PLoS ONE: calcineurinhæmmer-induceret og Ras-medieret Overekspression af VEGF i nyrekræft Cells Indebærer mTOR gennem regulering af PRAS40

Abstrakte

Malignitet er et stort problem hos patienter behandlet med immunosuppressive midler. Vi har vist, at behandling med calcineurinhæmmere (calcineurinhæmmere) kan inducere aktiveringen af ​​proto-onkogen Ras, og kan fremme en hurtig progression af human renal cancer gennem overekspressionen af ​​vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF). Interessant fandt vi, at CNI-induceret VEGF-overekspression og cancercelleproliferation blev inhiberet af rapamycin behandling, hvilket indikerer potentiel inddragelse af mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway i denne tumorigene proces. Her, undersøgte vi den rolle, mTOR pathway ved mediering CNI- og Ras-induceret overekspression af VEGF i humane nyrecancerceller (786-0 og Caki-1). Vi fandt, at knockdown af raptor (ved hjælp siRNA) faldt betydeligt CNI-induceret VEGF-promotoren aktivitet som observeret af promotor-luciferase assay, hvilket antyder betydningen af ​​mTOR complex1 (mTORC1) i CNI-induceret VEGF transkription. Det er kendt, at mTOR bliver aktiveret efter phosphorylering af dens negative regulator PRAS40, som er en del af mTORC1. Vi observerede, CNI behandling og aktivering af H-Ras (gennem transfektion af et aktivt H-Ras plasmid) markant forøget phosphorylering af PRAS40, og transfektion af celler under anvendelse af en dominant negativ plasmid af Ras, faldt betydeligt PRAS40 phosphorylering. Protein kinase C (PKC) -ζ og PKC-δ, som er kritiske mellemled signalmolekyler for CNI-induceret tumorigen pathway, dannet kompleks med PRAS40; og vi fandt, at CNI behandling forøgede kompleksdannelse mellem PRAS40 og PKC, især (PKC) -ζ. Inhibering af PKC-aktivitet under anvendelse af farmakologiske inhibitor markant nedsat H-Ras-induceret phosphorylering af PRAS40. Den overekspression af PRAS40 i renale cancerceller betydeligt nedreguleret CNI- og H-Ras-induceret VEGF transkriptionel aktivering. Endelig blev det observeret, at CNI behandling forøget ekspression af phosho-PRAS40 i renale tumorvæv

in vivo

. Sammen phosphoryleringen af ​​PRAS40 er kritisk for aktivering af mTOR i CNI-induceret VEGF-overekspression og renal cancer progression

Henvisning:. Basu A, Banerjee P, Contreras AG, Flynn E, Pal S (2011) Calcineurin Inhibitor-induceret og Ras-medieret Overekspression af VEGF i nyrekræft Cells Indebærer mTOR gennem regulering af PRAS40. PLoS ONE 6 (8): e23919. doi: 10,1371 /journal.pone.0023919

Redaktør: Sujit Basu, Ohio State University, USA

Modtaget: 15 juli, 2011; Accepteret: August 1, 2011; Udgivet: 23 August, 2011

Copyright: © 2011 Basu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev finansieret af følgende: 1) National Institutes of Health Grant R01 CA131145 (til SP); 2) John-Merrill Grant ASN-AST (til S.P.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de seneste forbedringer i immunosuppressive behandlinger har reduceret forekomsten af ​​akut afstødning af allotransplantater, og øget overlevelsen af ​​transplanterede patienter [1], [2]. Imidlertid kan disse midler også bidrage til højere dødelighed på grund af en øget risiko for kræft [3], [4], [5], [6]. Det er blevet fastslået, at kræft er den anden hyppigste dødsårsag i nyretransplanterede patienter med normal funktion af [7] graft. Det har også vist sig, at transplantationen miljø kan accelerere recidiv eller progression af cancer [3],. Således skal udvikles for at forebygge kræft udvikling i patienter under immunsuppressiv behandling terapeutiske mål.

