PLoS ONE: nærheden Infra-Red Photoimmunotherapy med Anti-CEA-IR700 Resultater i Omfattende Tumor Lysis og et signifikant fald i Tumor Burden i ortotopisk musemodeller af kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

Photoimmunotherapy (PIT) af cancer udnytter tumorspecifikke monoklonale antistoffer konjugeret til en fotosensibilisator phthalocyanin farvestof IR700 som bliver cytotoksisk ved bestråling med nær infrarødt lys. I denne undersøgelse, vi havde til formål at evaluere effekten af ​​PIT på humane bugspytkirtelkræftceller in vitro og in vivo i en ortotopisk nøgen musemodel. Bindingskapaciteten af ​​anti-CEA-antistof til BxPC-3 humane pankreatiske cancerceller blev bestemt ved FACS-analyse. Et in vitro-cytotoksicitet assay blev anvendt til at bestemme celledød efter behandling med PIT. Til in vivo-bestemmelse af PIT virkningsfuldhed blev nøgne mus orthotopisk implanteret med BxPC-3 pancreas tumorer, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP). Efter tumor indpodning blev musene inddelt i to grupper: (1) behandling med anti-CEA-IR700 + 690 nm laser og (2) behandling med 690 nm kun laser. Anti-CEA-IR700 (100 ug) blev indgivet til gruppe (1) via haleveneinjektion 24 timer før behandling. Tumorer blev derefter kirurgisk eksponeret og behandles med lysbehandling med en intensitet på 150 mW /cm

2 i 30 minutter. Hele kroppen billeddannelse blev udført efterfølgende i 5 uger under anvendelse af en OV-100 små dyr imaging system. Anti-CEA-IR700 antistof bundet til BxPC3 celler i høj grad som vist ved FACS-analyse. Anti-CEA-IR700 forårsagede omfattende cancercelledrab efter lys aktivering i forhold til at styre celler i cytotoksicitetsassays. I de ortotopisk modeller af kræft i bugspytkirtlen, den anti-CEA-IR700 gruppe havde signifikant mindre tumorer end kontrolgruppen efter 5 uger (p 0,001). Der var ingen signifikant forskel i kropsvægt af mus i anti-CEA-IR700 og kontrolgrupper indikerer, at PIT var veltolereret af musene

Henvisning:. Maawy AA, Hiroshima Y, Zhang Y, Heim R , Makings L, Garcia-Guzman M, et al. (2015) i nærheden af ​​Infra-Red Photoimmunotherapy med Anti-CEA-IR700 Resultater i Omfattende Tumor Lysis og et signifikant fald i Tumor Burden i ortotopisk musemodeller af kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 10 (3): e0121989. doi: 10,1371 /journal.pone.0121989

Academic Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: November 30, 2014, Accepteret: 9. februar 2015; Udgivet: 23 marts 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute CA142669 og CA132971 (til MB og AntiCancer, Inc). AntiCancer, Inc. og Aspyrian Therapeutics ydet støtte i form af lønninger til forfattere YZ, RH, LM, og MG-G, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Robert M. Hoffman er en grossist og ulønnet samarbejdspartner med AntiCancer, Inc. Yukihiko Hiroshima er en ikke-lønnet samarbejdspartner med AntiCancer, Inc. George A. Luiken er en grossist og ulønnet samarbejdspartner med OncoFluor, Inc. forfatterne bekræfte, at dette ikke ændrer forfatterne overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Photoimmunotherapy (PIT) anvender tumor specifikke monoklonale antistoffer, som er konjugeret til fotosensibilisatoren phthalocyanin farvestof, IR700, som er cytotoksisk ved bestråling med nær-infrarødt (NIR) lys [1-3]. Salg

