PLoS ONE: RABEX-5 opreguleres og Afspiller et onkogent rolle i Gastric Cancer Udvikling ved Aktivering af VEGF Signaling Pathway

Abstrakt

RABEX-5, en guanin-nukleotid udveksling faktor (GEF) for RAB-5 , er impliceret i tumorigenese og i udviklingen af ​​visse humane cancere. Her rapporterer vi, at RABEX-5 fremmer tumorvækst og metastatiske evne af gastriske cancerceller både

in vitro

in vivo

. Ekspression af RABEX-5 er betydeligt højere i gastrisk cancer væv og er forbundet med tumorstørrelse og lymfeknudemetastase. Desuden målrettet lyddæmpning af RABEX-5 reducerede mavekræft celledeling og kolonidannelse

in vitro

via induktion af en G0 /G1 fasen anholdelse, og stimuleret mavekræft celle apoptose. Knockdown af RABEX-5 også hæmmede sårheling, migration og de invasive evner gastriske kræftceller. Resultaterne af

in vivo

dyreforsøg var også i overensstemmelse med disse

in vitro

resultater. Inaktivering af RABEX-5 førte til nedsat ekspression af VEGF. Disse resultater indikerer, at RABEX-5 opreguleres og spiller en oncogen rolle i gastrisk cancerudvikling ved at aktivere VEGF-signalvejen

Henvisning:. Wang S, Lu A, Chen X, Wei L, Ding J (2014) RABEX-5 opreguleres og Afspiller et onkogent rolle i Gastric Cancer Udvikling ved Aktivering af VEGF signalvejen. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10,1371 /journal.pone.0113891

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 3. september 2014 Accepteret 31. oktober, 2014, Udgivet: 26 November, 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

på trods af et fald i den globale forekomst i visse regioner i verden, mavekræft stadig den fjerde højeste i incidens og sekunder i dødeligheden blandt alle kræftformer på verdensplan [1]. Undersøgelser viser, at miljømæssige faktorer, såsom

Helicobacter pylori

infektion, cigaretrygning og kost, kan spille en vigtig rolle i gastrisk udvikling af kræft [2]. Tidlige fase mavekræft er normalt asymptomatisk eller associeret med uspecifikke symptomer, såsom dyspepsi, og med den tid symptomer opstår, er det ofte nået et fremskredent stadium. På trods af den fælles brug af multimodal terapi (kemoterapi, strålebehandling og kirurgi), 5-års overlevelse for patienter er fortsat lav, 20-40% [3]. Selv om forskning i mavekræft har gjort store fremskridt, forbliver de molekylære mekanismer der ligger til grund for udviklingen af ​​mavekræft ufuldstændigt forstået.

exocytose og endocytose er centrale processer, der anvendes af celler til at opretholde normale fysiologiske funktion, og vesikel transport er et centralt en del af denne proces. Små GTPaser spiller en switch funktion i intracellulære molekyler og en meget vigtig rolle i endocytose og vesikel transport, herunder reguleringen af ​​cellevækst, signaltransduktion, differentiering og aktincytoskelettet bygning og mange aspekter af de andre cellulære processer [4]. I Ras-superfamilien, der er mere end 50 typer GTPaser, herunder Rab, som hører til de største underfamilien [5]. Undersøgelser har vist, at flertallet af Rab proteiner reguleret i målretning transport, fagocytose, og vesikel docking til specifikke membraner, mens et lille antal Rab proteiner regulerer vesikel spirende [6], [7]. Den lille GTPase RAB-5, som distribueres i plasmamembranen og tidlige endosomer, er en mester regulator af tidlig endocytisk handel [8]. Ligesom andre små GTPaser, er RAB-5 aktiveres af en udveksling af bundet BNP med GTP, katalyseret af en familie af guanin-nukleotid exchange faktorer [9]. RABEX-5 blev identificeret som en interaktør af Rabaptin-5 og besidder GEF aktivitet over RAB-5 og beslægtede GTPaser. Ligeledes både RABEX-5 og Rabaptin-5 er nødvendige for RAB-5-drevet endosom fusion

in vitro

[10].