De immunosuppressive midler menes at kompromittere immun overvågning mekanisme (r) af tumorceller og /eller forstyrrer den normale DNA-reparation mekanismer [4], [5], [8]. Især calcineurinhæmmere (calcineurinhæmmere) er fremragende immunosuppressive midler til at hæmme afstødning; men de kan fremme væksten af ​​forskellige tumorer [9], [10], [11], [12]. Den calcineurin Komplekset består af tre subunits, den katalytiske A, de lovgivningsmæssige B, og calmodulin [13]. Den cellulære calcium aktiverer den katalytiske underenhed for dens funktion som serin /threonin-phosphatase, hvilket resulterer i aktiveringen af ​​den nukleare faktor af aktiverede T-celler (NFAT) familie af transkriptionsfaktorer [14]. CNI cyclosporin (CsA) binder til cyclophylin, et cytoplasmatisk protein, og den resulterende kompleks binder til den regulatoriske B-underenhed af calcineurin og forhindrer aktivering af NFAT [15]. Men bortset fra at hæmme NFAT, den calcineurinhæmmere kan også regulere andre signalmolekyler spille vigtige roller i tumorvækst [16], [17]. Hojo

et al.

[9] viste, at CsA fremmer kræft progression og metastase ved direkte cellulære virkning (er) gennem transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) produktion, der er uafhængig af dens virkning på immunforsvaret system værten. Koehl

et al.

[18] rapporterede, at CsA behandling fremmer udviklingen af ​​post-transplantation cancer, som er stærkt afhængig af processen med tumorangiogenese. Tilsvarende Guba

et al.

[19] foreslog, at CsA behandling kan inducere ekspressionen af ​​angiogene cytokiner.

Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) er en af ​​de mest potente angiogene cytokiner, der spiller vigtig rolle i tumorvækst [20], [21]. Vi har for nylig påvist, at behandling med calcineurinhæmmere inducerer overekspression af VEGF, og fremmer en hurtig progression af human renal cancer [22]. CNI-induceret VEGF overekspression reguleres på både transkriptionel og post-transkriptionel niveau [22], [23]. Vi har også fundet, at calcineurinhæmmere kan aktivere proto-onkogene H-Ras i humane nyrecancerceller [24]; og vi har vist, at CNI-induceret VEGF-overekspression er medieret gennem aktivering af protein kinase C (PKC) -ζ og PKC-δ [22], [23], som er potentielle downstream mål for Ras [25].

i modsætning til calcineurinhæmmere, pattedyr mål for rapamycin (mTOR) inhibitor rapamycin (RAPA) kan have en helt modsatte effekt i form af tumor udvikling [10], [19], [26]. De transplanterede patienter, der fik RAPA behandling ikke udvikler kræft i samme tempo som dem, der modtager andre immunosuppressive midler såsom calcineurinhæmmere [27], [28]. Det er blevet vist, at RAPA behandling kan have en anti-angiogen virkning [19]. Interessant nok har vi for nylig demonstreret, at RAPA behandling signifikant kan inhibere CNI-induceret VEGF mRNA-stabilitet [23], og CNI-induceret proliferation af humane nyrecancerceller [24]. Disse resultater antyder klart en mulig rolle af mTOR i CNI-inducerede tumorigene pathways. Til støtte for disse observationer er det blevet rapporteret, at Akt-mTOR pathway er nødvendig for CNI-induceret tumorvækst [29]. Desuden kan både PKC-ζ og PKC-δ aktivere Akt-mTOR pathway [30], [31], [32], [33].

mTOR pathway spiller en central rolle i celle overlevelse , vækst, proteinsyntese, cellulær metabolisme, og angiogenese [34], [35]. Ændringer i reaktionsvejen regulering mTOR forekomme i mange faste maligne lidelser, inklusive nyrekræft [36], [37], [38]. mTOR, som konstitutivt aktiveret i mange cancere ved dereguleret aktivering af onkogener eller tab af tumorsuppressorgener, fungerer som makromolekylære komplekser [39]. Den mTOR complex1 (mTORC1), der indeholder raptor, er RAPA følsom; mens mTOR complex2 (mTORC2), der indeholder Rictor, er RAPA ufølsom [34], [39]. Det er for nylig blevet fastslået, at en prolin-rige Akt substrat på 40 kDa (PRAS40) negativt kan regulere mTOR aktivitet [40], [41]. Før du phosphoryleres med Akt, PRAS40 bindes til raptor og isolerer raptor fra mTORC1; dette fører til afbrydelse af mTORC1 ligner effekten af ​​RAPA [40], [42]. Interaktionen af ​​PRAS40 med raptor konkurrerer med interaktionen af ​​raptor med S6K1 og 4E-BP1 [42], [43]. Desuden er denne interaktion PRAS40 er meget specifik for mTORC1, som PRAS40 ikke knytter eller afbryde mTORC2 [34].

