PLoS ONE: Udbredt FRA1-Dependent Kontrol af Mesenchymale transdifferentiering Programmer i kolorektal cancer Cells

Abstrakt

Tumor invasion og metastase involverer komplekse ombygning af genekspression programmer for epitelial homeostase. Mutations aktivering af ras-ERK er en hyppig forekomst i mange cancere og har vist sig at drive overekspression af AP-1 familie transkriptionsfaktor FRA1, en potent regulator af migration og invasion i en række forskellige tumorcelletyper. Dog forbliver arten af ​​FRA1 transkriptionelle mål og de molekylære veje, hvorigennem de fremmer tumor progression dårligt forstået. Vi fandt, at FRA1 var stærkt udtrykt i tumorceller ved invasive forsiden af ​​humane kolorektal kræft (CRC’er), og at dets udtømning undertrykt mesenkymale-lignende funktioner i CRC celler

in vitro

. Genom-dækkende analyse af FRA1 kromatin belægning og transkriptionel regulering identificeret epitelial-mesenkymale overgang (EMT) relaterede gener som en vigtig klasse af direkte FRA1 mål i CRC celler. Ekspression af pro-mesenchymale delmængde af disse gener forudsagte negative resultater i CRC patienter, og involverede FRA-1-afhængig regulering og samarbejde med TGFp-signalvejen. Vores resultater viser en uventet udbredt og direkte rolle for FRA1 kontrol over epitel-mesenkymale plasticitet i CRC celler, og antyder, at FRA1 spiller en vigtig rolle i mediering krydstale mellem onkogene RAS-ERK og TGFp signalering netværk under tumorprogression.

Henvisning: Diesch J, Sanij E, Gilan O, Kærlighed C, Tran H, Fleming NI, et al. (2014) Udbredt FRA1-Dependent Kontrol af Mesenchymale transdifferentiering Programmer i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 9 (3): e88950. doi: 10,1371 /journal.pone.0088950

Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: November 3, 2013; Accepteret: 16 Jan 2014; Udgivet: 21 Mar 2014

Copyright: © 2014 Diesch et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af projektbevillinger 1026228 og 1044168 (til ASD) og Senior Research Fellowships (til RDH, RBP og JMM) fra National Health og Medical Research Council of Australia. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lokal invasion og metastase af colorektal og nogle andre carcinom typer menes at involvere forbigående ombygning af epiteltumor cellefænotype til et invasivt mesenchymale-lignende tilstand, kendetegnet ved defekter i stram og adherens junction dannelse, øges i mellemprodukt filament proteiner (f.eks vimentin) og forhøjet ekspression af proteaser medierer nedbrydning af den ekstracellulære matrix. Sådanne epitel-mesenkymale overgange (EMT) og mesenkymale-epitel overgange (Met) involverer omfattende og stærkt koordinerede ændringer i genekspression, som reguleres af komplekse signal- og transskription faktor netværk, der engagerer master-EMT transkriptionsfaktorer, der tilhører den grundlæggende helix-loop-helix ( bHLH), sneglen, Twist og ZEB familier [1] – [3]

Kolorektal cancer (CRC) er en genetisk heterogen sygdom, hvis metastatisk spredning til leveren, lungerne, bughulen og knogler udgør store kliniske problemer. [4]. Mere end 50% af CRCs harbour onkogene mutationer i

KRAS

eller

BRAF

gener, der øger vedvarende aktivering af ERK MAPK-vejen. Disse mutationer generelt opstår på et relativt tidligt tidspunkt i løbet af adenom-karcinom progression efter funktionelt tab af tumor suppressor APC, og deres høje forekomst af konkordans i primære og metastatiske cancere tyder på, at de bidrager til både tumor initiering og progression [5] – [ ,,,0],8]. På senere stadier, nogle svulster erhverve mutationer (

TGFBR2

,

SMAD2

,

SMAD3

eller

Smad4

), der forstyrrer signalering via TGF-vejen, som giver væksthæmmende signaler i den normale tarm epitel.

i CRC, er EMT-lignende begivenheder stærkt forbundet med spirende, en patologisk fænomen observeret i 20-40% af tilfældene, hvor tumorceller løsnes fra invasive forsiden og invadere i den omgivende basalmembran [9], [10]. Samspillet mellem EMT og MET er også blevet foreslået at ligge til grund den observation, at basalmembran ekspression ofte går tabt ved den invasive foran CRCs, men genvandt i metastaser [11]. For nylig har flere undersøgelser identificeret EMT-relateret genekspression signaturer som et almindeligt fænomen i primære CRCs, som er stærkt forbundet med dårlig prognose og modstandsdygtighed over for målrettede behandlinger [12] – [15].