Nylige undersøgelser har indikeret, at RABEX-5-ekspression er betydeligt højere i flere cancerformer, såsom brystcancer [11], prostatacancer [12] og kolorektal cancer [13]. Unormal RABEX-5-ekspression i tumorer tyder på, at RABEX-5 er betydelig i kræft patogenese og progression, og kan påvirke tumor biologisk adfærd. Men den rolle og virkningsmekanismen for RABEX-5 i mavekræft carcinogenese og progression er endnu ikke fastlagt,. I denne undersøgelse har vi først analyseret ekspression af RABEX-5 i gastrisk cancer væv ved brug af kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) og immunohistokemi. Efterfølgende undersøgte vi effekten af ​​RABEX-5 på tumor biologisk funktion

in vitro

in vivo

. Vores resultater viser, at RABEX-5 er overudtrykt og spiller en onkogen rolle i mavekræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg, der er beskrevet i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Taishan Medical University, og alle dyr blev opretholdt i overensstemmelse med IACUC retningslinjer. Indsamling og anvendelse af menneskelige prøver blev godkendt af Institutional Review Board of Taishan Medical University og tilknyttet Taian Central Hospital Medical Center, efter informeret skriftligt samtykke fra alle patienter.

Patienter og vævsprøver

i alt 110 sæt af gastriske tumorer og tilstødende, ikke-tumorvæv (mindst 5 cm fra tumoren margin) blev opnået fra patienter, som gennemgik helbredende kirurgi på Taian Centralsygehus mellem januar 2010 og december 2013. Disse omfattede 27 kvinder og 83 mænd med en gennemsnitsalder på 59,3 år (interval: 32-80 år). Ingen patienter havde fået strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. Klinisk-patologisk data blev indsamlet og patologisk tumor iscenesættelse blev bestemt ifølge amerikanske Blandede Cancer (AJCC) mavekræft TNM. Histologisk typning blev udført af mindst to sagkyndige patologer, arbejde selvstændigt i en dobbelt-blindet mode. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Boards of Taishan Medical University og tilknyttet Taian Central Hospital Medical Center. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient forud for optagelse i undersøgelsen.

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Humane gastriske kræft cellelinjer og den udødeliggjort gastriske, slimhinde epitelial cellelinje, GES-1 , blev købt fra Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences. Cellelinier blev rutinemæssigt opretholdt i RPMI-1640 medium indeholdende 10% kalveserum, penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 IU /ml) i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C.

Total RNA-isolering og QRT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra vævsprøver eller cellelinjer under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, USA), ifølge producentens anvisninger. Revers transkription blev udført under anvendelse af 1 ug af total RNA i overensstemmelse med producentens anvisninger (Promega, Madison, WI, USA). PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green reagens (Applied Biosystems, CA, USA) og de følgende PCR-primere;

RABEX-5 Hotel (frem) 5′-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 ‘og (tilbage) 5′-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3’;

VEGF

(frem) 5′-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ‘og (tilbage) 5′-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3’ og

GAPDH

(frem) 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ‘og (tilbage) 5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ‘. PCR reaktioner blev udført med en indledende denaturering ved 95 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min.

GAPDH

blev anvendt som en intern kontrol, og alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer. Den relative ekspression forhold mellem

RABEX-5

i hvert parret tumor til vævsprøve ikke-tumor blev beregnet ved anvendelse af 2

-ΔΔCt metode.

Immunhistokemi

Paraffin -embedded vævssnit fra patienter eller nøgne mus blev varmebehandlet ved 60 ° C i 1 time, afvoksede i xylen, re-hydreret i en ethanol-serien (100-50%) og behandlet i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0 ) for antigen hentning. Endogen peroxidaseaktivitet blev inhiberet efter inkubation med methanol indeholdende 0,3% H

2O

2 i 30 min. Snit blev derefter inkuberet med antistoffer detektering RABEX-5 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, USA) eller VEGF (1:150; Ab46154, Abcam, USA) ved 4 ° C natten over. Den følgende eksperimentelle procedure blev inkuberet med det sekundære antistof. Vævssnit blev modfarvet med Mayers hematoxylin. Slides blev uafhængigt evalueret af to patologer, blindede eventuelle patientdata. Farvningsintensiteten for RABEX-5 blev scoret som 0 (ingen farvning), 1 (mild farvning), 2 (moderat farvning) eller 3 (intens farvning). Farvning område blev scoret som 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) eller 4 (76-100%), på grundlag af den procentdel af positivt farvede celler. Det endelige farvning score, beregnet som summen af ​​intensitet og udvidelse scoringer, blev inddelt i tre grupper som følger: 0-2, negativ udtryk; 3-4, svag udtryk; og 5-6, stærkt udtryk.

