhn) (MOP137133, 201110GSD-277.623-204.857), http : //www.cihr-irsc.gc.ca; United States Department of Defense (RAH, Bhn) (OC110435), https://www.defense.gov/; Canadian Breast Cancer Foundation (SDM, RAH, Bhn), https://www.cbcf.org, og British Columbia Cancer Foundation (RAH, Bhn), https://bccancerfoundation.com. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

somatisk muterede cancer-antigener, eller “neoantigener”, er attraktive immunterapi mål, der for nylig blevet tilgængelige på grund af fremskridt inden for næste generation sekventering (NGS) teknologier [1,2]. I modsætning cancer /testis (CT) eller differentiering antigener, som kodes i kønscellerne, neoantigener er tumor begrænset og er ikke udtrykt i thymus eller andre ikke-maligne væv. Derfor høj affinitet neoantigen-reaktive T-celler undslippe negativ selektion i thymus, og on-target /off-tumor toksiciteter minimeres. Bidrag neoantigener til vellykket immunterapi bliver mere og mere tydelig. Kliniske reaktioner på anti-PD-1 [3] og -CTLA-4 [4,5] antistoffer er blevet forbundet med høj mutation belastning, hvilket antyder, at neoantigener kan være de mest relevante målantigener underliggende vellykket immune checkpoint blokade. Desuden er der stigende tegn på, at neoantigen-specifikke T-celler ofte ligger til grund for en vellykket behandling med tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) [6]. I den første offentliggjorte kliniske studie for bevidst at målrette en NGS identificerede neoantigen, adoptiv overførsel af en nær-klonal population af neoantigen-reaktive T-celler resulterede i regression af en metastatisk cholangiocarcinom [7]. Men da langt de fleste mutationer, og dermed neoantigener, er unikke for de enkelte patienter, terapeutisk målretning af neoantigener kræver en individualiseret tilgang [1,2,8-13]. Selvom dette udgjorde en væsentlig hindring i fortiden, disse tilgange er stadig mere realistisk i den moderne æra af personlig onkologi [14-16].

For en mutation til at give anledning til en mutant neoantigen, flere kriterier skal være opfyldt : a) mutationen skal være til stede i et peptid, der er behandlet fra moderselskabet protein ved intracellulær antigen maskiner; b) mutanten peptid skal binde med tilstrækkelig affinitet til MHC; og c) patientens immunsystem repertoire skal indeholde T-celler med tilstrækkelig affinitet og specificitet for mutanten epitop. Som et resultat af disse kriterier, kun en lille procentdel af mutationer giver anledning til autentiske T-celleepitoper. F.eks

in silico

analyse af alle mulige 9mers fra et sæt af virale proteomer afslørede, at en median på 2% (interval af 0,07% til 10,4%) af peptider binder til en given HLA allel med en IC50 500 nM [17]. Endvidere en anden undersøgelse af virale epitoper fundet, at kun 8% af peptider, der er bundet til MHCI med en IC50 100 nM repræsenterede autentiske epitoper, hvilket betyder, at de naturligt blev forarbejdet, præsenteres på MHCI, og anerkendt af autologe CD8 T-celler [18]. Ud fra disse data, ville man forudsige, at kun en lille del af mutationer giver anledning til autentiske neoantigener. Da antallet af somatiske punktmutationer i humane tumorer kan variere med fem størrelsesordener inden for og mellem tumortyper [19,20], fra perspektivet af neoantigen belastning, nogle kræftformer er uløseligt mere immunogene end andre. Faktisk bioinformatisk analyse af kræft Genome Atlas (TCGA) data viste, at øgede punkt mutation og neoantigen byrder forbundet med øget cytotoksisk T-celle infiltration [21,22], hvilket understreger forholdet mellem neoantigen belastning og immun anerkendelse af tumorer.