Adskillige monoklonale antistoffer (mAb’er) har været anvendt med PIT i musemodeller for brystkræft herunder trastuzumab, et monoklonalt antistof (mAb) rettet mod human epidermal vækstfaktorreceptor-2 (HER-2), panitumumab, et monoklonalt antistof rettet mod human epidermal vækstfaktorreceptor-1 (HER-1) [ ,,,0],4,5]. Celledød blev induceret umiddelbart efter bestråle mAb-IR700-bundne målceller med NIR lys. In vivo tumor krympning efter bestråling med NIR lys blev påvist i målceller, der udtrykker epidermal vækstfaktor receptor. MAb-IR700 konjugater var effektive når det er bundet til cellemembranen og gav ingen fototoksicitet, når den ikke er bundet, hvilket antyder en anden mekanisme til PIT sammenlignet med konventionelle fotodynamiske terapier [1].

bugspytkirtlen er en dødelig tumor med høje lokale og fjern recidiv [6,7]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi et kimært monoklonalt antistof mod carcinoembryonisk antigen (CEA) til PIT, som ofte overudtrykkes i bugspytkirtelkræft og forud er udnyttet af vores laboratorium til fluorescens-vejledt kirurgi og fluorescens laparoskopi [8-17]. Anti-CEA-antistof blev konjugeret til IR700 og anvendt til PIT behandling af human pancreascancer i ortotopisk musemodeller samt bugspytkirtelkræftceller in vitro.

Materialer og metoder

Cell Culture

Den humane pancreas cancercellelinie BxPC-3 blev stabilt transduceret til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) som tidligere beskrevet [18,19]. Celler blev opretholdt i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), penicillin /streptomycin (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), natriumpyruvat (Gibco-BRL), natriumbicarbonat (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamin (Gibco-BRL), og minimalt essentielt medium ikke-essentielle aminosyrer (Gibco-BRL). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator.

Bestemmelse af CEA-antigen ekspressionsniveau

BxPC-3-GFP-celler fra en 75 cm

2 kolbe blev høstet med enzym-fri celle dissociation buffer, vasket en gang med inkubationspuffer (PBS + 0,5% FBS + 0,1% natriumazid), og udvindes i inkubationsbuffer på 2 x 10

6 celler /ml og holdt ved 4 ° C. Cellerne (5 x 10

5) blev inkuberet med kimært anti-CEA-antistof (Genara Biosciences LLC, Morgan Hill, CA) (10 ug /ml) i 300 pi inkubationsbuffer i 1 time ved 4 ° C, vasket tre gange med PBS og farvet med en Alexa488-konjugeret æsel-anti human IgG (H + L) antistof (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) i 45 minutter, efterfulgt af tre gange vask med PBS. En kontrol uden anti-CEA blev fremstillet parallelt. Flowcytometri profiler fra anti-CEA antistof-behandlede celler og ubehandlede celler blev fastsat på et Guava EasyCyte Plus flowcytometer (EMD Millipore, Billerica, MA). Antistoffet bindingskapacitet for anti-CEA blev bestemt ved anvendelse referenceperlerne (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) og geometriske organ ifølge producentens protokol.

Dyr

athymiske nu /Nu nøgne mus (AntiCancer Inc., San Diego, CA), 4-6 uger gamle, blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev holdt i en barriere facilitet under HEPA filtrering. Mus blev fodret med en autoklaveret laboratorium gnaver kost. Alle mus kirurgiske procedurer og billeddannelse blev udført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injektion af 50% ketamin, 38% xylazin, og 12% acepromazinmaleat (0,02 ml). Dyrene modtog buprenorphin (0,10 mg /kg ip) umiddelbart før kirurgi og en gang om dagen i løbet af de næste 3 dage til at lindre smerte. CO

2 inhalation blev anvendt til aflivning af alle dyr på 5 uger efter kirurgi. For at sikre død efter CO

2 kvælning, blev cervikal dislokation udført. Alle dyr blev udført med et anticancer, -protokol Inc. Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) specifikt er godkendt til denne undersøgelse, og i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er beskrevet i National Institute of Health Guide for pasning og anvendelse af dyr under Assurance Number A3873-1.

antistof-Dye Konjugation

Et vandopløseligt silicium-phthalocyanin derivat, IRDye 700DX NHS ester blev opnået fra LI-COR Bioscience (Lincoln, NE). af kimære anti-CEA-antistof (Genara Biosciences LLC) (2 mg [~ 14 nmol]) i en koncentration på 2 mg /ml i 0,1 M Na

