PLoS ONE: Multiplex flowcytometri Barcoding og antistof Arrays Identificer Surface Antigen Profiler af primære og metastatiske Colon Cancer Cell Lines

Abstrakt

Tyktarmskræft er en dødelig sygdom, der påvirker millioner af mennesker verden over. Aktuelle behandling udfordringer omfatter forvaltning af sygdomsbyrden samt lettere at opdage og målretning af tumorceller. For at identificere sygdomstilstand-specifik overflade antigen underskrifter, vi kombineret fluorescerende celle stregkodesystem med high-throughput flowcytometrisk profilering af primære og metastatiske tyktarmskræft linjer (SW480, SW620, og HCT116). Vores multiplex teknik giver forbedringer i forhold til konventionelle metoder ved at tillade samtidig og hurtig screening af kræftceller med reduceret indsats og omkostninger. Fremgangsmåden anvender et protein-niveau analyse med kommercielt tilgængelige antistoffer for levende celler med intakte epitoper at afsløre potentielle tumorspecifikke mål, kan yderligere undersøgt for deres kliniske anvendelighed. Multipleksede antistof arrays kan nemt anvendes på andre tumortyper eller patologier for opdagelse tilgange at målrette identifikation

Henvisning:. Sukhdeo K, Paramban RI, Vidal JG, Elia J, Martin J, Rivera M, et al . (2013) Multiplex flowcytometri Barcoding og antistof Arrays Identificer Surface Antigen Profiler af primære og metastatiske tyktarmskræft cellelinjer. PLoS ONE 8 (1): e53015. doi: 10,1371 /journal.pone.0053015

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: 19. juni 2012; Accepteret: November 22, 2012; Udgivet: januar 7, 2013 |

Copyright: © 2013 Sukhdeo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Pediatric Brain Tumor Foundation i USA, Brain Tumor Society, Goldhirsh Foundation, og James D. McDonnell Foundation. Dette arbejde blev også finansieret af National Institutes of Health giver CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), Pathway til Independence Award CA157948 (JDL), Case Western Reserve Medical Scientist Training Program T32 GM007250 (KS), og National Research service Award, National Cancer Institute F30 CA165857 (KS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: RIP, JGV, JE, JM, CTC, og RB er betalt medarbejdere i BD Biosciences. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Tyktarmskræft rangerer blandt de mest almindelige kræftformer både forekomsten af ​​kræft og kræft- relaterede dødsfald i vestlige lande [1]. Debuterende tyktarmskræft kan styres med succes af kirurgisk resektion; imidlertid metastatisk sygdom er ofte resistente over for behandling og ansvarlig for størstedelen af ​​sygelighed og dødelighed. Klinisk beslutningstagning er styret af amerikanske Blandede Cancer TNM (tumor-node-metastaser) iscenesættelse, der er ufuldkommen for prognose og ikke forudsige respons på behandlingen. En kritisk er behov for at identificere objektive markører for malignitet, der kunne bruges til tidlig opdagelse, prognosticering, indgreb, og /eller målretning af kræftceller. Som et eksempel har tumorassocierede antigener (TAA’er) blevet anvendt til påvisning af cirkulerende tumorceller (CTCs) i blodbanen samt disseminerede tumorceller (DTC) i knoglemarven med evnen til at overvåge tumorbelastning, forudsige risiko af progression, og måle kemoterapi respons. Disse teknologier omfatter klinisk-godkendte produkter såsom CellSearch ™ (Veridex), der udnytter immunodetektering af CTCs på grundlag af epitelceller adhæsionsmolekyle (EpCAM) membranøs udtryk [2]. Celle-overflade TAA’er i særdeleshed er også værdifulde, fordi de er tilgængelige for systemisk leveret målretning molekyler (f.eks antistoffer, aptamerer, etc.), der kunne bruges til at levere bioaktive nyttelast, bloksignalering eller aktivere antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet.