Et af store veje er involveret i induktion og vedligeholdelse af EMT-begivenheder under udvikling og tumorigenese er TGF-vejen. Selv aktivering af vejen er væksthæmmende i normale epitelceller, har onkogen RAS-ERK signalering blevet rapporteret at inducere en paradoksal skifte i sin rolle fra tumor suppressor til pro-metastatisk faktor, dels gennem aktivering af EMT-relaterede programmer [2] [16] – [19]. Mekanismerne bag pro-malign krydstale mellem RAS og TGFp veje under CRC progression er ikke godt forstået. Forstyrrelse af TGFp-vejen er en hyppig begivenhed i CRC. Komplet inaktivering af TGFp signalering gennem mutation af type II TGF receptor (

TGFBR2

) locus er en fælles begivenhed i de 15% af CRC’er viser DNA mikrosatellit instabilitet (MSI), som ironisk nok er forbundet med gunstige prognostiske udfald [ ,,,0],20]. De resterende 85% af mikrosatellit stabil (MSS) kræftformer vise kromosomal ustabilitet (CIN), og ofte (~ 50% af tilfældene) havnen mutationer i

Smad4

gen, og mindre hyppigt på

SMAD2

og

SMAD3

gener [21]. Nylige undersøgelser har vist, at

TGFBR2

genotype er den vigtigste faktor for en mangel på EMT-lignende reaktioner på TGFp1 i MSI-positive tumorer, mens CRC celler med

Smad4

mutationer bevarer evnen til at undergå EMT upon TGFp1 behandling gennem kobling med ERK-vejen [22]. Arten af ​​ERK pathway effektorer kræves til disse reaktioner er for tiden uklar.

Activator Protein-1-kompleks er en vigtig regulator af transskriptionelle responser induceret af forskellige cancerassocierede signalveje. Den består af homo- eller hetero-dimerer af Fos, Jun, ATF og MAF familiemedlemmer, hvis aktiviteter er stærkt påvirket af onkogene signalering begivenheder. Aktiverende mutationer i Ras-vejen komponenter er blevet vist at inducere overekspression af Fos familiemedlem FRA1, et meget ustabilt protein, der udtrykkes i lave niveauer i normale celler [23], [24]. Transkriptionel induktion og posttranslationel stabilisering af FRA1 af onkogene RAS-ERK-signalering forøger den relative overflod af FRA1 indeholdende AP-1-dimerer, som er blevet årsagssammenhæng forbedret migration og invasion af CRC og multiple andre carcinom celletyper, herunder bryst-, lunge-, blære, hoved og hals, skjoldbruskkirtel og hjerne [6], [23] – [34]. Ud over den RAS-ERK-vejen, er FRA1 ekspression induceret af Wnt /β-catenin pathway i CRC-celler [40], [41], hvilket tyder på, at det kan spille en rolle i integrationen af ​​signalering gennem disse pathways under CRC progression.

i den foreliggende undersøgelse, vi anvendte en genom-strategi for bedre at forstå karakteren af ​​transkriptionelle programmer ligger til grund for pro-maligne handlinger FRA1 i CRC. Vi fandt, at FRA1 binder og regulerer ekspressionen af ​​en klinisk relevant kohorte af gener forbundet med EMT i invasive CRC celler, med stabil FRA1 knockdown påberåbe en MET-lignende fænotypisk switch. FRA1 var stærkt beriget med spirende tumorceller ved invasive forsiden af ​​menneskelige CRC’er, og udtryk for sine pro-mesenkymale mål identificeret en delmængde af primære kræftformer med dårlig prognose. Mekanistisk, fandt vi, at aktivering af mesenkymale gener involveret FRA1-afhængig regulering og samarbejde med TGFp signalering netværk. Kollektivt, vores resultater tyder på, at FRA1 spiller en udbredt og direkte rolle i transkriptionel kontrol af epitel-mesenkymale programmering under CRC progression.