I denne undersøgelse viser vi, at CNI-induceret og Ras-PKC-medierede VEGF overekspression kan kanaliseres gennem mTORC1 signalvejen, og dette er medieret gennem regulering af PRAS40. Vi viser, at CNI behandling og aktivering af H-Ras og PKC kan føre til phosphorylering af PRAS40; og overekspression af PRAS40 fører til nedregulering af CNI- og Ras-induceret VEGF transkriptionel aktivering. Resultaterne af vores undersøgelse tyder på en roman krydstale blandt Ras, PKC og mTOR i regulering af CNI-induceret VEGF overekspression.

Resultater

Inddragelse af mTOR complex1 i calcineurinhæmmer-induceret VEGF Overekspression i human nyrecancerceller

Vi har for nylig påvist, at behandling med calcineurinhæmmere (calcineurinhæmmere) kan fremme VEGF-overekspression i humane nyrecancerceller gennem begge transkriptionelle og post-transkriptionelle forskrifter [22], [23]. Vi har også vist, at CNI-induceret VEGF mRNA-stabilitet, og CNI renal cancer celleproliferation er markant inhiberet efter behandling med mTOR inhibitor rapamycin (RAPA) [23], [24]. Vores resultater tydeligt den mulige rolle af mTOR i CNI-inducerede tumorigene veje. Her, vi først undersøgt den rolle, mTOR i CNI-induceret VEGF transkriptionel aktivering i humane nyrecancerceller (786-0 og Caki-1). Celler blev transficeret med VEGF-promotor-luciferase-plasmidet, og derefter behandlet med CNI cyclosporin (CsA) i fravær eller nærvær af RAPA. Som vist i figur 1A, CsA behandling fremmes VEGF transkriptionel aktivering i 786-0 celler, og RAPA behandling signifikant hæmmet CsA-induceret VEGF promotoraktivitet. Vi fandt et lignende resultat (data ikke vist) i Caki-1-celler. Dernæst har vi også observeret, at CsA behandling induceret VEGF proteinekspression som observeret ved Western blot analyse; og behandling med RAPA signifikant inhiberede CsA-induceret VEGF-ekspression (figur 1B).

A,

786-0 celler blev transficeret med 2,6-kb VEGF-promotor-luciferase-konstruktion (0,5 ug /godt). Efter transfektion blev cellerne dyrket i 12 h, og derefter behandlet natten over (12 timer) med forskellige kombinationer af CsA (5,0 ug /ml) og RAPA (10,0 ng /ml) eller vehikel alene (kontrol). Efter 24 timer af transfektion blev cellerne høstet, og fold ændring i luciferaseaktivitet blev beregnet som de relative luciferase tællinger fra hver gruppe af celler sammenlignet med celler behandlet med vehikel alene. Dataene afspejler tre uafhængige forsøg.

Kolonner,

gennemsnit af tredobbelte aflæsninger af to forskellige prøver;

fejllinjer,

SD.

B, Salg 786-0 celler blev behandlet med forskellige kombinationer af CsA (5,0 ug /ml) og RAPA (10,0 ng /ml) eller vehikel alene (kontrol) i 24 time. Hele cellelysater blev fremstillet, og Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af anti-VEGF og anti-β-actin til kvantificering af protein ekspression af VEGF og β-actin henholdsvis. Søjlediagrammet nedenfor Western blot illustrerer den relative ekspression af VEGF ved densitometri, hvor signalerne blev standardiseret til ekspressionen af ​​den interne kontrol β-actin. Repræsenterer tre uafhængige forsøg.

Kolonner,

gennemsnit af relativ intensitet af VEGF-ekspression fra tre forskellige blots;

barer,

SD.