Bestræbelserne på at identificere TAA’er i tyktarmskræft og andre cancertyper har påberåbt sig et væld af teknikker, hver med sit eget sæt af fordele og begrænsninger [3], [4]. Genekspression microarray profilering eller tumorafledte cDNA-ekspressionsbiblioteker med patientsera (fx Serologisk Identifikation af rekombinant udtrykt Kloner, SEREX) er baseret på RNA-niveau ekspression. Disse tilgange kan være problematisk, fordi post-transkriptionel (fx miRNA) og post-translationelle mekanismer for regulering udøve betydelig indflydelse over den aktuelle mængde protein besat af hver celle sammen med signalfunktion i cellen [5], [6]. Det vil sige, celler med lav-niveau transkripter kan indeholde uforholdsmæssigt høje niveauer af translateret protein (f.eks lange halveringstider) og vice versa. Massespektroskopi og protein microarrays arrays udnytte helcelle eller fraktionerede lysater fra colon cancerceller til påvisning af differentielt udtrykte TAA’er. Disse protein-baserede metoder til påvisning TAA’er kan påvirkes af den iboende forstyrrelse af den naturlige proteinkonformation under prøveforberedelse, fremherskende repræsentation af intracellulære proteiner, og begrænsede molekylære ressourcer (dvs. kommercielt tilgængelige antistoffer) til hurtigt at vurdere potentialet af kandidat biomarkører.

for at identificere TAA’er, vi udførte en high-throughput immunfænotypisk screening af primær og metastatisk tyktarmskræft anvendelse af et antistof array med næsten fuldstændig dækning af klyngen af ​​differentiering (CD) overflade molekyle familie samt mange andre fælles overfladeantigener . Vi multiplekses også antistoffet opstillingsscreeningen gennem anvendelse af fluorescerende celle stregkodesystem. Vores strategi identificerede omfattende overflade protein profiler herunder TAA’er deles på tværs af tumor prøver såvel som dem, der var sygdomstilstand-specifikke. Den pan-tumor TAA, integrin α6 (CD49f), blev valideret til at have en ekspressionsprofil ligner EpCAM, hvilket viser potentialet i denne teknologi til at identificere kandidat tumor biomarkører, der kunne bruges til yderligere at forfine påvisning af maligne celler, herunder CTCs /dobbeltbeskatningsoverenskomster.

Resultater

Multiplex stregkoder i kombination med antistof-array screening

To primære adenocarcinom (SW480, HCT116) og en metastatisk (SW620) tyktarmskræft cellelinjer blev udvalgt til vores undersøgelse. Alle tre linjer har en epitelial oprindelse og deres tumor biologi er blevet godt undersøgt i litteraturen. SW480 blev afledt fra en primær adenocarcinom i colon fra en patient, som efterfølgende fik tilbagefald med en udbredt mesenteriske lymfekirtler metastaser, der blev anvendt til af SW620-cellelinien [7]. Anvendelsen af ​​en patient-matchet sæt cellelinier reducerer genetiske variabilitet og giver mulighed for en mere kontrolleret sammenligning af de molekylære ændringer efter metastatisk progression [8], [9].

Multiplexing af alle tre prøver til samtidig mærkning og analyse blev opnået gennem fluorescerende celle stregkodesystem. I denne teknik er celler mærkes med et identifikationsnummer intracellulære farvestof og derefter poolet sammen før antistofmærkning. Identiteten af ​​hver cellelinje indregnes flowcytometeret på grundlag af fluorescens fra enten violet (Horizon Proliferation Dye VPD450) eller blå (carboxyfluorescein succinimidylester, CFSE) magnetisering lasere, mens den røde laser er reserveret til påvisning af Alexa647 på de sekundære antistoffer. Den SW480-cellelinien blev Barcoded ved mærkning med VPD450 mens SW620 celler blev umærket før samle begge cellelinier i et enkelt blandet population (Figur 1, se Materialer og fremgangsmåder). Den tredje cellelinje, HCT116 blev Barcoded hjælp CFSE og også blandes for at generere en enkelt pulje består af de tre forskellige cellelinier. Vi anvendte derefter kombinationen af ​​celler på et antistof-array bestående af 242 antistoffer og 9 isotypekontroller individuelt tildelte tværs af tre plader med 96 brønde (figur 1). Antistofferne indeholdt i arrayet give dækning af næsten hver klynge af differentiering (CD) molekyle og mange andre fælles overfladeantigener. Som sådan kunne vi undersøge en bred vifte af overfladeproteiner og generere signaturer for hver tyktarmskræft cellelinje.