Resultater

FRA1 er beriget i tumorceller ved invasive forsiden af ​​menneskelig CRC’er

Selv om det tidligere blev rapporteret, at FRA1 er mere stærkt udtrykt i CRC’er end den normale kolorektal epitel [35], dets forhold til tumor patologi er ikke fastlagt. Ved hjælp af immunhistokemi, vi har registreret FRA1 immunoreaktivitet i 20 ud af 25 primære tumor prøver. I modsætning til sin svag ekspression i centrum af tumorer, celler ved den invasive fronten udviste stærk FRA1 farvning (Figur 1A-1C), herunder cytokeratin AE1 /AE3 positive klynger af celler [36], der var frigjort fra tumormasse (figur 1D ). Sidstnævnte funktion er tegn på tumor spirende, et fænomen forbundet med købet af mesenkymale-lignende funktioner ved at CRC celler, og er en uafhængig prædiktor for lymfeknude metastaser, vaskulær og lymfe invasion, fjernmetastaser, lokalt recidiv og dårlig sygdomsfri overlevelse [9].

(a) Low power billede af en repræsentativ kolorektal carcinom farvet med et antistof afsløre FRA1. Stjernen angiver lumen, medens pilespidser angiver den dybe invasive front. Scale bar betegner 1 mm. (B og C) med høj effekt billeder af tumor centrum (TC) og invasive front (IF) vist i (A). Pilespidser angiver tumor knopper. Scale bar repræsenterer 10 pM. (D) Forholdet mellem intensiteten af ​​nukleare FRA1 udtryk og tumoren spirende markør, cytokeratin AE1 /AE3 i 25 CRC tilfælde.

FRA1 regulerer mesenkymale-lignende funktioner i CRC celler

Tidligere undersøgelser på de pro-invasive handlinger FRA1 i CRC har brugt BE cellelinje model, som omfatter yderst invasive mesenkymale-lignende celler, der huser

KRAS-service /

BRAF

mutationer kørsel høj endogen FRA1 udtryk [33], [37]. I overensstemmelse med sin rolle som en vigtig bidragyder til AP-1-aktivitet i disse celler, stabil knockdown af FRA1 hjælp 2 særskilte shRNAs konstruktioner reduceres både basal og c-Jun stimuleret AP-1 reportergenaktivering (figur 2A og 2B). Fænotypisk, FRA1 udtømning påberåbes en slående mesenchymale til epitel-lignende morfologiske switch, med celler erhverve en fladtrykt udseende, genvinde ekspression af epitheldifferentiering markør E-cadherin, og danner tætte overgange farves positivt for ZO-1 (figur 2A og 2C). Desuden FRA1-udtømte celler næsten helt mistet deres evne til at migrere og invadere

in vitro

, men deres spredning satser forblev uændret (figur 2D-2F). Tilsammen tyder disse resultater på et krav om FRA1 at opretholde CRC-celler i en mesenchymal-lignende tilstand.

(A) Immunoblotanalyse af FRA1 og E-cadherin-niveauer i BE-celler stabilt transduceret med en ikke-silencing kontrol ( shNS) eller FRA1-targeting shRNAs (shFRA1-A og -B). (B) Effekt af FRA1 knockdown på basal og c-Jun-induceret AP-1 reportergenaktivitet i BE celler. (C) Fase-kontrast (øverste række) og immunfluorescensfarvning for DAPI med ZO-1 (midterste række) eller vimentin (nederste række) på cellerne fra (A). Scale bar repræsenterer 10 pM. (D-F) Analyse af

in vitro

migration, invasion og proliferation i celler fra (A). Fejl- søjler repræsenterer S.E.M. 3 uafhængige forsøg.