Målrettet lyddæmpning af RABEX-5

RABEX-5 lentiviral interferens vektor blev købt fra Shanghai GenePharma Co., Ltd. Sekvensen af ​​det RABEX-5 interferens målretning oligo var 5′-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ‘, mens den ikke-homologe kontrolsekvens var 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’. SGC-7901 og NCI-N87-celler blev udpladet i 6-brønds plader (5 x 10

4 celler /brønd), dyrket til 40% konfluens og behandlet med titreret viral supernatant ved en infektionsmultiplicitet (moi) på 10.

Western blot-analyse

helcelleproteiner blev ekstraheret fra celler under anvendelse RIPA buffer indeholdende proteaseinhibitoren Cocktail (Pierce, Rockford, IL, USA). Protein blev kvantificeret ved anvendelse af et BCA Protein Assay Kit (Pierce). Celleekstrakter (100 ug) blev separeret ved 10% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinyliden fluorid membraner. Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (TBS) og inkuberes med primære antistoffer ved 4 ° C natten over. De primære anvendte antistoffer var kanin-anti-RABEX-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) og muse-anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). Membraner blev derefter vasket tre gange i TBS-Tween-opløsning i 15 min og inkuberet med sekundære antistoffer. Signaler blev detekteret ved anvendelse af et forøget kemiluminescens påvisningssystem (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) i overensstemmelse med producentens protokol.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev målt ved anvendelse af et Cell Counting Kit -8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). SGC-7901 eller NCI-N87-celler blev podet i plader med 96 brønde (1,5 x 10

3 celler /brønd) og inkuberet i forskellige tidspunkter (24, 48, 72, 96 og 120 h). Vækstmediet blev derefter fjernet og erstattet med 200 pi RPMI-1640 medium indeholdende 10% FBS og 20 pi CCK-8, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer. Absorbans blev målt ved 450 nm under anvendelse af en Safire2 mikropladelæser. RPMI-1640 medium indeholdende 10% FBS og CCK-8 blev anvendt som en kontrol.

Kolonidannelse assay

Celler blev podet i 6-brønds plader (1 × 10

3 celler /brønd) og dyrkningsmediet blev udskiftet hver 3-4 dage. Efter 14 dages dyrkning blev cellekolonier fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, farvet med 0,1% krystalviolet i 20 minutter, og fotograferet. Kolonier med mere end 50 celler blev talt i hver streg.

Analyse af cellecyklus og apoptose

SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD celler og kontrol celler blev indsamlet og cellecyklus og apoptose blev vurderet med flowcytometri. For cellecyklusanalyse blev celler fikseret med 75% ethanol og opbevaret ved 4 ° C natten over. Den følgende dag blev fikserede celler vasket med PBS, behandlet med RNase A (50 ug /ml) og farvet med propidiumiodid (PI) (50 ug /ml) i 30 minutter i mørke. De farvede celler blev analyseret ved flowcytometri (FACSCalibur, Becton-Dickinson).

I apoptose analyse, en Annexin V-APC Apoptose Detektion Kit I (BD Pharmingen, USA) blev anvendt ifølge producentens anvisninger. PI og Annexin V-APC dobbelt farvning blev udført, og cellerne blev analyseret ved flowcytometri (FACSCalibur, Becton-Dickinson) under anvendelse af Cell Quest-software (Becton-Dickinson). Annexin V-APC-positive og PI-negative celler blev defineret som undergår apoptose. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og gennemsnitsværdierne for disse grupper blev beregnet.

