PLoS ONE: UGT1A6 Polymorphisms moduleret Lung Cancer Risk i en kinesisk Population

Abstrakt

uridin diphosphoglucuronosyltransferases (UGT’er) 1A6 er det eneste UGT1A isoform udtrykt i lungevæv. Den er ansvarlig for afgiftning af kræftfremkaldende stoffer såsom benezo [a] pyren fra cigaretrøg. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere associeringen af ​​UGT1A6 polymorfier og haplotyper med risiko lungekræft og vurdere den funktionelle betydning af UGT1A6 polymorfier. Genomisk DNA blev isoleret fra leukocytter. Otte UGT1A6 polymorfier blev sekventeret i en test sæt af 72 kinesiske lungekræftpatienter og 62 raske kontrolpersoner. Potentiel risiko modificerende alleler blev valideret i et separat sæt 95 kinesiske lungekræftpatienter og 100 raske kontrolpersoner. UGT1A6 19T G, 541A G og 552a C viste signifikant sammenhæng med øget risiko lungekræft, mens UGT1A6 105C T og IVS1 + 130G T markant var forbundet med nedsat risiko lungekræft. Multivariat logistisk regressionsanalyse viste en signifikant sammenhæng for lungekræft med UGT1A6 541A G (OR: 3,582, 95% CI: 1,27-10,04, p = 0,015), 552a C (OR: 5,364, 95% CI: 1,92-14,96, p = 0,001) og IVS1 + 130G T (OR: 0,191, 95% CI: 0,09-0,36, p 0,001). Funktionel test viste, at UGT1A6 105C T øget mRNA stabilitet, hvilket giver en plausibel forklaring på sit samarbejde med nedsat risiko lungekræft. Således UGT1A6 polymorfismer kan anvendes til at identificere personer med forøget risiko for at udvikle lungekræft

Henvisning:. Kua L-F, Ross S, Lee S-C, Mimura K, Kono K, Goh B-C, et al. (2012) UGT1A6 Polymorphisms moduleret Lung Cancer Risk i en kinesisk Befolkning. PLoS ONE 7 (8): e42873. doi: 10,1371 /journal.pone.0042873

Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal

Modtaget: Marts 12, 2012; Accepteret: 12 Juli 2012; Udgivet: August 17, 2012 |

Copyright: © Kua et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Healthcare Group (Singapore) lille innovative tilskud [NHG-SIG /06007]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for mere end 85% af de primære lungekræft og cirka to tredjedele af NSCLC patienter er diagnosticeret på et fremskredent stadium. Cigaretrygning er blevet forbundet med lungekræft [1] – [4], havde og over 60 kræftfremkaldende stoffer blevet identificeret i cigaretrøg [5] – [7]. Af disse benzo [a] pyren (BaP) og 4- (Methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon (NNK) er de mest studerede. Metabolisk aktivering af BaP og NNK af cytokrom P450 enzymer resulterer i dannelsen af ​​mere reaktive metabolitter, der kan binde kovalent til DNA, et vigtigt skridt i lungekræft induktion [8] -. [10]

uridin diphosphoglucuronosyltransferases ( UGT’er) tilhører en superfamilie af enzymer der er ansvarlige for afgiftende mange endobiotics og miljøfremmede stoffer [11]. UGT’er er ansvarlige for afgiftning af BaP og NNK [12] – [15]. Lavere glucuronidering aktivitet var blevet impliceret i lungekræft modtagelighed [16]. Desuden har genetiske polymorfier i UGT’er korreleret med risiko og forekomsten af ​​forskellige cancere, herunder lungecancer [12], [17] – [20]. Blandt alle UGT1A isoformer, var UGT1A6 vist sig at være den eneste UGT1A isoform udtrykt i lungevæv [21].

Vi antager, at polymorfier i UGT1A6 kan påvirke evnen til at afgifte lungekræft kræftfremkaldende stoffer og modulere lungekræft risiko . Her præsenterer vi resultaterne af en case-kontrol undersøgelse ved hjælp af 2 forskellige kohorter og funktionelt karakteriseret UGT1A6 105C . T polymorfi

in vitro

Materialer og metoder

Study befolkning

blev analyseret i alt 167 kinesiske sager lungekræft og 162 kinesiske raske kontrolpersoner fra 2 uafhængige kohorter. Den første gruppe består af 72 lungekræftpatienter og 62 raske kontrolpersoner fra Cancer Center og Blood Donation center fra National University Hospital, Singapore, hhv. En anden gruppe bestod af 95 lungekræftpatienter og 100 kontroller fra 4 kliniske undersøgelser og blev brugt som validering sæt. Emnerne i denne kohorte var lungekræftpatienter fra to terapeutiske fase II studier (n = 44 og 14 henholdsvis) og en germline biomarkører undersøgelse (n = 37) og støtteberettigede kræft-fri kontrol fra en case-kontrol undersøgelse af familiær kolorektal cancer i Singapore. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af institutionelle ethnics gennemgang bord på Rigshospitalet, Singapore, og alle forsøgspersoner forudsat skriftligt informeret samtykke.