EMT-relaterede gener er en stor klasse af direkte FRA1 mål i CRC celler

For at identificere direkte transkriptionelle mål og molekylære veje, hvorigennem FRA1 styrer mesenchymale-lignende funktioner i tumorceller, vi udførte genom-dækkende chip-Seq og transkriptom analyse til at søge efter gener, hvor FRA1 bindende blev beriget, og hvis ekspression blev reguleret af FRA1 i BE celler. Trods flere forsøg på at optimere chippen under anvendelse af antistoffer rettet mod endogene FRA1, vi var ude af stand til at inddrive tilstrækkelig kromatin at udføre efterfølgende high-throughput sekventering. Vi genererede derfor cellelinjer moderat (~ 5 gange højere end endogen FRA1) overekspression en FLAG-FRA1 protein, som blev lokaliseret i kernen (figur 3A, B). I modsætning til et DNA-bindende defekt variant, vildtype-FLAG-FRA1 viste stærk berigelse ved promotoren for

VIM

, en tidligere identificeret direkte FRA1 mål (figur 3C) [38].

(a) Immunoblotanalyse af FRA1 ekspression i BE-celler stabilt transduceret med en FLAG-FRA1 ekspressionskonstruktion af vektor (PBP) kontrol. (B) Immunofluorescensanalyse af FLAG-FRA1 lokalisering i celler fra (A). (C) chipanalyse sammenligne binding af vildtype og DNA bindende defekte (DBD) FLAG-FRA1 proteiner til

VIM

promotor i BE celler. (D) Skæringspunktet af data fra microarray (FRA1 shRNA) og chip-Seq (FLAG-FRA1) analyse i BE celler. Chippen-Seq resultater repræsenterer gener, hvor FRA1 binding blev beriget 5 gange i forhold til input-kontrol inden for 5 kb af transkriptionsstartsitet (TSS). Kun kommenterede gener gennemgår mindst to-gange ændring i udtryk på FRA1 lyddæmpning (p 0,05) blev overvejet, og gener, der er forbundet med flere FLAG-FRA1 toppe kun blev talt en gang. (E) Ontologisk analyse af gener identificeret efter skæringspunktet mellem microarray og chip-Seq datasæt. Gener blev grupperet i store biologiske veje ved hjælp GeneGo.

Brug microarrays, fandt vi, at FRA1 knockdown i BE celler markant opreguleret udtryk for 1392 gener samtidig reducere udtryk af 832 gener ved mindst 2 gange (figur 3D). Chip-Seq analyse viste, at 72% procent af FRA1-regulerede gener indeholdt loci betydeligt beriget med FRA1 binding ( 5-fold) inden for 5 kb af deres transkriptionsstartstedet (TSS). For at identificere store funktionelle klasser af FRA1 målgener, gennemskåret vi microarray og chip-Seq data og afhørt overlappende gener for berigelse af gen ontologi vilkår (ved hjælp GeneGo). Af de top 6 grupper identificeret ved hjælp af denne metode, blev tre betydeligt beriget for gener forbundet med EMT-relaterede processer, mens yderligere 3 grupper featured vedhæftning-relaterede gener (figur 3E). Disse resultater viste, at EMT og vedhæftning er to store processer under direkte FRA1 transkriptionel kontrol i CRC celler.

Baseret på de fænotypiske ændringer som følge af FRA1 knockdown i BE celler og sammenhængen mellem tumor spirende og EMT i CRC [ ,,,0],9], valgte vi at fokusere på inddragelse af FRA1 i regulering EMT begivenheder i CRC. Kollektivt de EMT-relaterede gener bundet og reguleret af FRA1 (heri betegnes FRA1

EMT gener) kodede en bred vifte af proteiner involveret celleadhæsion, signaltransduktion, transskription, cytoskeletal og ekstracellulær matrix remodellering, samt komponenter i TGFp signalering netværk (figur 4A og tabel S1 i File S1). Disse gener bredt omfattede en pro-mesenkymale delmængde, hvis ekspression blev fremmet af FRA1 og en epitelial delmængde, der blev undertrykt af FRA1. Mange af generne indeholdt multiple loci besat af FRA1, som primært var placeret inden intron regioner af genet legeme og i distale opstrøms steder (figur 4B og tabel S2 i File S1). Motiv-analyse viste, at 58% af generne indeholdt mindst én FRA1 bindingssted betydeligt beriget for en konsensus AP-1-binding sekvens (p 0,0001, tabel S3 i File S1). Vi bemærkede også signifikant berigelse (p 0,001) for formodede MEF-2 motiver i EMT-relaterede targets identificeret i chippen-Seq analyse. Endelig har vi udført chip og QRT-PCR-analyse for at bekræfte berigelse af FRA1 på flere loci identificeret ved chip-Seq (figur 4C) og FRA1-afhængig regulering af udvalgte mål i BE-celler (figur 4D).