De tre cellelinier blev mærket med eller uden intracellulær farvestof før iblanding af cellerne i en enkelt pulje . Cellerne blev derefter opdelt i alikvoter i hver brønd i antistofmærkning. Indholdet af hver brønd blev derefter bearbejdet på et flowcytometer. Identiteten af ​​hver cellelinje blev bestemt baseret på fluorescensintensitet. De passende porte blev trukket muliggør samtidig analyse for hvert antistof. Histogrammer for muse-IgM-isotypekontrol er vist.

De fleste antistoffer (158/242) blev enten fuldstændigt ikke-reaktive eller bundet mindre end 5% af cellerne sammenlignet med den respektive isotypekontrol i alle tre cellelinier og derfor ikke undersøgt yderligere i forbindelse med denne undersøgelse (helt resultaterne vist i figur S1 og tabel S1, S2, og S3). Vi fandt 25 antistoffer, som reagerede med størstedelen ( 50%) af celler i SW480, SW620, og HCT116 cellelinier (tabel 1 og figur S2). Mange af disse antistoffer nået næsten fuldstændig ( 95%) mærkning af tumorceller. Som forventet, proteiner relateret til større histokompatibilitetskompleks klasse I (β2-mikroglobulin, HLA-A /A2 /B /C og MIC-A /B), der almindeligvis udtrykkes på kerneholdige humane celler blev identificeret. Andre TAA’er blev kategoriseret ifølge kendte funktion, der konstateres flere proteiner involveret i ekstracellulær matrix interaktion og cellulær adhæsion, såsom flere integrin familiemedlemmer til i overensstemmelse med deres epitelial biologi. Da a- og p integriner danner multimere transmembrane komplekser med hinanden, er det muligt, at co-ekspression af integrin α2 (CD49b) og integrin α6 (CD49f) sammen med integrin β4 (CD104) kan indikere funktionel interaktion af disse familiemedlemmer eller delt regulering i tyktarmskræft. Vi identificerede også flere proteiner med kendt funktion i cellulær metabolisme og signaler samt andre medierer interaktion med adaptive og medfødte immunsystem. Disse fælles identifikatorer kunne informere om tumor biologi eller repræsentere druggable veje til at målrette tumorceller. Som følge af deres brede udtryk på overfladen af ​​maligne celler, kan de pan-tumorantigener identificeret i denne skærm være nyttige markører for at lette identifikationen af ​​CTCs /dobbeltbeskatningsoverenskomster.

Bioinformatik analyse

for at prioritere vores liste over TAA’er som kandidat biomarkører, vi udførte tværgående sammenligninger til Oncomine samling af genekspression microarray datasæt fra tyktarmskræft samt tilsvarende normale væv [10]. Som sådan kunne vi vurdere ekspressionen af ​​de proteiner, der er identificeret i vores skærm i forhold til RNA-profiler på tværs af flere efterforskere, patientgrupper, og eksperimentelle platforme. Vi fokuserede vores undersøgelse af TAA-ekspression i normalt colonvæv, normal lever, samt colonadenom og adenocarcinom [11] – [14]. Vi derefter udvalgt de gener, der var mindst to gange opreguleret (p 0,05) i løbet af normalt væv. Denne yderligere forfinet vores TAA liste til de overudtrykte gener CD44, integrin α6 (CD49f), og integrin β2 (CD49b) som de mest lovende kandidater (figur 2). Især er ekspressionen af ​​disse gener var signifikant højere i kræft end i normal lever, hvilket tyder på en mulig terapeutisk vindue for målrettede behandlinger til overs normalt væv.