2HPO

4 (pH = 8,6) blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med IR700dye NHS-ester (135 ug, 70 nmol) fremstillet i vandfrit DMSO ved 5 mmol /l. Efter inkubationsperioden, IR700-konjugat blev bufferudskiftet og oprenset med phosphatbuffer saltvand (PBS, pH = 7,1) under anvendelse af Amicon Ultra centrifugalfilter enheder (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA). Den IR700-mAb-konjugat blev gentagne gange fortyndet med 10 ml volumener af PBS og derefter koncentreret ved hjælp af filter enheder indtil mindre end 2% af det ukonjugerede IR700 dye arter forblev, som bestemt ved størrelsesudelukkelses-HPLC (SE-HPLC). Analyse af konjugaterne efter SE-HPLC blev udført ved anvendelse af en Agilent 1100 HPLC-system udstyret med en TSKgel G2000SWxl søjle (Tosoh Biosciences, Tokyo, Japan). SE-HPLC elueringspuffer var 1X PBS (pH = 7,1) med en strømningshastighed på 1 ml /min. UV /VIS-detektion ved 280 nm og 690 nm blev anvendt til at bestemme den gennemsnitlige dye-til-antistof-forholdet (DAR) for hver konjugater. Med denne prøve blev en renhed på 97,6% med 0,5% gratis farvestof og en DAR på 4,1 opnået.

Tumor implantation

Efter Confluence, BxPC-3-GFP humane bugspytkirtelkræftceller (1 x 10

6) injiceret subkutant i flankerne af nøgne mus og lades indpodes og vokse i en periode på 4-6 uger. Tumorer blev derefter høstet og tumorfragmenter (1 mm

3) fra subkutane tumorer blev sutureret til halen i bugspytkirtlen hjælp 8-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon, Ethicon Inc., Somerville, NJ). Ved afslutningen blev halen i bugspytkirtlen returneres til abdomen, og snittet blev lukket i et lag under anvendelse af 6-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon) [20,21]. De tumorfragmenter lodes vokse i en periode på 2 uger.

Cytotoksicitetsstudier

BxPC-3-celler blev podet i hvid væg 96-brønds plader (4.000 /brønd) og fik lov at vedhæfte natten over. Celler blev inkuberet med antistoffet konjugat, anti-CEA-IR700, (farvestof-antistof-forhold på 5,1) ved 10 mg /ml i 2 timer ved 37 ° C. Fire brønde på et tidspunkt blev underkastet behandling med 690 nm lys fra en LED (Marubeni Corporation, Tokyo, Japan) ved en effekttæthed på 50 mW /cm

2, der blev kalibreret med en energimåler udstyret med en fotodiode power sensor (Thorlabs Inc., Newton, NJ). Efter lysbehandling, blev antistofopløsningen erstattet med komplet RPMI 1640 medium, som indeholder CytoTox Green (Promega, Madison, WI) at overvåge celle drab.

Photoimmunotherapy in vivo

Anti-CEA-antistof ( 100 pg) (Genara Biosciences LLC, Morgan Hill, CA) konjugeret til IR700DX rekonstitueres til 100 pi blev injiceret via halevenen i behandlingsgruppen 24 timer før intervention mens kontrolgruppen havde 100 pi PBS på samme måde injiceret 24 timer før injektion . Hver gruppe bestod af 10 mus med ortotopisk BxPC-3-GFP tumorer.

Efter 24 timer blev de pancreatiske tumorer i alle 10 mus i behandlingsgruppen eksponeres via en venstre lateral incision og afbildede at detektere både GFP signal og 700 nm signal. Alle mus blev efterfølgende udsættes for photoimmunotherapy ved at udsætte tumor til en 690 nm laser ved 150 mW /cm2 i 30 minutter i alt 270 J /cm2. De omkringliggende normale væv blev beskyttet med folie af aluminium under PIT. Mus blev afbildet på tidspunktet for behandlingen og derefter ugentligt med tumor udsat for at vurdere respons på behandling. Efter 5 uger blev musene aflivet, hvorefter de blev afbildet og havde deres tumorer efter resektion og vejet.