( A) Heat kort, der viser forskellige funktionelle grupper af EMT-relaterede gener bundet og reguleret af FRA1 (FRA1

EMT gener). Data fra RNA-Seq analyse af to kloner af BE shFRA1-A-celler (n = 4 for hver cellelinje) var normaliseret i forhold til shControl celler. Regioner vist i rød repræsenterer gener associeret med en epitelial stat, som blev opreguleret efter FRA1 lyddæmpning (log fold-change -1, s 0,05), mens de grønne områder repræsenterer mesenkymale-type gener undertrykkes af FRA1 lyddæmpning (log fold-change 1 , p 0,05). (B) Fordeling af genomisk FLAG-FRA1 bindingssteder identificeret af Chip-Seq relativt til et tilsvarende gen. Antallet af læser identificeret for hver region er udtrykt som en procentdel. (C) chip-qPCR-analyse af FLAG-FRA1 binding til genomiske regioner i udvalgte FRA1

EMT gener. Data repræsenterer relativ berigelse sammenlignet med parentale være celler. En region af miRNA-21-genet ikke er bundet af FLAG-FRA1 blev anvendt som negativ kontrol (

CTRL

). (D) QRT-PCR-analyse af udvalgte FRA1

EMT gener i BE celler stabilt transduceret med en af ​​to uafhængige shRNAs rettet FRA1. Data er repræsenteret i forhold til ekspressionsniveauer i celler shNS celler. T-test blev anvendt til alle sammenligninger (

* P lt; 0,05,

** p 0,01,

*** p 0,001). Fejl- søjler repræsenterer S.E.M. for 3 uafhængige eksperimenter. (E) FRA1 proteinniveauer og (F) ekspression af epitel og mesenkym markørgener i et panel af CRC cellelinier.

Ekspression af pro-mesenchymal FRA1 mål forudsiger dårlige kliniske resultater

for at vurdere den potentielle kliniske relevans af EMT-relaterede FRA1 mål, vi undersøgte sammenhængen mellem deres udtryk og CRC prognose ved afhøre eksisterende microarray data fra 185 trin B og C sager [12]. Unsupervised gruppering af data viste, at tumorer kan inddeles i epithelial- og mesenchymale-lignende undergrupper viser genekspression forskelle meget samstemmende med FRA1

EMT signatur (figur 5B og tabel S4 i File S1), med 77% af gener ( 137 probesets), der viser retningsbestemte ændringer i overensstemmelse med dem, der er identificeret ved FRA1 knockdown i BE celler.

(A) Kaplan-Meier-kurver over tilbagefald overlevelse i fase B og C CRC patienter efter ekspressionen af ​​FRA1 genet (

FOSL1

). (B) Unsupervised klyngedannelse af scenen B og niveau C-CRC’er baseret på FRA1

EMT gener der omfatter overensstemmende probesets udviser signifikante udtryk forskelle mellem de to hovedgrupper. Clustering opdeler kræft i grupper med mesenkymale og epitel profiler. Prøver er anbragt langs X-aksen og gener langs Y-aksen. Gener er grupperet i de nedreguleret (blå) eller opreguleret (orange) ved FRA1 knockdown i BE celler i forhold til mellemtiden og prøve-centreret skaleret udtryk. (C) Kaplan-Meier-kurver over tilbagefald overlevelse i fase B og C CRC patienter baseret på ekspressionen af ​​både

FOSL1

(lav vs høj) og mesenkymale (Mes, mørk grøn) eller epitelial (Epi, lys grøn) delmængder af FRA1

EMT gener. Den log-rank test blev anvendt til sammenligninger.

Vi fandt også, at høje niveauer af FRA1 gen (

FOSL1

) udtryk uafhængigt forudsagt dårlig gentagelse overlevelse og var forbundet med en højere T-stadie, et indeks over avanceret tumor invasion (figur 5A og tabel S5 i File S1). Selv

FOSL1

ekspression blev detekteret i begge epithelial- og mesenchymal-lignende tumorer, dets ekspression var signifikant højere (p 0,05) i den sidstnævnte gruppe. Ekspression af pro-mesenkymale FRA1 mål blev beriget med 48,6% (90/185) af primære tumorer, som havde en tidligere diagnose alder (median 64 vs 70 år, p = 0,005) og højere lymfeknude etape (N2 76% vs. 24% , p = 0,0098) sammenlignet med epitel-type tumorer (tabel S6 i File S1).