Flere undersøgelser har brugt NGS data til systematisk vurdering anerkendelse af somatiske punktmutationer ved CD4 og CD8 tIL. Indledende undersøgelser blev udført i melanom patienter, der havde responderet på kontrolpunkt blokade eller adoptiv T-celle terapi. Anywhere fra 0 til 3 neoantigener blev anerkendt per patient [10,13,23,24]. Da melanomer huser en median på 130 ikke-synonyme punktmutationer [25], disse resultater tyder på, at kun en mindre del af mutationer giver anledning til autentiske neoantigener. To studier af karcinomer har brugt NGS til at identificere neoantigen reaktive T-celler på en omfattende måde forud for enhver immunterapi administreres. Vores gruppe sekventeret primære og tilbagevendende tumorer fra tre HGSC patienter og identificeret en enkelt neoantigen-reaktivt T-celle-klon i TIL fra en patient; kombinere data fra alle tre patienter viser, at 1,3% (1/79) af mutationer gav anledning til autentiske MHCI epitoper [12]. Desuden i en undersøgelse af 10 gastrointestinale tumorer huser tilsammen 1.452 mutationer, 18 mutationer (1,2% af det samlede beløb) blev anerkendt af CD4 eller CD8 TIL (interval = 0-3 pr tilfælde) [26]. Således er disse to sidstnævnte undersøgelser viser, at omkring 1% af punktmutationer give anledning til neoantigener som fremkalder spontan TIL responser.

Mens de ovennævnte undersøgelser var baseret på en analyse af eksisterende T-celle-responser, andre har undersøgt i hvilket omfang neoantigen-specifikke T celle responser kan primes ved vaccination. Faktisk humane vaccine undersøgelser viste, at T-celle responser kan fremkaldes mod mutationer i fælles driver gener, herunder punktmutationer i KRAS [27] og p53 [28] og for at breakpoint sekvenser i fusionsoncoproteinet BCR-ABL [29]. Med NGS, kan man udvide denne fremgangsmåde ud over de etablerede, fælles mutationer til hele komplementet af somatiske mutationer i et individs tumor (benævnt mutanome). Ved at anvende MHC bindende algoritmer til at mutanome data, kan man designe individualiserede vacciner, der er målrettet de bedst forudsagte mutante epitoper i en given tumor. Neoantigen-specifikke vacciner baseret på denne fremgangsmåde har vist terapeutisk effektivitet i murine modeller af melanom, carcinom og kræftfremkaldende-induceret sarkom [30-33]. Men til dato har sådanne prækliniske studier målrettet tumorer indeholder alt fra 949 til 4285 ikke-synonyme mutationer [30-33]. I modsætning hertil humane tumorer indeholder en median på kun 44 ikke-synonyme mutationer [20], hvilket rejser spørgsmålet om, hvorvidt tumorer med mellemliggende til lave mutation byrder er modtagelige for neoantigen målrettet vaccination.

Høj kvalitet serøs carcinom ( HGSC) er den mest almindelige histologiske undertype af kræft i æggestokkene, og langsigtede overlevelsesrater har ikke forbedret over 30-40% for de sidste 30 år [34]. Svarende til andre kræftformer, er tilstedeværelsen af ​​tumor-infiltrerende T-celler stærkt forbundet med overlevelse i HGSC [35], som har inspireret bestræbelser på at udvikle immun-baserede behandlinger for denne sygdom [36]. Der er identificeret adskillige kandidat målantigener, herunder p53 [37], WT-1 [38], NY-ESO-1 [39], mesothelin [40], og folat receptor [41]. Men disse repræsenterer, self-antigener, som er genstand for spørgsmål af immunologisk tolerance og autoreaktivitet. Desuden terapeutiske målretning af disse antigener ved anvendelse af vacciner [37,38], eller CAR T-celler [42] har givet kun sporadiske reaktioner i HGSC til dato. Således kan man behandle HGSC med neoantigen-specifikke vacciner er overbevisende fra både et immunologisk og klinisk standpunkt. Men i modsætning til meget muterede maligniteter såsom melanom, har HGSC fundet, at huse en median på kun 40 missense mutationer pr tumor [25], hvilket placerer den meget tæt på medianen for humane kræftformer [20]. Således HGSC er et ideelt sygdom til at teste anvendeligheden af ​​neoantigen målrettede vacciner i maligniteter med mellemliggende mutation belastninger.