Transwell migration og invasion assay

For migration analyser, 1 × 10

5 celler blev suspenderet i serum- frit RPMI-1640 medium og udpladet på kamre, som ikke blev overtrukket med Matrigel (Corning Costar, NY, USA). For invasionen assayet blev det øvre kammer forud belagt med Matrigel (BD Bioscience, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokoller, og 1 x 10

5 celler i serum-frit RPMI-1640 medium blev tilsat til kammeret. For begge assays blev medium indeholdende 10% FBS tilsat til det nederste kammer som en kemoattraktant. Efter 24 timer dyrkning blev kamre farvet med 0,5% krystalviolet opløsning i 15 minutter, og nedsænket i phosphatbufret saltvand (PBS) i 10 minutter. Celler i det nedre kammer blev efterfølgende talt under et omvendt mikroskop. Værdier er udtrykt som middelværdi celle numre i fem tilfældige synsfelter (200 ×).

sårheling assay

Celler blev udsået i 6-brønds plader og dyrket indtil de nåede sammenløb. Sårene blev ridset på monolaget af celler under anvendelse af 20-pi pipettespidser. Plader blev vasket en gang med frisk medium for at fjerne ikke-adhærerende celler efter dyrkning af celler i 0 eller 48 timer (medium uden kalveserum) og fotograferet.

xenograftmodel

Fire-uge- gamle BALB /C nøgne mus blev købt fra Institut for Zoologi, kinesiske Academy of Sciences i Shanghai. Dyrene blev anbragt i bure med flis strøelse i en temperaturreguleret rum (68-72 ° F) med en 12-timers lys-mørke-cyklus og 45-55% relativ fugtighed, og blev tilladt fri adgang til diæt og drikkevand. Kort fortalt SGC-7901 /KD eller SGC-7901 /NC-celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i PBS (pH 7,4) til injektion i en mus, i et samlet volumen på 100 ul. Cellesuspensionen (1 × 10

6 celler) blev injiceret i den højre flanke af mus. Tumorstørrelse blev målt udvendigt hver 3 dage under anvendelse af en skydelære, og tumorvolumen blev estimeret ved anvendelse af ligningen: længde (mm) x bredde

2 (mm) x 0,52. For at forbedre enhver lidelse af mus observeret under disse eksperimentelle undersøgelser blev mus aflivet ved CO

2 inhalation på den 28. dag efter intraperitoneal injektion, og tumorer blev vejet efter dissektion. Prøver blev opbevaret i flydende nitrogen i QRT-PCR eller fikseret i 4% formalin til opnåelse paraffinindlejrede sektioner. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med de Animal retningslinjer Pleje og godkendt af den Taishan Medical University Animal Care udvalg.

Statistisk analyse

Data er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Statistiske forskelle mellem de to grupper blev undersøgt af Students

t

-test. Korrelationer mellem RABEX-5-ekspression i gastrisk cancer væv og klinisk-patologiske parametre blev analyseret ved chi-square eller Fishers eksakte test.

P

0,05 blev betragtet som signifikant, og

P

0,01 blev betragtet yderst signifikant

Resultater

RABEX-5-ekspression er opreguleret i. mavekræft væv

udtryk for

RABEX-5

blev undersøgt i mavekræft og tilstødende ikke-tumorvæv ved QRT-PCR. Vi observerede signifikant højere udtryk for

RABEX-5

mRNA i mavekræft væv sammenlignet med tilsvarende ikke-tumorvæv (

P

. 0,01, figur 1A). Disse resultater blev bekræftet på proteinniveau ved immunohistokemisk farvning (Fig. 1B, C, D, E). RABEX-5-ekspression blev overvejende lokaliseret i cytoplasmaet af cancerceller. RABEX-5 blev opreguleret i 61,8% (68/110) af gastrisk kræftpatienter. Derefter undersøgte vi forholdet mellem RABEX-5-ekspression og clinicopathologic træk ved gastrisk cancer. Opregulering af RABEX-5 var forbundet med tumorstørrelse (

P

= 0,035) og lymfeknude metastaser (

P

= 0,006), men ikke med andre klinisk-patologiske faktorer, herunder køn, alder eller tumor placering (tabel 1).