Integration af data om

FOSL1

udtryk og FRA1

EMT signatur væsentligt forbedret forudsigelse af tilbagefald risiko , i store træk at adskille patienter i 3 resultatbaserede grupper (figur 5C og tabel S7 i File S1): (i) en god prognose gruppe bestående af

FOSL1

lave epitel-type kræft, (ii) en mellemliggende prognose gruppe bestående af

FOSL1

lav mesenchymale-type kræft og

FOSL1

høj epitel-type kræft, og (iii) en dårlig prognose gruppe af

FOSL1

høj mesenchymale-type kræft. Disse resultater tyder på, at kombinationen af ​​forhøjet

FOSL1

og pro-mesenkymale FRA1 target genekspression i primære tumorer giver en robust indikator for negative resultater i CRC patienter.

Cross talk mellem FRA1 og TGF-signalering styrer mesenkymale genekspression

Da deres tilknytning til negative kliniske resultater (figur 5), vi næste forsøgt at få en dybere mekanistisk indsigt i FRA1-afhængig styring af mesenkymale udtryk programmer i CRC celler. Især spekulerede vi hvis der ud over direkte bindende og regulere deres transskription, kunne FRA1 fremme ekspressionen af ​​pro-mesenkymale gener ved at modulere aktiviteterne i EMT-associerede signalveje, hvis komponenter, vi havde identificeret som direkte FRA1 mål. Den mest repræsenteret af disse var gener, der handler i TGFp signalering net, herunder dem, der koder aktivering (

TGFB2

) og hæmmende ligander (

BMP4

,

BMP7

), hvis udtryk blev forfremmet eller undertrykkes af FRA1 henholdsvis (figur 4A, 4C og 4E). Som den eneste aktiverende ligand identificeret som en FRA1 mål, valgte vi at undersøge potentielle bidrag TGFβ2 signalering i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​et udvalg af FRA1

EMT mål. Forbigående knockdown af

TGFB2

i forældrenes være celler betydeligt reduceret ekspression af flere pro-mesenkymale (

AXL

,

VIM

), men ikke epitel (

CDH1

,

CLDN7

) FRA1 målgener (figur 6A). Lignende effekter blev også observeret efter forbigående knockdown af en anden FRA1 bundet mål virkende i forløbet, der koder transkriptionsfaktoren SMAD3 (figur 6B). Til direkte undersøge den mulighed, at en FRA1-afhængig autokrin TGFβ2 loop opererede i disse celler, blev de behandlet med type 1 TGFp-receptor-inhibitor SB43152 at blokere transduktion af TGFβ2 signaler. I overensstemmelse med virkningerne af

TGFB2

knockdown, fandt vi, at ekspressionen af ​​adskillige pro-mesenkymale FRA1 mål (

AXL

,

VIM

,

TGFBI

) var signifikant reduceret efter 3 dages SB43152 behandling.

(A og B) Angivelse af udvalgte mesenkymale (

TGFBI

,

AXL

) og epitelial (

CDH1

,

CLDN7

) FRA1

EMT gener upon forbigående knockdown af TGFp pathway FRA1 mål

TGFB2

SMAD3

bruge siRNA pools i BE celler. Data er repræsenteret i forhold til niveauet af disse gener i celler transficeret med siRNA’er rettet mod GFP. (C) Virkninger af TGF-receptor-hæmmer SB43152 (10 uM i 72 timer) på ekspressionen af ​​et udvalgt mesenkymale FRA1

EMT (

TGFBI

,

AXL

) gener i BE celler. T-test blev anvendt til alle sammenligninger (

* P lt; 0,05,

** p 0,01,

*** p 0,001). Fejl- søjler repræsenterer S.E.M. 3 uafhængige forsøg.

For yderligere at undersøge omfanget af cross talk mellem FRA1 og TGF-vejen, vi vurderede udtryk for flere mesenkymale og epitel FRA1 mål i en anden