C,

786-0-celler blev transficeret med enten raptor siRNA (25 nM) eller kontrol siRNA. Følgende 24 times siRNA transfektion blev cellerne transficeret med 2,6-kb VEGF-promotor-luciferase-konstruktion (0,5 ug /brønd). Efter 12 times plasmid transfektion blev cellerne behandlet natten over (12 timer) med enten CsA (5,0 ug /ml) eller vehikel alene (kontrol). Cellerne blev høstet, og fold ændring i luciferaseaktivitet blev beregnet som de relative luciferase tællinger fra hver gruppe af celler sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA og behandlet med vehikel alene. Dataene afspejler to uafhængige forsøg.

Kolonner,

gennemsnit af tredobbelte aflæsninger af prøver;

fejllinjer,

SD. Den knockdown af raptor blev bekræftet ved Western blot analyse efter 48 timer af siRNA transfektion (

højre panel) Hotel (A-B) *,

s

. 0,01 sammenlignet med vehikelbehandlede celler ; **,

s

0,01 sammenlignet med kun CsA-behandlede celler. (C) *,

s

0,01 sammenlignet med kontrol siRNA-transficerede og vehikelbehandlede celler; **,

s

0,05 sammenlignet med kontrol siRNA-transficeret og CSA-behandlede celler

Vi næste undersøgte rolle mTOR complex1 (mTORC1) i CNI-induceret VEGF. transkription. Som diskuteret tidligere, raptor er en del af mTORC1 [34], [39]. Her, observerede vi, at knockdown af raptor hjælp siRNA betydeligt nedreguleret CNI-induceret VEGF promotoraktivitet (figur 1C). Knockdown af raptor (-70%) blev bekræftet ved Western blot-analyse (figur 1C,

højre panel

). Tilsammen disse observationer tyder klart på inddragelse af mTORC1 i CNI-induceret VEGF overekspression i renale cancerceller.

Behandling med CNI, og Aktivering af H-Ras Fremmer Phosphorylering af PRAS40

Vi har nyligt vist, at CNI behandling kan inducere aktivering af H-Ras i nyrecancerceller [24]. I en nylig rapport [44], er det blevet vist, at aktiveringen af ​​Ras kan fremme mTOR signalering. Som omtalt tidligere, PRAS40 fungerer som en negativ regulator af mTORC1, og hæmmer dets aktivitet for de nedstrøms signalering begivenheder [34], [40], [41]. Efter phosphorylering, bliver PRAS40 adskilles fra raptor af mTORC1, og dermed mTOR bliver aktiveret. Som vores tidligere forsøg angivet inddragelse af raptor i CNI-induceret VEGF transskription, her ønskede vi at vurdere, om CNI behandling og aktivering af H-Ras kunne regulere PRAS40 fosforylering. Først kontrolleres vi udtryk for phospho-PRAS40 i normale renale epitelceller (RPTEC), og i 786-0 og Caki-1 renale cancerceller. Gennem Western blot-analyse, fandt vi, at ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 var markant højere i 786-0 og Caki-1-celler sammenlignet med RPTEC (figur 2A,

øvre panel

); der var imidlertid ingen signifikant ændring i ekspressionen af ​​samlede PRAS40 i disse celler (figur 2A,

nedre panel

). Denne observation tyder på, at mTOR pathway er aktiv i renale cancerceller.

A,

udtryk for phospho-PRAS40 og PRAS40 blev målt i helcellelysater af RPTEC, 786-0, og Caki-1 ved Western blot analyse ved anvendelse af anti-phospho-PRAS40 og anti-PRAS40.

B,

786-0 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer (1,0 og 5,0 ug /ml) af CsA eller med bærer alene (kontrol) i 3 timer. Cellerne blev lyseret, og ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 og PRAS40 blev målt ved Western blot-analyse.

C,

Caki-1-celler blev transficeret med enten stigende koncentrationer (0,1-1,0 ug /brønd) i H-Ras (12V) eller tom ekspressionsvektor (kontrol) i 24 time. Cellerne blev lyseret, og ekspressionen af ​​phospho-PRAS40, PRAS40, Ras, og β-actin i cellelysater blev målt ved Western blot-analyse.