(A)

RABEX-5 fotos mRNA-ekspression i gastrisk cancer væv og parrede tilstødende ikke-tumorvæv blev undersøgt ved kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (QRT-PCR ) og normaliseret til

GAPDH

. Søjler repræsenterer midlerne til

RABEX-5 fotos relative ekspression i væv og andre ikke-tumorvæv hhv. (B-E) Karakterisering af RABEX-5-protein-ekspression i humane gastriske cancervæv og parrede hosliggende ikke-tumorvæv ved immunhistokemisk farvning. (B) Stærk positiv RABEX-5-ekspression i gastrisk cancer. (C) svagt positive RABEX-5-ekspression i gastrisk cancer. (D) Negativ RABEX-5-ekspression i gastrisk cancer. (E) Negativ RABEX-5-ekspression i ikke-tumor maveslimhinden.

nedregulering af RABEX-5 hæmmer mavekræft celledeling og kolonidannelse

Vi næste undersøgt ekspression af RABEX-5 i gastriske cellelinjer og den ikke-cancercellelinie, GES-1, ved western blot-analyse. RABEX-5 blev udtrykt i alle testede cellelinier, og var især høj i SGC-7901 og NCI-N87-celler (Fig. 2A). At udforske funktioner RABEX-5 i gastrisk cancer cellelinjer, udføres vi målrettet knockdown af RABEX-5 i de høje udtrykker cellelinjer, SGC-7901 og NCI-N87. RABEX-5-ekspression signifikant reduceret i SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD celler sammenlignet med kontrol celler (Fig. 2B). Først undersøgte vi effekten af ​​tab af RABEX-5 på væksten af ​​gastriske cancerceller. Efter 5 dages kultur, væksten i SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD-celler var signifikant langsommere end kontrolgrupperne (fig. 2C). Vi bekræftede også disse observationer i kolonidannelse assays. Koloni tal blev væsentligt reduceret i SGC-7901 /KD-celler og NCI-N87 /KD-celler i forhold til kontrol-celler (fig. 2D), og vi observeret, at koloni størrelse var også mindre i forsøgsgrupper sammenlignet med kontroller. Disse data antyder, at nedregulering af RABEX-5 undertrykker mavekræft celleproliferation.

(A) Western blot-analyse af RABEX-5-protein-ekspression i syv gastriske cancercellelinier og GES-1. (B) RABEX-5 proteinniveauer i SGC-7901 /KD, SGC-7901 /NC, NCI-N87 /KD og NCI-N87 /NC-celler blev analyseret ved western blot. (C) CCK-8 celleproliferation assay for SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD og kontrolgrupper. Kurver tyder på en betydelig grad af spredning i forhold til kontroller (

P

0,05). (D) Repræsentative billeder og kvantificering af kolonidannelse assays i hver cellelinje. *

P

0,05; **

P

. 0,01

nedregulering af RABEX-5 fremmer apoptose af gastrisk kræftceller og inducerer G0 /G1 cellecyklusstop

De observerede effekter af RABEX-5 knockdown på cellulær vækst kan skyldes ændringer i cellecyklusprogression og apoptose. Vi undersøgte derfor effekten af ​​RABEX-5 lyddæmpning på cellecyklus og apoptose

in vitro

, anvendelse af flowcytometri. Flowcytometrisk analyse viste, at andelen af ​​celler i G0 /G1-fasen i SGC-7901 /KD eller NCI-N87 /KD-celler var højere end i SGC-7901 /NC eller NCI-N87 /NC kontrolgrupper, mens procentdelen af celler i G2 /M-fasen blev signifikant reduceret sammenlignet med kontroller (fig. 3A, B). Vi har også observeret signifikante virkninger på apoptose i de forskelligt behandlede grupper (fig. 3C, D), med nedregulering af RABEX-5-ekspression, der fører til en stigning i gastrisk cancercellelinie apoptose.

(A) Andelen af ​​celler i forskellige faser i cellecyklus. (B) Repræsentative histogrammer skildrer cellecyklus profiler af SGC-7901 /KD, SGC-7901 /NC, NCI-N87 /KD og NCI-N87 /NC celler. (C) Celler farves positive for Annexin V-APC og negativ for propidiumiodid (PI) blev anset for at have undergået apoptose. (D) Repræsentative histogrammer afbilder apoptose af hver gruppe af gastriske cancerceller. *

P

0,05; **

P

. 0,01

nedregulering af RABEX-5 hæmmer migration, invasion og sårhelende evne gastriske cancerceller