Animal Imaging

Mus blev afbildet ugentligt ved anvendelse af Olympus OV100 små dyr imaging system (Olympus Corp. Tokyo, Japan), indeholdende en MT-20 lyskilde (Olympus Biosystems Planegg, Tyskland) og DP70 CCD-kamera (Olympus Corp. Tokyo, Japan) [22]. Alle billeder blev analyseret ved hjælp af Image-J (National Institute of Health Bethesda, MD) og blev behandlet med brugen af ​​Photoshop elementer-11 (Adobe Systems Inc. San Jose, CA).

Tumor størrelse beslutsomhed

musene i begge grupper havde ugentlig laparotomi for at blotlægge de pancreatiske tumorer via en venstre lateral incision. Tumorer blev afbildet med OV-100 ved GFP-ekspression. Tumor størrelse blev vurderet ved hjælp af Image-J software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software-version 21 (IBM, Armonk, NY ). For parvise sammenligninger blev kvantitative variable beregnet ved anvendelse af parrede-prøver t-test og bekræftet med Wilcoxon rank-sum test. En p-værdi ≤0.05 blev betragtet som signifikant. 95% konfidensintervaller opnået på analyse af data blev konfigureret i fejllinjer af de relevante tal og grafer.

Resultater og Diskussion

Anti-CEA-IR700 binder til CEA-udtrykkende bugspytkirtelkræft celler in vitro og forårsager omfattende celledød efter lysaktivering sammenlignet med kontrol

anti-CEA-antistof-bindingskapacitet til BxPC3 humane bugspytkirtelkræftceller var 2,227,000 bindingssteder per celle ved FACS-analyse (fig. 1). Celler blev inkuberet med anti-CEA-IR700 og behandlet med 690 nm lys. Ved slutningen af ​​inkubationen var 100% celledød i anti-CEA IR700 + 690 nm lys sammenlignet med en ubetydelig mængde celledød i no-690 nm lys gruppe (fig. 2). Død af 690 nm lys-behandlede celler i fravær af anti-CEA-IR700 var ubetydelig (data ikke vist).

BxPC-3-celler blev behandlet med anti-CEA-antistof og farvet med et fluorochrom konjugeret sekundært antistof mod anti-CEA (rød, fyldt), eller kontrol-farvet med sekundært antistof kun (sort, åben) og analyseret ved flowcytometri. Gating var for de vigtigste befolkning (A). Anti-CEA-antistof bindingskapacitet, bestemt med referenceperlerne, var meget høj (2,227,000 bindingssteder per celle) (B).

BxPC-3-celler blev inkuberet med anti-CEA-IR700-konjugat ( 10 ug /ml). Rapid celledrab blev observeret med en dosis på 32 J /cm

2 af 690 nm nær-infrarødt lys (blå cirkler), mens kun lidt celledrab skete uden belysning (grønne trekanter). Døden i lys-behandlede celler i fravær af anti-CEA-IR700 var ubetydelig (data ikke vist).

PIT resulterer i en signifikant reduktion i tumor størrelse og vægt i en ortotopisk musemodel af pancreas cancer

To uger efter ortotopisk implantation af BxPC-3-GFP tumorer, indpodning blev sikret og mus blev inddelt i 2 grupper med behandlingsgruppe modtager anti-CEA-IR700 konjugat (100 ug) og kontrolgruppen modtagende PBS (fig. 3). Tumorstørrelse blev vurderet på en ugentlig basis for at evaluere respons på terapi og overordnede forskelle i progression. I kontrolgruppen var der en indledende eksponentiel stigning i tumorstørrelse, der begyndte at plateau i uge 4 opnå en maksimal gennemsnitlig 390.7 mm

2 (95% CI [347,7, 433,7]). I modsætning hertil i behandlingsgruppen var der en indledende fald i tumorstørrelse fra baseline med en maksimal respons ses i uge 1 (fig. 4 og 5) med en gennemsnitlig størrelse på 6.65mm

2 (95% CI [1.75, 11,5]). I løbet af eksperimentet, tumoren begyndte at vokse igen, og nåede en maksimal gennemsnitlig på 29,5 mm

2 (95% CI [16.5, 42.5]) ved 5 uger efter behandling. Forskellen i tumorstørrelse mellem kontrolgruppen og behandlingsgrupperne var signifikant (p 0,001).