Oncomine Heatmap analyse i 4 offentliggjorte datasæt til ekspression af tumorantigener beskrevet i tabel 1. Kun de gener, der var konsekvent opreguleres tværs datasæt med p 0,05 vises. Tallene i parentes angiver antallet af analyserede prøver. Forkortelser: normal colon, NC; colon ascendens, AC; colon descendens, DC; sigmoid colon, SC; tværgående tyktarm, TC (n = 1).

Tumor markør validering

For at validere resultaterne fra vores antistof skærmen for at opdage tumorceller i patientprøver vi udførte immunhistokemi (IHC) og immunofluorescens (IFC) farvning på arkiverede humane prøver fra normal colon mucosa og primær tyktarmskræft samt metastaser fra lever og lymfeknuder (n = 6 for hver). Vi valgte integrin α6 (CD49f) på grundlag af sin stærke reaktivitet ( 99%) med alle tre tyktarmskræft cellelinjer i vores skærm, kendt udtryk i tarmen, og opregulering i tumorigenese [15]. Faktisk ved IHC, kunne vi påvise integrin α6 farvning i coloncancer såvel som i tilstødende uengagerede normal slimhinde. Desuden viste alle lever og lymfeknudemetastaser integrin α6 farvning, mens det omgivende stroma var negativ. Forskellen i farvningsintensitet mellem primær tumor og normal var subtile, men mere udtalt i metastatiske prøver (figur 3). Disse tendenser blev også set af IFC (fig S3) ved anvendelse af en særskilt integrin α6 antistof, hvor co-mærkning celler med epitelial markør EpCAM som reference [16] viste, at integrin α6 lokaliseret til alle kolonepitelceller i hver analyseret prøve (fig S3 ). Disse resultater forstærker anvendeligheden af ​​vores screeningsmetode til identifikation TAA’er, der kunne bruges til at detektere tumorceller i patientprøver og /eller terapeutisk målretning

A) H 70% sammenflydende. Frigørelse af celler fra vævskulturplader blev udført under anvendelse TrypLE (Gibco) ifølge fabrikantens protokol (10 minutter ved 37 ° C). Den Papain dissociation kit blev fremskaffet fra Worthington Biochemical. Cellernes levedygtighed blev kontrolleret under anvendelse af trypanblå eksklusion og viste sig at være 98%. Alle celler blev dyrket og behandlet parallelt.

High throughput flowcytometrianalyse

High hele flowcytometri analyse blev udført på de tre cellelinier beskrevet ovenfor under anvendelse af et antistof screeningsmetode udviklet af BD Biosciences [ ,,,0],27]. Antistofscreening blev udført under anvendelse af BD Lyoplate human celleoverflademarkør screening panel (560.747) indeholdende frysetørrede antistoffer i en 96-brønds pladeformat ved 0,5 ug /brønd. For flowcytometrianalyse blev cellesuspensionerne behandlet med DNAse (i 1 ml PBS med Ca