For at undersøge indflydelsen af RABEX-5 om migration og invasion, vi næste udført Transwell migration og invasion assays. Nedregulering af RABEX-5 undertrykt celle migration (SGC-7901 /KD-gruppen, 121,3 ± 6,1 celler /område; SGC-7901 /NC-gruppen, 261,0 ± 10,5 celler /område; NCI-N87 /KD-gruppen, 108,7 ± 6,1 celler /felt ; NCI-N87 /NC-gruppen, 241,7 ± 10,6 celler /område;

P

. 0,05) (fig 4A, C). Lignende resultater blev observeret i Transwell invasion assays (SGC-7901 /KD-gruppen, 76,3 ± 6,1 celler /område; SGC-7901 /NC-gruppen, 108,7 ± 6,0 celler /område; NCI-N87 /KD-gruppen, 60,7 ± 6,0 celler /felt ; NCI-N87 /NC-gruppen, 119,0 ± 8,5 celler /område;

P

. . 0,05) (figur 4B, D)

(A, B) Transwell analyser. Fotografier, der viser celler efter migration gennem mikropore membraner med eller uden Matrigel. (C, D) Histogrammer der viser antallet af trækkende og invaderende celler. (E) sårheling assay med gastriske cancerceller. Billeder blev taget 0 og 48 timer efter at ridse celleoverfladen. Et repræsentativt billede fra tre uafhængige forsøg er vist. (F)

VEGF

mRNA-ekspression blev vurderet ved QRT-PCR. (G) VEGF proteinekspression blev evalueret ved Western blot. *

P

0,05; **

P

. 0,01

For at undersøge effekten af ​​RABEX-5 på motilitet og sårheling, vi også udført sårhelende analyser. Vi observerede, at afstanden mellem oprullede kanter af SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD-celler var markant længere end dem af SGC-7901 /NC eller NCI-N87 /NC-celler (fig. 4E). I overensstemmelse med disse observationer blev niveauer af VEGF nedreguleres på både mRNA og protein niveauer i SGC-7901 /KD-celler (fig. 4F, G).

Silencing af RABEX-5 hæmmer mavekræft vækst

in vivo

på baggrund af

in vitro

resultater beskrevet ovenfor, vi næste undersøgt effekten af ​​RABEX-5 lyddæmpning på tumorvækst

in vivo

ved injektion SGC7901 /KD eller SGC7901 /NC celler subkutant i højre flanke regioner af nøgne mus. Tumorstørrelse blev overvåget hver 3. dag med en passer. Tumor volumen blev reduceret betydeligt hos mus 2 uger efter injektion af SGC-7901 /KD-celler sammenlignet med kontrol-celler (

P

0,05;. Figur 5A). Tumorvolumen af ​​xenotransplantater afledt af SGC-7901 /KD gruppen var sammenlignelig med SGC-7901 /NC-gruppe, der udviser et markant fald i tumorvolumen 4 uger efter inokulation af tumorceller (

P

0,05, fig. 5B, C). Desuden vægten af ​​tumorer afledt af SGC-7901 /KD-celler var signifikant mindre end for kontrollerne (

P

0,05;. Figur 5D). Vi undersøgte dernæst ekspressionen af ​​VEGF ved transplantation tumorprøver ved QRT-PCR og immunohistokemi. Som vist i fig. 5E og 5F, niveauer af VEGF mRNA og protein blev nedsat i SGC-7901 /KD gruppen sammenlignet med SGC-7901 /NC styring. Disse

in vivo

data er i overensstemmelse med vores

in vitro

observationer og bekræfter, at lyddæmpning af RABEX-5 hæmmer gastrisk kræft vækst og progression ved at modulere VEGF transkriptionel aktivitet. Sammenfattende RABEX-5 spiller en onkogen rolle i gastrisk cancer.

(A) Tumorvoluminer blev målt på forskellige tidspunkter i mus inokuleret med SGC-7901 celler inficeret med RABEX-5 knockdown lentiviral vektor (SGC- 7901 /KD-celler). (B) Tumorer høstet fra mus 4 uger efter injektion med SGC-7901 /KD-celler (C) Individuelle tumor volumen for hver mus efter dissektion. (D) Den endelige tumorvægt blev målt ved afslutningen af ​​forsøget. (E) Ekspression af

VEGF

mRNA i tumorer afledt af nøgne mus. (F) immunhistokemisk analyse af VEGF-ekspression i tumorer afledt af SGC-7901 /NC og SGC-7901 /KD-grupper. *