D, Salg Caki-1-celler blev transficeret med enten forskellige koncentrationer (0,5 og 1,0 ug /brønd) af det dominerende-negative Ras (17N) eller tom ekspressionsvektor (kontrol) i 24 time. Cellerne blev lyseret, og ekspressionen af ​​phospho-PRAS40, og PRAS40 blev målt ved Western blot-analyse. (A-D) repræsentant tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

Vi næste bestemmes effekten af ​​CsA behandling på PRAS40 fosforylering. 786-0-celler blev behandlet med enten stigende koncentrationer af CsA eller bærer alene; og ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 blev undersøgt ved Western blot-analyse. Som vist i figur 2B, CsA behandling markant øgede ekspressionsniveauet phospho-PRAS40 sammenlignet med vehikel-behandlet kontrol (

øvre panel

); der var imidlertid ingen signifikant ændring i ekspressionen af ​​samlede PRAS40 efter CsA behandling (

nedre panel

).

Dernæst forsøgte vi at evaluere effekten af ​​H-Ras-aktivering på PRAS40 phosphorylering. Til dette formål blev Caki-1-celler transficeret med enten stigende koncentrationer af plasmid, der udtrykker aktiverede form af H-Ras, H-Ras (12V), eller det tomme ekspressionsvektor. Efter transfektion blev ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 og total PRAS40 målt. Vi fandt, at aktiveringen af ​​H-Ras signifikant øget niveau af phosho-PRAS40 sammenlignet med vektor-transficerede kontrol (figur 2C,

første panel

); var der ingen signifikant ændring i den totale PRAS40 efter H-Ras-aktivering (figur 2C,

andet panel

). Overekspressionen af ​​H-Ras (12V) i disse celler blev bekræftet ved Western blot-analyse (figur 2C,

tredje panel

).

Endelig kontrolleres vi virkningen af ​​inhiberingen af ​​endogen Ras på PRAS40 phosphorylering. De Caki-1-celler blev transficeret med enten den dominant negative mutant af Ras, blev Ras (17N) eller tom vektor, og ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 målt. Som vist i figur 2D, inhibering af Ras faldt ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 (

øvre panel

); men der var ingen signifikant ændring i ekspression af total PRAS40 (

lavere panel

). Samlet set viser disse observationer antyder, at CNI behandling og aktivering af H-Ras-vejen i humane nyrecancerceller kan inducere mTOR gennem øget phosphorylering af PRAS40.

PKC Forms Complex med PRAS40, og kan inducere dets Phosphorylering

I vores tidligere rapport [22], vi har vist, at både PKC-ζ og PKC-δ er kritiske mellemled signalmolekyler for CNI-induceret VEGF transkriptionsaktivering; og disse PKC-isoformer kan tjene som potentielle downstream mål for aktiv Ras [25]. Her, søgte vi at bestemme, om PKC kunne regulere phosphorylering af PRAS40. Først kontrolleres vi, om der var nogen kompleksdannelse mellem PRAS40 og enten PKC-f-og PKC-A i RPTEC og 786-0 celler under basal betingelse. Ved immunopræcipitation, observerede vi, at ja både PKC-ζ og PKC-δ kunne gøre kompleks med PRAS40 (figur 3A); dog intensiteten af ​​komplekset var meget stærkere i cancerceller versus normale renale epitelceller. Vi næste undersøgt, om CNI behandling kunne modulere kompleksdannelse mellem PRAS40 og PKC-ζ og PKC-δ i 786-0 celler. Som vist i figur 3B, behandling med CsA markant øgede komplekset mellem PRAS40 og PKC-ζ sammenlignet med vehikel-behandlet kontrol; men der var ingen signifikant ændring (data ikke vist) i kompleksdannelse mellem PRAS40 og PKC-δ.

A, Lysater af RPTEC og 786-0 celler

blev immunfældet med anti- PRAS40.

B, Salg 786-0 celler blev behandlet med enten CsA (5,0 ug /ml) eller vehikel alene (kontrol) i 2 timer. Cellelysater blev immunpræcipiteret med anti-PRAS40. (A-B) Immunpræcipitater (IP) blev erobret af protein A-Sepharose-perler, kogt i SDS-buffer og adskilt med SDS-PAGE. Western blot-analyse blev udført under anvendelse af enten anti-PKCζ, eller anti-PKCδ, eller anti-PRAS40.