Til dette formål, vi udførte prækliniske vaccine studier ved hjælp af et derivat af den murine ovariecancer model ID8. Den ID8 linje er blevet brugt i udstrakt grad til at studere de biologiske og immunologiske karakteristika for ovariecancer [43-45]. Den opstod ved spontan transformation af normale murine æggestokkene overflade epitel (OSE) celler under seriel

in vitro

passage [46]; Derfor var det ikke forventes at huse det store antal af mutationer findes i kræftfremkaldende-inducerede tumorer. Selv om de fleste menneskelige HGSC menes at opstå fra de distale æggeleder sekretoriske epitelceller [34], den OSE-afledte ID8 linje giver anledning til aggressive, bredt formidles kræftformer, der er patologisk og histologisk ligner humant HGSC [43,46]. Linjen er følsom over for immun checkpoint blokade [45] og adoptiv T-celle terapi [47], hvilket gør det til et attraktivt system til at vurdere nye T-celle-baserede immunterapier. Efter at have udført hele exome og transkriptom sekventering på et derivat af ID8 linje, vi systematisk evalueret alle identificerede ikke-synonyme mutationer som mål for profylaktisk og terapeutisk vaccination. Vi sammenlignede vores resultater til 220 menneskelige HGSC sager ved hjælp af data fra The Cancer Genome Atlas (TCGA). Vores resultater viser, at den relativt lave mutation belastning i både ID8 tumorer og den menneskelige HGSC præsenterer en stor udfordring for neoantigen-baserede vacciner.

Metoder og Materialer

Exome og RNA-sekventering

Bibliotek konstruktion, sekventering, og bioinformatik analyse blev udført ved Michael Smith Genome Sciences Center. Genomisk DNA blev ekstraheret fra dyrkede ID8-G7 tumorceller og normale C57BL /6 splenocytter. DNA blev fremstillet for exome udvælgelse ifølge fabrikantens protokol under anvendelse af Agilent SureSelectXT Reagent kit HSQ (Cat # G9611A), og DNA blev beriget med exomes ved hjælp Agilent SureSelectXT All Mouse Exon Kit (Cat # 5190-4641). 100bp, parret-ende sekventering blev udført under anvendelse af Illumina HiSeq2000 platformen. Efter RNA-ekstraktion blev mRNA beriget ved hjælp Miltenyi Biotec μMACS mRNA Isolation Kit (Cat # 130-090-276) og omdannes til cDNA under anvendelse af Invitrogen Superscript dobbeltstrenget cDNA Synthesis Kit (Cat # 11.917-010). cDNA blev klippet, ende poleret, og ligeret til adaptorer efterfulgt af 100bp parret ende sekventering på Illumina HiSeq2000 platformen.

Bioinformatik analyse

100bp parret ende læser fra exome sekventering blev kortlagt til murine henvisning genom (MM9) hjælp Burrows-Wheeler Aligner (BWA) [48]. Dubletter blev markeret ved hjælp Picard MarkDuplicates (version 1,102), og SNV og indels blev identificeret ved hjælp af Samtools (version 0.1.18) pileup og VarFilter [49]. Varianter blev kommenteret hjælp Annovar [50], og visuelt ved hjælp af integreret Genomics Viewer (IGV) (version 2.3.32) [51]. Alle varianter fundet i dbSNP138 blev fjernet. RNA-seq læser blev justeret til en genom-plus-kryds referere (MM9) ved hjælp af BWA, og læser at kortlagt til vejkryds blev omplaceret som store-gapped genomiske linjeføringer. Læser blev visualiseret ved hjælp IGV at afgøre, om RNA-sekventering læser indeholdt muterede alleler identificeret i exome sekventering data. Bam sekventering filer er tilgængelige på NCBI sekvens læste arkiv med efter tiltrædelsen nummer: SRP069102. Hvis begge RNA og exome sekventeringsdata indeholdt en variant, der ikke var til stede i exome sekventering data C57BL /6, blev varianten anses en tumor-specifik mutation. Den forudsagte bindingsaffinitet til H-2Kb og H-2Db af muterede peptider blev bestemt under anvendelse NetMHCpan2.4 [52].