KRAS

mutant TGFp-responsiv CRC cellelinie, SW837. Trods FRA1 niveauer bliver forhøjet i disse celler (Figur 7A), deres udtryk for de pro-mesenkymale gener

VIM

AXL

var lav sammenlignet med BE celler, mens de epitel gener

CDH1

CLDN7

var stærkt udtrykt (figur 7B). Behandling med liganden TGFp1 robust induceret ekspression af

VIM

, en reaktion, der væsentligt blev forringet efter forudgående FRA1 knockdown (Figur 7C). Derimod udtryk for de epiteliale FRA1 mål

CDH1

og

CLDN7

var upåvirket under de samme betingelser. Disse resultater antyder, at FRA1 ekspression modulerer hvilket omfang TGFp signalering kan fremkalde pro-mesenchymal transkriptionelle responser i CRC-celler.

(A) Immunoblotanalyse af endogen FRA1 ekspression i BE og SW837 CRC-celler. (B) QRT-PCR-analyse sammenligner relative ekspressionsniveauer af et udvalg af mesenkymale (

AXL

,

VIM

) og epitelial (

CDH1

,

CLDN7

) FRA1

EMT gener i BE og SW837 CRC celler. (C) Virkninger af forbigående FRA1 knockdown på TGFp1-induceret (10 ng /mL 48 h) ekspression af

VIM

,

CDH1

og

CLDN7

i SW837 celler. T-test blev anvendt til alle sammenligninger (

* p 0,05). Fejl- søjler repræsenterer S.E.M. 3 uafhængige forsøg.

Diskussion

Den lokale invasion og metastatisk spredning af kræft involverer specifik, meget koordineret og dynamisk ombygning af tumorceller genekspression gennem tovejs krydstale mellem signalering og transkriptionel netværk. Stadig meget at blive forstået, hvordan disse netværk er reguleret ved tumor-associerede genetiske og epigenetiske læsioner, og de mekanismer, hvorigennem de er koordinerede at fremkalde specifikke ændringer i genekspression under invasionen.

transkriptionsfaktor AP-1 har længe været impliceret som en central regulator af tumorcelleinvasion [39]. FRA1 er en af ​​de hyppigst overudtrykt AP-1 proteiner i solide kræftformer, og dens evne til at fremme vandrende og invasive træk i en række forskellige tumor celletyper [26] – [32] tyder på, at dens handlinger involverer engagement af fælles mål og pathways. Identiteten af ​​disse veje er i øjeblikket uklart, mens kun en håndfuld af sine direkte transkriptionelle mål i carcinomceller identificeret til dato. Gennem analyse af dets genom-dækkende kromatin belægning og target genregulering, nærværende undersøgelse identificerer gener og pathways involveret i celleadhæsion og EMT som større klasser af direkte FRA1 mål forbundet med CRC progression.

EMT-lignende genekspression underskrifter er blevet rapporteret at korrelere med dårlig prognose og modstandsdygtighed over for målrettede behandlinger i CRC patienter, men de mekanismer, der styrer deres tilblivelse forstås dårligt [12] – [15]. Vores resultater tyder på, at FRA1-regulerede transkriptionelle begivenheder spiller en vigtig rolle i denne proces, med forhøjede niveauer af pro-mesenkymale FRA1 mål forbundet med negative resultater i omkring halvdelen af ​​alle fase B og fase C kræft, mens høje niveauer af FRA1 gen (

FOSL1

) udtryk i disse mesenchymale-typen identificere kræft med dårligste prognose.

Patologisk EMT i CRC stærkt knyttet med tumor spirende, en uafhængig prognostisk indikator for højere lymfeknude metastaser, vaskulær og lymfe invasion, fjernmetastaser, lokalt recidiv og dårlig sygdomsfri overlevelse [9]. Mens FRA1 udtryk forekommer relativt homogen i tumorcellelinjer, fandt vi, at det var stærkt beriget ved invasive regioner og i spirende celler, men ikke i centrum af primære tumorer. Mekanismen bag denne begrænsede ekspression i tumorer umiddelbart klart, men en lignende lokalisering mønster er blevet rapporteret for Wnt-vejen transkriptionel effektor, β-catenin [40], [41]. Som β-catenin inducerer transskription af FRA1 genet i CRC-celler, kan FRA1 /β-catenin kooperativitet spille en vigtig rolle i at kontrollere lokaliseret transkription af pro-invasive gener i kolorektale tumorer, et begreb understøttes af vores fastslå, at FRA1 direkte binder og regulerer flere mål pro-invasive β-catenin, herunder