+, Mg2

2+, 100 enheder /ml, 10 pi DNAse stock) i 15 minutter ved stuetemperatur. Før antistof farvning blev cellelinjer Barcoded med forskellige levedygtighed farvestoffer til samtidig analyse [28]. SW480-celler blev mærket med Horizon Violet Proliferation Dye 450 (BD Biosciences 562.158) ifølge fabrikantens protokol ved 1 uM. HCT116 blev mærket med CFSE (Invitrogen, C34554) ifølge fabrikantens protokol ved 1 uM. SW620 blev efterladt umærket og registreret på grundlag af at være VPD450 og CFSE negativ. Effektivitet af mærkning var 99%. Efter passende vask blev alle tre cellelinier blandes og resuspenderet i BD Pharmingen Stain Buffer (BD Biosciences) med tilsætning af 5 mM EDTA for at forhindre reaggregering. Celler blev udpladet i 96-brønds rundbundede plader (BD Biosciences) ved 30.000 celler (10.000 for hver cellelinie) per brønd for farvning. Celleoverfladefarvning blev udført med antistoffer rekonstitueret med 1 × PBS i en koncentration på 0,5 ug per test, og celler blev farvet direkte på is i 20 minutter. Celler blev vasket tre gange med farvning puffer og derefter farvet med artsspecifik Alexa647 sekundære antistoffer (BD Biosciences) i 20 minutter på is. Celler blev vasket tre gange mere i farvning puffer, derefter resuspenderet i farvning buffer med 7AAD (BD Biosciences) for levende celler bestemmelse. Celler blev analyseret på et FACS Canto-system (BD Biosciences) udstyret med et højt gennemløb Sampler (med plade loader) og data blev kompileret med med FlowJo software og en Microsoft Excel 2007 skabelon fra BD Biosciences (https://www.bdbiosciences.com /support/resources/stemcell/index.jsp#stemtools) til generering af varme maps.

Immunhistokemi

væv til IHC og IFC blev opnået gennem et dedikeret team væv indkøb i Institut for Anatomic Patologi på Cleveland Clinic. Prøver til IHC blev fikseret i 4% phosphat-pufret formalin og indlejret i paraffinvoks til sektionering. IHC farvning blev udført på en Ventana Benchmark XT automatiseret immunostainer udnytte en Ventana Optiview DAB IHC Detection Kit med CC2 antigen hentning. Primært antistof, polyklonale kanin anti-ITGA6, (Sigma-Aldrich, HPA012696) blev fortyndet 1:10.

Immunofluorescens

Frisk høstede tumor eller normalt væv var snap frosne og krænges ved -80 ° C. En gastrointestinal patolog bekræftede histopatologisk diagnose af hver prøve uafhængigt af hinanden. Normalt væv blev opnået fra et distalt sted fra den primære colon tumor. Frisk frosset væv blev snittet ved en 6 um tykkelse. Objektglas blev fikseret med 4% paraformaldehyd, lufttørret og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Efter behandling med 10% normalt gedeserum og 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i 45 minutter blev objektglassene inkuberet med monoklonalt affinitetsoprenset muse-anti-human EpCAM (ab20160, Abcam) ved en slutfortynding på 1:200 og monoklonalt affinitetsrenset rotte-anti-humant integrin α6 (MAB1378, Milipore) ved en slutfortynding på 1:100 natten over ved 4 ° C, vasket tre gange med PBS efterfulgt af inkubering i 1 time ved stuetemperatur med gede-anti-muse lgG1 AlexaFluor 568 (1:1000 fortynding) og gede anti-rotte AlexaFluor 488 (1:1000 fortynding), begge fra Invitrogen. Objektglas blev vasket tre gange med PBS og modfarvet med nuklear farvning Hoechst 33342 (1:10000) i 2 minutter. Efter vask med PBS blev objektglassene monteret med FluorSave (Calbiochem).

Western blotting

Celler blev lyseret i 50 mM Tris pH 8,0, 120 mN NaCI, 0,5% NP-40, protease inhibitorer (Sigma-Aldrich) og phosphataseinhibitorer (Sigma-Aldrich). Lige store mængder cellelysat blev påsat og opløst på en 4-12% Bis-Tris gradientgel (Life Technologies) og overført til en PVDF-membran (Millipore). Membranen blev samtidigt probet natten over ved 4 ° C for anti-CD10 (mus, 1:500, Abcam), og anti-β-actin (mus, 1:8000, Sigma). Goat anti-mus sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase blev påvist ved hjælp af forbedret chemilluminescent substrat (1:3000, Santa Cruz).