Mus og tumorcellelinie

C57BL /6 mus blev erhvervet fra Jackson Labs og vedligeholdes under specifikke patogenfrie forhold. Alle mus protokoller blev godkendt af Animal Care rådgivende udvalg på universitetet i Victoria (tilladelse nummer: 2011-032 (2)), efter canadisk Råd for Animal Care retningslinjer. Adoptiv celle overførsel af splenocytter fra kvindelige OT-I transgene mus (Jackson Labs) indeholdende T-celler genkender kyllingeovalbumin (OVA)

257-264 epitop SIINFEKL blev anvendt som positive kontroller for tumorbærende eksperimenter [53]. Musebrysttumorvirus MMTV /

neu

OT-I /OT-II

transgene mus blev anvendt som værter i tumorbærende eksperimenter [54]. Disse mus er tolerant over for SIINFEKL epitop grund ekspression af OT-I-epitop (SIINFEKL) tagged onto

neu

gen i mamma-epitelvæv. ID8 tumorceller [46] blev generøst doneret af Drs. Paul Terranova og Katherine Roby i 2001 og ændret i huset for at udtrykke SIINFEKL epitopmærket til rotten

neu

onkogen. ID8-G7 tumorceller [47] blev dyrket i High Glucose DMEM (Hyclone: ​​SH30022.01) suppleret med 5% FBS (Gibco: 12.483-020), 2 mM L-glutamin (Hyclone: ​​SH30034.01), 100 U /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin (Hyclone: ​​SV30010), 50 um β-mercaptoethanol (Sigma: M6250), og 1X Insulin transferrin Selen (ITS) (Corning: 354.351).

Vaccinationer

Seks til tolv uger gamle C57BI /6 vildtype (WT) eller MMTV /

neu

OT-i /OT-II

mus blev bedøvet og subkutant podet i flanken ved hjælp af en 27 gauge nål. Hver inokulation bestod af 25-50 ug peptid (ProImmune) eller 100 ug kyllingeovalbumin (OVA) (Sigma: cat # A5503) og 10 ug poly (I: C) (Amersham: 27-4732) blandes til en samlet af 300 pi i steril PBS (Gibco: 20.012-027). Til forsøg terapeutisk vaccination, mus fik dagligt vaccinationer på dag 3-6 dage efter inokulation af tumor. For alle andre eksperimenter vaccination, mus modtog dagligt vaccinationer på dag -28 til -25 og -7 til -4 med enten tumor implantering eller ofring af mus på dag 0.

Tumor-bærende mus eksperimenter

ID8-G7 tumorceller blev løsrevet fra plader ved hjælp af trypsin, vasket 3 gange i sterilt PBS, og resuspenderes i sterilt PBS ved 10

7 celler /ml. Cellesuspensionen (10

6 celler i 100 pi) blev injiceret i det peritoneale hulrum på hver mus. Mus blev overvåget og eutaniseret ved det første tegn på abdominal udspiling skyldes ascites akkumulering. På obduktion, alle mus med abdominal udspiling indeholdt stærkt formidlet tumorer. For adoptiv overførsel eksperimenter blev OT-I transgene mus aflivet, og splenocytter blev behandlet ved at trykke splenocytter gennem en 100 um nylonfilter, lysere røde blodlegemer med ACK lysis buffer (Lonza: 10-548E), og tælle levende splenocytter ved trypanblåt-farvning . OT-I splenocytter (10

5 celler i 100 pi) blev injiceret i halevenen af ​​recipientmus, efterfulgt af vaccination med 100 ug OVA og 10 ug poly. (I: C) på fire på hinanden følgende dage