C, Salg 786-0 celler blev behandlet med enten stigende koncentrationer (50-250 nmol /l) calphostin C eller vehikel alene (kontrol) i 3 timer. Cellerne blev lyseret, og ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 og PRAS40 blev målt ved Western blot-analyse.

D, Salg Caki-1-celler blev forbehandlet med enten calphostin C (100 nmol /l) eller vehikel alene; og celler blev derefter transficeret med enten H-Ras (12V) (1,0 ug /brønd) eller vektor alene til 24 t, i fravær eller nærvær af calphostin C. Celler blev lyseret, og ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 og PRAS40 blev målt ved Western blot-analyse. (A-D) repræsentant tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

Næste, vi testede, hvis hæmning af PKC gennem behandlingen af ​​farmakologiske inhibitor kan mindske phosphorylering af PRAS40. 786-0-celler blev behandlet med enten stigende koncentrationer af calphostin C eller bæreren alene. Efter behandling blev ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 og total PRAS40 målt ved Western blot-analyse. Som vist i figur 3C, behandling med calphostin C markant nedsat niveau phosho-PRAS40 sammenlignet med vehikel-behandlet kontrol (

øvre panel

); men der var ingen signifikant ændring i ekspression af total PRAS40 (

lavere panel

). Tilsammen disse observationer tyder på, at PKC kan associere med PRAS40, og regulere phosphorylering. Dog kan det ikke konkluderes, om der er en direkte kompleksdannelse mellem PKC og PRAS40, og om nogle andre associerede molekyler er involveret i PKC-medieret PRAS40 phosphorylering.

Hæmning af PKC nedregulerer H-Ras-induceret phosphorylering af PRAS40

i vores tidligere forsøg har vi vist, at H-Ras aktivering kan inducere PRAS40 phosphorylering. Her, vi ønskede at udforske, om inhibering af PKC kunne nedregulere H-Ras-induceret phosphorylering af PRAS40 i renale cancerceller. Til dette formål blev Caki-1-celler transficeret med enten H-Ras (12V) eller den tomme ekspressionsvektor i fravær eller nærvær af PKC-inhibitoren calphostin C. Efter transfektion ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 og total PRAS40 blev målt. Som vist i figur 3D (

øvre panel

), aktivering af H-Ras inducerede phosphorylering af PRAS40 sammenlignet med vektor-transficerede kontrol; og inhibering af PKC betydeligt nedreguleret H-Ras-induceret PRAS40 phosphorylering. Der var ingen signifikant ændring i ekspressionen af ​​samlede PRAS40 efter H-Ras-aktivering og PKC-inhibering (figur 3D,

nedre panel)

. Disse observationer tyder klart, at Ras-PKC pathway, som er afgørende for CNI-inducerede tumorgene signaleringsbegivenheder, kan phosphorylere PRAS40, og kan således aktivere mTOR.

Overekspression af PRAS40 inhiberer CNI- og H-Ras-induceret transkriptionel aktivering af VEGF

Vores tidligere forsøg antydede, at CNI-induceret og Ras-medierede signaleringsveje kunne inaktivere PRAS40 gennem sin forøget phosphorylering. Her, vi først undersøgt, om overekspression af PRAS40 kunne inhibere CNI-induceret overekspression af VEGF i renale cancerceller. 786-0-celler blev co-transficeret med VEGF-promotor-luciferase-konstruktion og enten PRAS40 overekspression plasmid eller det tomme ekspressionsvektor. Celler blev behandlet med enten CsA eller bæreren alene. Som vist i figur 4A, CsA behandling forøget VEGF transkriptionel aktivering sammenlignet med vehikel-behandlet kontrol; og overekspressionen af ​​PRAS40 signifikant reduceret CsA-induceret VEGF promotoraktivitet. Den overekspression af PRAS40 i transfekterede celler blev bekræftet ved Western blot analyse (figur 4A,

nederste panel

).