Stamcelle markør analyse

Ekstra antistoffer for flerfarvede flowcytometri CD44 -PE (Miltenyi, 1:1000), EpCAM-FITC (BD Biosciences klon EBA-1, 1:1000), og CD133-APC (Miltenyi AC133, 1:1000). Celler blev fremstillet som beskrevet ovenfor. FITC-konjugeret isotypekontroller (Santa Cruz) blev anvendt separat for hvert antistof til at bestemme basislinie-farvning og kompensation blev udført ifølge standardteknikker. For multi-farve-analyse blev et enkelt cellelinje mærket med alle tre antistoffer i et enkelt rør, vasket og sat på en FACS Aria II flowcytometer (BD Biosciences). Gatings og parceller blev bygget ved hjælp FlowJo softwarepakke.

Oncomine analyse

Bioinformatik analyser blev udført ved hjælp af den Oncomine database (www.oncomine.org). Gener af interesse blev evalueret baseret på en p-værdi cutoff på 0,05 og ingen ekspressionsniveauet filter blev brugt.

Diskussion

Forbedring resultater for kræftpatienter vil sandsynligvis stole på nye modaliteter afsløring og behandlingsmuligheder for primær og metastatisk sygdom. Her anvendte vi en hidtil ukendt højt gennemløb anvendes et barcoded antistof-array til at definere overfladen antigen profiler af colon cancer cellelinjer afledt af den primære og metastatisk tumorvæv. Vi identificerede en række fælles og differentielt udtrykte overfladeantigener, herunder erfaringer og tabt i overgangen til fremskreden sygdom (tabel 1, 2 og 3). Robustheden af ​​systemet beskrevet heri arme undersøgere med evnen til at screene global proteinekspression tværs sygdomstilstande og /eller reaktion af celler til bestemte stimuli. Blandt anvendelser af denne fremgangsmåde, overflade TAA’er kunne udnyttes til sygdom sporing og terapi. Nogle TAA’er, såsom EpCAM, allerede har indtastet den kliniske verden med evnen til at overvåge sygdomsbyrde. Yderligere TAA’er bør gøre det muligt at tilføje specificitet og pålidelighed i at opdage tumorceller enten in situ, i omløb, eller som formidles celler. Målretning af TAA’er med monoklonale antistoffer kan også give muligheder for at opnå tumor hæmning som det allerede er påvist i praksis med cetuximab (Erbitux, mod EGFR), rituximab (Rituxan, rettet mod CD20), og tositumomab (målrettet CD20). HER2-positiv fremskreden beast cancer kan inhiberes af trastuzumab emtansine (anti-HER2-antistof koblet med en mikrotubulus-inhibitor) [29]. Desuden radioimmunterapi, sådan ibritumomab tiuxetan (målretning CD20), anvender monoklonale antistoffer til at levere strålingsdoser direkte til tumorvæv.

Sammenligning af vores kandidat markører identificeret på proteinniveauet via flowcytometri mod RNA-baserede genekspression microarray databaser på tyktarmskræft (Oncomine) hjulpet i vores prioritering. Men iboende biologiske afbryder mellem RNA-transkripter og udstyret polypeptider advare mod at bruge dette filter som et ultimativt afgørende for udvælgelse af TAA’er [5]. Snarere, vi går ind for validering af oplysende indhold af TAA’er på grundlag af yderligere protein-niveau analyser på tværs af et større antal patientprøver (fx immunhistokemi på væv microarrays). Vi valideret integrin α6 i patientens biopsier som kandidat tumor biomarkør aflivet fra vores panel af antistoffer. Yderligere arbejde vil være nødvendigt at tage den kliniske anvendelighed for integrin α6 og andre identificerede overfladeantigener i tumor celle detektion og terapi design.