IFN-y og IL-2 ELISPOT-analyser

i overensstemmelse med Miata retningslinjer [55], blev ELISPOT-analyser udført ved hjælp af validerede, standardprocedurer protokoller. Vaccinerede hunmus blev aflivet ved anvendelse af isofluoran, og milte blev straks forarbejdes til enkeltcelle-suspensioner ved at trykke gennem 100 um skærme i komplet RPMI (RPMI + HEPES (Bibco: 22.400-089) suppleret med L-glutamin, β-mercaptoethanol, penicillin og streptomycin , natriumpyruvat (Hyclone: ​​SH30239.01) og 10% FBS). Røde blodlegemer blev lyseret under anvendelse ACK lysepuffer, og friske splenocytter blev talt på en Guava cytometer under anvendelse Viacount (Cat #: 4000-0130). Splenocytter blev fortyndet til 5 x 10

6 eller 10

7 levende celler /ml (normalt mellem 75-85% af splenocytter var levedygtige) i komplet RPMI. ELISPOT plader (MSIP, Millipore: MSIPS4W10) blev overtrukket med 10 pg /ml af anti-muse IFN-γ (mAb an18, Mabtech: 3321-3-1000) eller IL-2 (Mabtech: 3441-2H) indfangende antistof og inkuberet natten over ved 4 ° C. Plader blev vasket og blokeret i 2 timer ved 37 ° C, 5% CO

2 med komplet RPMI. Inden for 2 timer mus ofres, 5 x 10

5 til 10

6 levende, forarbejdede splenocytter blev tilsat til hver brønd og stimuleret med 0,002 til 20 pg /ml af de angivne peptider, medier alene, 5 ug /ml Concanavalin A (Sigma: C5275) som positiv kontrol, eller suspensioner af 10

5 tumorceller /brønd. Kulturer blev inkuberet i 20 timer ved 37 ° C og 5% CO

2. Plader blev vasket, 1 ug /ml sekundært antistof (biotinyleret anti-IFN-γ: mAbR4-6A2, Mabtech: 3321-6-250, eller biotinyleret anti-IL-2: Mabtech: 3441-2H) blev tilsat, og plader blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Plader blev udviklet ved anvendelse Vector Labs ‘Vectastain ABC Elite kit (Cat #: PK-6100) og Vectastain AEC substrat-reagens (Cat #: SK-4200) ifølge producentens protokol og afsluttet med en automatiseret pladelæser (AID) under anvendelse forudindstillede parametre, er blevet valideret over flere eksperimenter.

Intracellulær cytokin farvning (ICS) og cellesortering

Mus blev vaccineret og aflivet som beskrevet ovenfor. Friske splenocytter (2 x 10

6 celler /1 ml /brønd) blev inkuberet med 20 pg /ml af sammenhørende mutant peptid eller medier alene, i plader med 24 brønde. For ICS blev splenocytter inkuberet i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO

2. GolgiPlug (BD: 51-2301KZ) blev tilsat, og cellerne inkuberes i yderligere 11 timer. Celler blev derefter bearbejdet i overensstemmelse med producentens protokol under anvendelse af foxp3 /Transcription Factor Farvning Set (eBioscience, Cat #: 00-5523). Kort fortalt blev cellerne høstet og farvet i 30 minutter med fixable viabilitetsfarvestoffet (0,5 pl /1 ml prøve) (eF780, eBioscience: 65-0865-18), vasket og farvet i 30 minutter med overfladen antistoffer (CD4-V450 1/200, BD: 560468; CD8-PE 1/500, Tonbo Biosciences: 50-0081-U100; MHCII-FITC 1/200, eBiosciences: 1250166), faste og permeabiliserede og farvet i 30 minutter med IFN-γ antistoffer (IFN-y APC 1/200, eBiosciences: 17-5743). Analytisk flowcytometri blev udført på en BD FACSCalibur flowcytometer og analyseret under anvendelse FlowJo (vX.07). For cellesortering blev celler høstet fra plader med 24 brønde efter 24 timers stimulation med peptid. Celler blev filtreret gennem et 40 um nylonfilter, farvet med viabilitetsfarvestoffet-eFluor780 (0,5 pl /1 ml opløsning), vasket og farvet med overfladevandet antistoffer (CD4-V450 1/200; CD8-V500 1/50, BD: 560.776; MHCII FITC 1/200; 41BB-PE 1/100, BioLegend: 107.105; OX40-APC 1/100, BioLegend: 119.409). Celler blev sorteret ved hjælp af en BD Tilgangen celle sorteringsanlæg, og sorterede celler blev udvidet i 100 U /ml IL-2 (eBiosciences: 34-8021). I komplet RPMI