A, top,

786-0 celler samarbejde transficeret med 2,6-kb VEGF-promotor-luciferase-konstruktion (0,5 ug /brønd) og enten en PRAS40 overekspression plasmid (myc-PRAS40) (0,5 ug /brønd) eller tom vektor. Efter transfektion blev celler dyrket i 12 h, og derefter behandlet natten over (12 timer) med enten CsA (5,0 ug /ml) eller vehikel alene (kontrol). Efter CsA behandling blev cellerne høstet, og fold ændring i luciferaseaktivitet blev beregnet som de relative luciferase tællinger fra hver gruppe af celler sammenlignet med celler transficeret med tom vektor og behandlet med vehikel alene.

A, bund,

overekspression af myc-PRAS40 plasmidet i transficerede celler blev bekræftet ved Western blot analyse ved hjælp af anti-PRAS40; og ekspressionen af ​​β-actin blev målt som intern kontrol.

B, Salg Caki-1-celler blev co-transficeret med 2,6-kb VEGF-promotor-luciferase-konstruktion (0,5 ug /brønd) og forskellige kombinationer af H-Ras (12V), myc-PRAS40 og tom vektor (0,5 ug /brønd af hvert plasmid). Efter 24 timer af transfektion blev cellerne høstet, og fold ændring i luciferaseaktivitet blev beregnet som de relative luciferase tællinger fra hver gruppe af celler sammenlignet med celler transficeret med tom vektor. (A-B) De data afspejler tre uafhængige forsøg.

Kolonner,

gennemsnit af tredobbelte aflæsninger af to forskellige prøver;

fejllinjer,

SD. I A, *,

s

0,01 sammenlignet med tom vektor-transficerede og vehikelbehandlede celler; **,

s

0,01 sammenlignet med tomme vektor-transficerede og CSA-behandlede celler. I B, *

s

0,01 sammenlignet med vektor-transficerede celler; **,

s

. 0,01 sammenlignet med vektor- og H-Ras (12V) transficerede celler

Næste, vi bestemmes, hvis overekspression af PRAS40 kunne hæmme H- Ras-induceret VEGF transkription. Caki-1-celler blev co-transficeret med VEGF-promotor-luciferase-konstruktion og H-Ras (12V) i fravær eller nærvær af PRAS40 overekspression plasmid. Kontrolceller blev transficeret med tomme ekspressionsvektorer. Som vist i figur 4B, aktivering af H-Ras forøget VEGF transkriptionel aktivering sammenlignet med vektor-transficerede celler; og overekspressionen af ​​PRAS40 faldt betydeligt H-Ras-induceret VEGF promotoraktivitet. Sammen disse resultater tyder på, at CNI- og Ras-induceret signalering begivenheder kan fremme VEGF transkriptionel aktivering i en mTOR-afhængige vej gennem regulering af PRAS40.

CNI Behandling Øger Phosphorylering af PRAS40 i Nyrer tumorvæv

i Vivo

Vi har for nylig vist, at i immundefekte (

nu /nu

) mus, CNI (CSA) behandling fremskyndes betydeligt væksten af ​​humane nyre tumorer (786-0) gennem VEGF-induceret angiogenese, sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller [22]. Men vi ikke evaluere udtrykket niveau af phospho-PRAS40 i tumorer. Således her undersøgte vi status phospho-PRAS40 i disse tumorvæv fra CsA-behandlet samt kontrol mus. Som vist i figur 5, var udtryk for phospho-PRAS40 markant forøget (som observeret ved pletter af mørk rød farvning) i nyre tumor væv fra CsA-behandlede mus (

øverst i højre panel

) sammenlignet med tumor væv fra køretøjet behandlet kontrolgruppe (

øverst til venstre panel

). Der var imidlertid ingen signifikant ændring i ekspressionen af ​​samlede PRAS40 i tumorvæv opnået fra CsA-behandlede (

midterste højre panel

) eller vehikel-behandlede gruppe (

midterste venstre panel

). Vores

in vivo

data svarer til vores

in vitro

resultater, og det tyder på, at CNI-medieret og VEGF-induceret accelereret væksten af ​​humane nyre tumorer kan indebære øget fosforylering af PRAS40, som kan føre til aktivering af mTOR pathway

Humane nyrecancerceller (1,0 x 10

6; 786-0). blev injiceret sc i nøgen (

nu /nu

) mus (

n

= 5 i hver gruppe), og de blev behandlet enten med CsA (10 mg /kg /dag) eller med køretøjet som kontrol . Tumorer blev høstet på dag 25 efter tumorinjektion. Repræsentative mikrofotografier illustrere den immunhistokemiske udtryk for phospho-PRAS40 (

toppaneler

) og PRAS40 (

midterste paneler

) i høstede nyre tumorvæv (forstørrelse X400).