Vores resultater profilering menneskelig tyktarmskræft cellelinjer uddybe dem af Zhou et al. der også anvendes en multiplex antistof array [30] – [32]. Deres undersøgelse udnyttet en slide-baserede trykt antistof array (DotScan ™) med dækning af 122 celleoverflademarkører. Vi fandt konsekvente signaler med de fleste, men ikke alle, af deres antistoffer, der reagerer med SW480 og SW620-cellelinier, som kan tilskrives prøveforberedelse eller analyseteknik. I modsætning til DotScan antistof array, antistoffet arrayet anvendt her prober næsten dobbelt så mange antigener ved anvendelse af standard flowcytometri teknikker til rådighed i de fleste forskningsfaciliteter uden behov for yderligere udstyr eller software (dvs. DotReader). Den barcoding af cellelinier kan yderligere opskaleres ved anvendelse af 10 gange fortyndinger af intracellulære farvestoffer og /eller dobbelt-mærkede celler [28]. Svarende til DotScan fremgangsmåde er imidlertid vores antistof array kan også multiplekses til analyse primær tumor prøver indeholdende multiple underpopulationer, der kan genkendes af fluorescens konjugerede antistoffer (f.eks epiteliale tumorceller med CEA-FITC og hæmatopoietiske celler med CD45-APC), mens antistoffer i array er mærket med Alexa647. Alternativt kan tumor subpopulationer skelnes på grundlag af fysiske (for eksempel side population) eller funktionel (for eksempel stamcelle assay) egenskaber ved mærkning af disse celler på bekostning af mindst én fluorescerende kanal anden måde anvendes til stregkodning. For eksempel Aldefluor assayet er mulig ved at mærke ALDH1-udtrykkende stamceller i den grønne kanal, mens ofrer CFSE stregkodesystem.

Flere faktorer påvirker overfladen profil af kræftceller. Blandt disse omfatter vækstfase celler, kulturmedier, kulturskål substrat, og typen af ​​enzymatisk løsrivelse /dissociation, som kan spalte epitoper. For eksempel behandling af HCT116 tyktarmskræft celler med papain (enzym bruges til dissociation af nogle solide tumorer) reducerede påvisning af CD44 fra 93,4% til 0,5% af celler, mens EpCAM og CD133 (AC133) ikke var signifikant påvirket (Figur S7) . Derfor bør der udvises forsigtighed, når designe eksperimenter og fortolkning af data fra antistof-baserede skærme. Derudover kan vores 5% celle positivitet cut-off udelader sjældne, men biologisk relevant cellepopulationer og TAA biomarkører.

Den kombinerede stregkoder og antistof arrays ansat i den aktuelle undersøgelse kunne udvides til hurtigt profil yderligere tumorceller fra kolon og andre vævstyper. Evnen til at multiplekse reaktioner reducerer eksperimentel variabilitet antistof forbruget med 10- til 100-fold, og tid til at fuldføre et assay. Desuden kan denne fremgangsmåde tilpasses til samtidig profilering af patient-afledt normal, primær og /eller metastaserende prøver i en enkelt assay på en brøkdel af den tid og de udgifter. Endelig binding af kendte epitoper anvendelse af kommercielt tilgængelige antistoffer fremskynder translationelle undersøgelser med henblik på at udvikle forbedrede kliniske ressourcer.

Støtte oplysninger

figur S1.

Komplette antistof array-resultater. Fuldstændige resultater fra barcoded antistof matrix screening af SW480, SW620, og HCT116 CRC cellelinier. Positionen af ​​hvert antistof på pladen er indikeret fra rækker A-H og kolonner 1-12. For at generere en Heatmap af ekspressionen af ​​antigener blev individuelle celler farvet på basis af deres ekspression værdi fra 0 (sort) til 100 (rød). Bemærk, at rotte CD326 /EpCAM i brønd F10 kun er godkendt til mus reaktivitet af producenten og er en anden antistof end det, der anvendes i vores immunofluorescens og flerfarvede flowcytometri

doi:. 10,1371 /journal.pone.0053015. S001

(DOCX)

figur S2.

Histogram plots fra antigener i tabel 1. Antigener udtrykt i 50% af alle celler i alle tre cellelinjer. Plot i rød er tilsvarende isotypekontrol.