neoantigen forudsigelse i TCGA lungekræft og HGSC datasæt

TCGA mutation annotationsfiler blev fortolket, og HLA-alleler blev forudsagt ud fra RNA-seq data for HGSC, lungeadenocarcinom (LUAD) og lunge pladecellecarcinom (LUSC) tumorer som beskrevet tidligere [21]. SNVs blev yderligere filtreret ved at kræve mindst en læst i RNA-seq bam fil til at have den muterede base. Samtools v0.1.17 blev brugt til ekstrakt læser dækker mutation websted fra de indekserede bam filer, og en brugerdefineret python script kontrolleres for det muterede base. Epitop forudsigelser blev udført for alle 8-11mer peptider i forhold til autolog

HLA-A

allel (er) ved hjælp NetMHCpan v2.8 [52]. En IC50 værdi på 100 nM blev anvendt som tærsklen for at kalde høj affinitet epitoper [18]. Da kun

HLA-A

alleler blev kaldt på grund af udfordringer i at kalde entydig

HLA-B

C

alleler fra 50bp sekventering data fra TCGA, værdier blev ganget med 3 at tage højde for tre HLA loci (

HLA-A

,

B

,

C

). For at estimere sandsynligheden for en patient med et givet antal forudsagte neoantigener indeholder mindst én autentiske neoantigen, vi anvendt resultaterne af en undersøgelse, der viser, at kun 8% af peptider, der binder MHCI med IC50 100 nM viste sig at være autentisk (dvs.. 92% var ikke autentiske) [18]. Vi beregnede chancen for en patient, der indeholder 0 immunogene mutationer ved hjælp af ligning 0.92

N, hvor “N” er lig med antallet af forventede neoantigener. Subtraktion fra én, vi ankom til procent sandsynlighed for en patient med N forudsagde neoantigener der indeholder mindst et autentisk neoantigen.

Resultater

Identifikation og validering af tumor-specifikke mutationer i ID8-G7 tumor line

med det mål at studere en ovariecancer model med en neoantigen repertoire ligner humane tumorer, vi undersøgte en variant af ID8 tumor linje (ID8-G7). Fordi ID8 linje blev genereret af

in vitro

seriel passage, det var ikke forventes at huse det store antal af mutationer findes i kræftfremkaldende-inducerede tumorer. Men da transformationsprocessen forekom helt

in vitro

i mangel af immunologisk pres, vi begrundede det kunne have givet anledning til neoantigener med unaturligt høje MHC tilhørsforhold. I modsætning hertil ID8-G7 linje gennemgik en runde af

in vivo

passage i en syngene (C57BI /6), immunkompetente mus [47], som skulle have resulteret i et repertoire af neoantigener der mere ligner tumorer fra immunkompetente æggestokkene kræftpatienter. Mens dette kunne have elimineret udtryk for nogle immunogene, undværlige mutationer (dvs. personbiler mutationer), skal eventuelle væsentlige driver mutationer er blevet bevaret. At tilvejebringe en positiv kontrol antigen, den ID8-G7 linje udtrykker CD8 T-celleepitop SIINFEKL som en kimær konstruktion med rotte

neu

protein (Neu

OT-I /OT-II) [47] . Som værter anvendte vi

MMTV /neu

OT-I /OT-II

transgene mus, som er tolerante over for SIINFEKL [54]. Efter intraperitoneal injektion i

MMTV /neu

OT-I /OT-II

mus, den ID8-G7 tumor linje giver anledning til aggressiv, formidlet bredt kræft, kendetegnet ved omfattende ascites [47]. Imidlertid kan næsten fuldstændig regression af fremskreden sygdom opnås ved adoptiv overførsel af SIINFEKL-specifikke CD8 T-celler (OT-I T-celler), hvilket viser følsomheden af ​​ID8-G7 tumorer til immunologisk kontrol [47]. Således ID8-G7 modellen en velkontrolleret system til evaluering neoantigener som mål for immunterapi.