Patches af mørk rød farve,

udtryk for phosho-PRAS40, som markant forøget i tumorvæv fra CsA-behandlede mus. H og H-Ras og PKC kan virke som kritiske formidlende signalmolekyler for CNI-induceret VEGF-overekspression [22], [24]. I denne undersøgelse, viser vi en ny vej, hvor CNI-induceret og Ras-PKC-medierede signaler kan involvere mTORC1 gennem regulering af sin hæmmende molekyle PRAS40 og fremme VEGF overekspression.

Som omtalt tidligere, calcineurinhæmmere medierer deres immunosuppressive funktion gennem hæmning af calcineurin-NFAT pathway [15]. Imidlertid kan calcineurinhæmmere også regulere andre signaleringsmolekyler involveret i ekspressionen af ​​VEGF og andre gener [16], [17]. Vi har for nylig vist, at CNI behandling kan aktivere H-Ras, og kan også inducere phosphorylering af dens downstream mål, PKC-f-og PKC-a; og fremmer overekspression af VEGF i humane nyrecancerceller [22], [23]. Chen

et al.

[45] har rapporteret, at CsA-induceret oxidativ stress kan opregulere og aktivere PKC-ζ i virusinficerede humane B-celler, hvilket kan føre til induktionen af ​​lymfoproliferative lidelser hos transplantationspatienter.

Interessant vi har vist, at CNI-inducerede VEGF-overekspression og renal cancer celleproliferation inhiberes af RAPA behandling, hvilket tyder på mulige rolle mTOR i CNI-induceret tumorigene pathways, der involverer Ras-aktivering [23], [ ,,,0],24]. . Til støtte for vores observationer, Carriere

et al

[44] har for nylig rapporteret, at mitogen og onkogen aktivering af Ras-vejen kan fremkalde mTORC1; det er også blevet vist, at Akt-mTOR pathway er nødvendig for CNI-induceret tumorvækst [29]. Desuden kan både PKC-ζ og PKC-δ fremme induktion af Akt-mTOR pathway [30], [31], [32], [33]; og PI-3K /Akt /mTOR-medierede signaler kan kanaliseres gennem HIF og Sp1 [46], [47], to store transkriptionsfaktorer til VEGF udtryk [25], [48].

I foreliggende undersøgelse, finder vi, at raptor, som er en del af mTORC1 er kritisk for CNI-induceret VEGF transkriptionel aktivering. Vi viser, at CNI /Ras-induceret og PKC-medierede overekspression af VEGF i humane nyrecancerceller involverer PRAS40, en negativ regulator af mTORC1 [34], [40], [41]. CNI behandling samt aktivering af Ras og PKC fremmer phosphorylering af PRAS40, hvilket kan føre til induktion af mTOR-signalvejen. Vores undersøgelse tyder rolle H-Ras i reguleringen PRAS40 phosphorylering; men vi kan ikke udelukke roller andre to Ras isoformer (K-Ras og N-Ras) i denne proces. Vi har tidligere påvist, at CNI behandling medierer en hurtig progression af human renal tumor gennem VEGF-induceret angiogenese [22]; her viser vi, at ekspressionen af ​​phospho-PRAS40 markant forøget i disse renale tumorvæv efter CNI behandling. Overekspressionen af ​​PRAS40 signifikant reduceret CNI- og Ras-induceret VEGF transkriptionel aktivering. Således er vores undersøgelse viser tydeligt, at mTOR er en kritisk signalmolekyle i CNI-induceret tumorigen pathway (s), der kan føre til VEGF-overekspression i nyrekræft.