To uger efter ortotopisk implantation af BxPC-3-GFP tumorer, transplantation blev sikret og mus blev inddelt i 2 grupper med behandlingsgruppen, der modtager anti-CEA-IR700 konjugat (100 ug) og 2

nd gruppe, der fik en injektion med PBS. Mus blev serielt afbildet ugentligt i løbet af 5 uger til måling ortotopisk tumorvækst.

Mus havde deres tumorer eksponeret via en venstre lateral incision og afbildes med OV-100. Maksimal effekt af PIT blev noteret en uge efter påbegyndt behandling.

Tumor størrelser blev bestemt ved hjælp af billede-J software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

ved afslutningen af ​​forsøget i uge 5, blev tumorerne i begge grupper udskåret og vejet. Komplet excision blev bekræftet med OV-100 ved GFP-fluorescens. Den gennemsnitlige tumor vægt var 3872 mg (95% CI [3213, 4531]) for kontrolgruppen og 239,6 mg (95% CI [81, 397]) til behandling (p 0,001) (figur 6 og 7). .

En signifikant forskel blev bemærket med gennemsnitlige tumor vægte efter tumor resektion. En væsentlig forskel i tumor vægt blev noteret mellem behandlings- og kontrolgrupper (p 0,001).

Det øverste panel viser tumorer fra kontrolgruppen og den nederste panel viser tumorer fra behandlingsgruppe.

de gennemsnitlige kropsvægt af mus efter en uges behandling var 26,3 gram (95% CI [25,1, 27,4]) for PIT-gruppen og 25,1 gram for kontrolgruppen (95% CI [ ,,,0],24, 26,2]), som ikke var statistisk forskellige (p = 0,23). De gennemsnitlige legemsvægte af musene 5 uger efter behandlingen var 29,2 g (95% CI [28, 30,5]) til PIT-gruppen og 28,7 g (95% CI [27, 30,3]) for kontrolgruppen, som også var ikke statistisk forskellige (p = 0,64), hvilket indikerer, at PIT var veltolereret af musene.

på trods af de anti-tumor effekter af PIT, der var dog en 100% gentagelse sats. Tidligere undersøgelser har vist, at hastigheden og mængden af ​​tumor celledestruktion er afhængig af både den konjugerede dosis og lysdosis, produktet af hvilket resulterer i den samme cytotoksiske virkning uanset metoden til lys levering (kontinuerlig eller intermitterende) [2, 23]. I denne forbindelse er yderligere undersøgelser nødvendige for at vurdere, hvordan dosering af anti-CEA-IR700 kompleks og variere mode og mængde energi levering kunne øge effektiviteten.

En enkelt runde af behandlingen blev anvendt i den foreliggende rapport som bevis for princippet i en ortotopisk model af kræft i bugspytkirtlen. Multiple runder af PIT vil blive udført i fremtidige eksperimenter. Gentagne runder af terapi har vist sig at øge effektiviteten af ​​PIT [4]. Det forventes, at gentagne runder af PIT vil reducere hyppigheden af ​​recidiver. Gentagne runder af PIT skulle være muligt på grund af den lave toksicitet observeret. PIT bør kunne tilføje effekten af ​​kirurgi og strålebehandling, når de anvendes i kombination med disse behandlinger. Dette vil blive testet i ortotopisk modeller, herunder immunkompetente mus, og i eksperimentelle høje metastatiske modeller, samt i patient-afledte ortotopisk xenograft (PDOX) modeller i fremtidige eksperimenter.