Exome sekventering blev udført på genomisk DNA fra både ID8-G7 tumorcellelinje og C57BL /6 muse splenocytter. Derudover blev RNA-seq udført på ID8-G7 tumor linje. Exome sekventering genereret 127 mio læser, at kortlagt til referencen musen genom, hvilket resulterer i et gennemsnit på 89-fold dækning. Parret-end RNA-seq genereret 158 ​​mio kortlagt læser (sekventering bam-filer er tilgængelige på NCBI sekvens læste arkiv med efter tiltrædelsen nummer: SRP069102). Efter fjernelse varianter til stede i enten kontrollen musegenomet eller dbSNP138 identificerede vi 92 ikke-synonyme tumorspecifikke kodende varianter (fig 1). Af disse 42 varianter var til stede i mindst 1 aflæses inden RNA-seq data, der angiver, at de blev transkriberet (S1 tabel). Vi udelukkede non-sense mutationer, da disse ikke forventedes at give anledning til T-celleepitoper. Dette efterlod 39 ikke-synonyme, transskriberet, missense eller indsættelse /sletning (Indel) varianter (figur 1). Aminosyresekvenserne, der omfatter mutationerne blev forespurgt under anvendelse epitop forudsigelse software (NetMHCpan2.4 [52]). Ved hjælp af en afslappet cutoff af IC50 1500 nM, vi identificeret 17 mutationer forventes at give anledning til mindst én MHCI bindende epitop, og disse blev fremført til eksperimenter vaccination (tabel 1). En ekstra forudsagde MHCI bindende mutation (i genet 1110021LRik) kunne ikke vurderes på grund af vanskeligheder syntetiserer det tilsvarende peptid. Alle de målrettede mutationer betegnes som mellemliggende affinitet bindemidler, som deres forudsagte IC50 scorer varierede fra 103-1160 nM (tabel 1).

Mutationer blev identificeret ved hele exome sekventering og ekspression blev vurderet ved anvendelse af RNA-seq. Epitop forudsigelse blev udført under anvendelse NetMHCpan2.4 [52]. Startende med 92 mutationer i genomisk DNA, 17 mutationer i peptider forudsagt at binde MHCI (IC50 1500 nM) blev ført frem til efterfølgende eksperimenter

Hver mutation, der blev fundet i et peptid forudsagt at binde sig til. H-2Kb eller H-2Db med en IC50 1500 nM blev kommenteret. Vist for hver mutation er aminosyresubstitutionen, forudsagde højeste bindende epitop, bindende score, bindende H-2 allel, RNA-seq read count understøtter den muterede og vildtype allel, og 29mer peptid anvendes til vaccination.