MMP14

,

LAMC2

,

VIM

ZEB1

[11], [42] – [ ,,,0],46].

induktion af EMT indebærer ombygning af flere cellulære processer, herunder vedhæftning, signalering, transskription, og ekstracellulære matrix remodeling. Der er stigende tegn på, at tumorceller ofte kun udviser nogle af disse ændringer, for eksempel udtrykker en delmængde af mesenkymale markører samtidig bevare epitel funktioner [3]. Evnen af ​​tumorceller til transit fra en epitelial til mesenkymale-lignende tilstand er derfor sandsynligt, at være meget kontekst-specifikke, og kræver kooperativitet mellem flere signalering og transkriptionelle netværk. Evnen af ​​FRA1 til at binde og regulere gener involveret i forskellige EMT-associerede processer antyder, at det kan spille en vigtig rolle i koordinerede EMT begivenheder. Interessant nok i BE CRC celler, FRA1 binding var involveret både i at bevare ekspressionen af ​​pro-mesenkymale gener, mens undertrykke en epitelial delmængde. Flere potentielle mekanismer kan bidrage til disse modsatrettede effekter af FRA1, herunder dets samling i særskilte FRA1 /Jun komplekser inden for de samme celler, dens kobling med forskellige signalsystemer netværk og evne til at fremme ekspressionen af ​​master EMT transkriptionelle faktorer, ZEB1 og /eller SNAI2 . Derudover FRA1 binding kan resultere i lokaliserede ændringer i kromatin dynamik, en rolle nylig tilskrives AP-1 ved regulering af inducerbarhed af glucorticoid receptormål [47]. FRA1 kan således bidrage til generering af tolerante kromatin sammenhænge, ​​der er nødvendige for både omprogrammering af CRC celler til en mesenchymal tilstand, og efterfølgende at opretholde driften af ​​mesenkymale programmer, når tumorceller formidler. Interessant binding de større regioner i AP-1 tidligere identificeret nær glucocorticoidreceptor mål og i den foreliggende undersøgelse forekom opstrøms for mål-genpromotorer eller inden introns, implicerer en rolle for FRA1 i transkriptionel kontrol ved en enhancer niveau og /eller nedstrøms for transkriptionsinitiering (f.eks forlængelse).

Mens stabil FRA1 knockdown påberåbes en MET-lignende fænotypisk ændring i BE celler, har vi bemærket, at mange FRA1-overekspression CRC cellelinier bevarer epiteliale funktioner (ASD, upubliceret). Således FRA1 udtryk alene er ikke tilstrækkeligt til at drive EMT-lignende cellulære forandringer, men kan gøre det i samarbejde med andre veje. Faktisk identificerede vi komponenter af flere signalering netværk som direkte FRA1 mål i BE celler, med den mest repræsenterede handler i TGF-vejen. Vi fandt, at en underliggende funktion FRA1 i CRC celler var positivt regulere TGFp signalering, som det kunne gøre via flere mekanismer; i mesenchymale-lignende BE cellelinie, dets binding moduleret ekspression af multiple TGFp pathway komponenter, herunder opretholdelse drift af en autokrin TGFβ2 løkke, der fremmes ekspression af mesenchymale gener. Men i epitel-lignende SW837 CRC celler, hvor autokrin TGFp signalering ikke blev etableret, blev FRA1 kræves til TGFp-inducerede mesenchymal genekspression responser. Kollektivt vores resultater antyder, at FRA1 kan spille en vigtig rolle i at koble onkogen RAS-ERK-signalering med TGFp-vejen for at kontrollere EMT-lignende responser i CRC-celler. Vi foreslår, at FRA1 kan have en lignende funktion i andre cancere, hvor det overudtrykkes såsom bryst, hvor FRA1 nylig har vist sig at spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​EMT events og metastase [25], [48], og hvori TGFp Tabel S2. Tabel S3. Tabel S4.