P

0,05; **

P

. 0,01

Diskussion

Selvom tidligere undersøgelser har vist, at RABEX-5 spiller en rolle i tumorigenese i flere typer af kræft [11 ] – [14], dens rolle i mavekræft var ikke blevet undersøgt. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at RABEX-5-ekspression er signifikant opreguleret i gastrisk cancer væv sammenlignet med tilstødende normalt væv, hvilket indikerer, at RABEX-5 kan bidrage til mavekræft tumorigenese. Endvidere blev ekspressionen af ​​RABEX-5 signifikant associeret med tumorstørrelse og lymfeknudemetastase. I modsætning hertil var der ingen signifikante korrelationer mellem unormal RABEX-5 udtryk og køn, alder eller tumor placering. Dette er den første undersøgelse for at belyse den klinisk-patologisk betydning RABEX-5-ekspression i patienter med gastrisk cancer.

For at undersøge rollen af ​​RABEX-5 i tumorpromotion, vi næste udført omfattende tab af funktionsanalyse i RABEX- 5 høj-udtrykkende cellelinjer, SGC-7901 og NCI-N87. Vellykket hæmning af RABEX-5-ekspression blev opnået ved RNAi teknologi, og knockdown blev bekræftet ved Western blot. Vores analyser viste, at celleproliferation blev signifikant reduceret i SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD-celler og lignende resultater blev opnået i kolonidannelse assays. Vigtigere er det,

in vivo

xenograftmodeller støttede disse

in vitro

observationer. Denne fænotype kan være forårsaget af RABEX-5 regulerer specifikke gener og signalveje og dermed påvirke cellecyklus og apoptose. I transwell analyser, færre SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD celler migreret til det nedre kammer end kontrol celler, hvilket antyder, at RABEX-5 øger migration og invasion i gastriske kræftceller. Sårheling var også faldet betydeligt efter lyddæmpning af RABEX-5. Disse resultater verificere den vigtige rolle RABEX-5 i gastrisk vækst cancercellen og metastatisk adfærd. Men den nøjagtige molekylære mekanisme, ved hvilken RABEX-5 udøver disse virkninger forbliver ukendt, eftersom undersøgelser med RABEX-5 er begrænsede.

Tidligere undersøgelser har vist, at RABEX-5 kan binde specifikt til den aktive form af RAB- 5, for derved at regulere docking og fusion af endosomale membraner, motilitet endosomer og intracellulær signaltransduktion [15]. Ekspressionen af ​​RAB-5-proteiner er blevet forbundet med udviklingen af ​​forskellige ondartede tumorer [16] – [18] og er i stand til at fremme migrering af tumorceller [19], [20]. Angiogenese spiller en central rolle i tumorigenese [21], og reguleres af flere faktorer, såsom den blodpladeafledte vækstfaktor (PDGF) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [22]. PI3K /Akt-signalvejen kan reguleres ved både VEGF og PDGF. For eksempel VEGF forbedrer neuroblastom proliferation ved at aktivere PI3K /Akt signalering [23]. Ligeledes har undersøgelser vist, at PDGF kan påvirke migration evne celler via PI3K /AKT pathway [24]. Aktivering af PI3K /Akt signalering kan inhibere celle apoptose induceret af forskellige stimuli [25] – [29], og fremme cellecyklusprogression [30], [31], og derved fremme celleoverlevelse og proliferation. Denne vej deltager også i angiogenese [32], [33], og spiller en vigtig rolle i tumordannelse, invasion og metastase [34], [35]. Vores undersøgelse viser, at RABEX-5 nedregulering udløser et fald i VEGF-ekspression. Vi derfor hypotesen, at RABEX-5 fremmer væksten og metastatisk evne gastriske cancerceller gennem aktivering af VEGF og dens downstream signalveje.

Som konklusion viser vi, at RABEX-5 fremmer proliferation, kolonidannelse, migration og invasion, hvilket antyder, at RABEX-5 kan være et onkogen i gastrisk cancer, og dens virkninger kan være delvist medieret af modulering af VEGF-aktivering. RABEX-5 kan derfor repræsentere en ny diagnostisk og prognostisk markør og et nyt terapeutisk mål i mavekræft. bør gøres en større indsats for at afklare signalveje bag disse biologiske fænomener.