Induktion af mutation-reaktive T-celler ved peptid-vaccination

for at afgøre, om nogen af ​​de 17 forudsagte neoantigener var immunogene, blev naive C57BI /6 mus vaccineret med 29mer peptider med den muterede rest i den centrale position. Ved at bruge 29mer peptider, kan intracellulær antigen-processering potentielt producere nogen mutationsbærende epitop af 15 aminosyrer eller mindre. Hver gruppe mus blev vaccineret med en af ​​de 17 mutante peptider og 10 ug poly (I: C) på fire på hinanden følgende dage som tidligere beskrevet [56], efterfulgt af yderligere fire daglige inokulationer tre uger senere. T-celle responser blev vurderet af IFN-γ ELISPOT. Dette vaccinationsprogram fremkaldt robuste T-celle responser på 29mer peptider koder SIINFEKL samt mutant Spas1, en velkarakteriseret tumor neoantigen fra TRAMP-C2 tumormodel [57] (S1 Fig). Når det bruges til at målrette ID8-G7 tumorspecifikke mutationer, vaccination fremkaldte T-celle responser på 11/17 mutante peptider (fig 2). For disse 11 mutante peptider blev krydsreaktivitet til vildtype (WT) version af peptidet vurderet ved titrering af WT og mutant peptider i IFN-γ ELISPOT-analyser. For 4/11 mutationer, T-celler reagerede på de mutante og WT peptider ved lignende koncentrationer, hvilket indikerer en høj grad af krydsreaktivitet (Fig 3). For de resterende 7/11 mutationer viste T-celler a 100 gange højere følsomhed for det mutante peptid sammenlignet med WT-peptidet. Intracellulær cytokin-farvning afslørede, at 5/7 af disse responser er involveret både CD4 og CD8 T-celler (figur 4), med CD4 T-celler dominerer svarene i 4/5 tilfælde. De resterende 2/7 responser blev medieret af CD4 T-celler alene. Således 7/17 (41%) af mutante peptider fremkaldte en mutation-specifik T-celle respons efter vaccination, og de fleste reaktioner var domineret af CD4 T-celler. Disse syv mutationer blev ført frem til yderligere undersøgelser.

Mus (n = 3 pr gruppe) blev vaccineret dagligt på dag 0-3 og 21-24 med mutant 29mer peptider (50 ug, et peptid pr gruppe) og poly (I: C) (10 ug). På dag 28 blev musene aflivet, og splenocytter (10

6 celler /brønd) blev stimuleret in duplo med mutante 29mer-peptider (20 ug /ml) eller medier, og vurderes af IFN-y ELISPOT. Positive kontrol mus blev vaccineret med en 29mer peptid (lang SIINFEKL) omfatter den kendte OVA

257-264 epitop. A. Elleve af 17 mutante peptider fremkaldte robuste T celle responser. Dots repræsenterer reaktioner i de enkelte mus, og bjælker repræsenterer gennemsnittet for tre mus. Den stiplede linie viser tærsklen for positivitet (3 x maksimal baggrund for splenocytter i medier alene bestemt post-hoc). B. repræsentant ELISPOT brønde fra 3 mus vaccineret med mutante CUL2 peptid og stimuleret in duplo med mutant CUL2 peptid eller medier alene.

Mus (n = 2 pr gruppe) blev vaccineret som i fig 2. På dag 28 blev musene aflivet, og splenocytter (5 x 10

5 celler /brønd) blev stimuleret in duplo med titrerede koncentrationer af mutant eller vildtype 29mer peptider i IFN-y ELISPOT brønde. Prikker og barer repræsenterer middelværdien og vifte af svarene, henholdsvis.

Mus (n = 2 pr gruppe) blev vaccineret som i fig 2. På dag 28, splenocyter blev høstet fra vaccinerede mus, inkuberet natten over i medier indeholdende de angivne mutante peptider eller medier alene og analyseret ved flowcytometri. Celler blev gated om levedygtighed og manglende MHCII ekspression (aktiveret murine T-celler er MHCII negativ). Procentdelen af ​​IFN-y-udskillende CD8 og CD4-T-celler blev bestemt. A. Eksempel på en blandet T-celle respons (CD8

top

CD4

bund

) til mutant Dync1h1 29mer peptid versus medier alene. B. Sammenfatning af data for 7 mutante peptider og den positive kontrol-peptidet lang SIINFEKL. Barer og prikker repræsenterer middelværdier og individuelle svar, henholdsvis.

profylaktiske og terapeutiske vaccinationer af tumor-bærende mus

For at teste, om vaccine-aktiverede mutation-specifikke T-celler kan fremkalde regression af ID8-G7 tumorer, mus med tre dage gamle tumorer blev vaccineret på fire på hinanden følgende dage med individuelle mutant peptider og poly (i: C). Som forventet, 9/10 positive kontrol mus, der undergik ACT med OT-I efterfulgt af vaccination med OVA og poly (I: C) forblev tumor gratis 80 dage efter tumor implantation (Fig 5a).