Dataindsamling

I den første kohorte, forsøgspersoner var interviewet personligt af uddannede læger, der brugte en struktureret spørgeskema. Demografiske oplysninger, herunder alder, køn, rygning status, pakke års rygning og histologiske celletype blev indsamlet til alle fag. Lignende oplysninger for den anden kohorte blev hentet fra case optegnelser, og oplysninger om rygning status for kontrollen blev ikke opnået. Rygning status blev kategoriseret i aldrig-ryger, ex-ryger og aktuelle ryger. Histologisk celletyper blev kategoriseret i tre grupper, nemlig adenocarcinom, pladecellekræft og dårligt differentieret karcinom.

Single (SNP) genotype

Otte SNPs, som var relativt almindelige i den asiatiske befolkning baseret på tidligere litteratursøgning, blev udvalgt til denne undersøgelse. Af de fire varianter i exon 1, tre var kodning (cSNPs) resulterer i aminosyreændringer, UGT1A6 19T G (S7A), 541A G (T181A) og 552a C (R184S), hvorimod UGT1A6 105C T var en synonym variant. De resterende tre sekvens varianter i 5 ‘regulatoriske region inkluderet 2 SNPs, UGT1A6 -556C T og -427G C, og en deletionsmutation -1310 til at -1306 slette (aggag). UGT1A6 intron variant IVS1 + 130G . T blev også studeret

Genomisk deoxyribonukleinsyre (DNA) blev ekstraheret fra buffy coat fraktioner ved hjælp Puregene DNA oprensning kit (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA). Kvaliteten og mængden af ​​DNA blev vurderet af NanoDrop (ND-1000 spektrofotometer). Alle DNA har en A

260 /A

280 ratio på 1,7-1,9. Genotypebestemmelse blev udført ved hjælp Pyrosekventering. For Pyrosekventering assays, blev en positiv og en negativ kontrol inkluderet i hver plade med 96 brønde. Kort fortalt blev primere designet ud fra UGT1A6 sekvens. PCR primerne og sekventeringsprimere blev konstrueret under anvendelse Pyrosequencing Assay Design Software (version 1.0.6: Biotage AB, Uppsala, Sverige). BLAST analyse blev udført for at bekræfte specificiteten af ​​primerne for hver exon. Detaljer for primersekvenser og PCR-betingelserne er anført i tabel S1. 250 ng genomisk DNA ved 50 ng /pl blev anvendt til hver PCR-reaktion og PCR-produkter blev derefter underkastet pyrosekventering med PyroMark ™ ID indretning (Pyrosequencing, Uppsala, Sverige). Validation trin blev udført af direkte sekventeringsreaktioner ved hjælp af ABI Prism® BigDye ™ terminator v 3.1 cyklus sekventering kemi

plasmidkonstrukter

Funktionelle undersøgelser af ikke-synonyme polymorfier (UGT1A6 19T . G, 541A G og 552a C) er blevet gjort, mens IVS1 + 130G T er en intron SNP, derfor har vi valgt UGT1A6 105C T, som er et synonym polymorfi for vores funktionelle test. For at vurdere, om UGT1A6 105C T har nogen indflydelse på UGT1A6 aktivitet, varianten 105TT blev genereret. Kort fortalt blev plasmidvektor kodning fuld længde UGT1A6 * 1 sekvens venligst stillet til rådighed af Dr. Michael H. Court (Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts). Den UGT1A6 kodende region blev subklonet i pcDNA 3.1 V5 /His Topo ekspressionsplasmid vektor (Invitrogen). BLAST-analyse blev udført for at bekræfte UGT1A6 sekvensen af ​​plasmidet. Plasmidet blev derefter anvendt som skabelon til at generere substitution ved nukleotid 105 ved hjælp af GeneEditor

in vitro

stedorienteret mutagenese-system (Promega) med den angivne primer 105CT (5′-5Phos /ccc TCA GGA TGG AAG cca c-3 ‘) og primer Bottom Strand (medfølger). Alle DNA-konstruktioner blev verificeret ved sekvensanalyse. Kort fortalt, HEK293-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium tilsat 10% føtalt bovint serum og 50 U /ml penicillin (Gibco) i en fugtig atmosfære af 5% carbondioxid ved 37 ° C. Stabile transfektioner af plasmidet i HEK293-celler blev udført ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ved et reagens til DNA-forhold på 3:01 i Opti-MEM® I Reduceret Serum Medium (Gibco). Alle transfektionsforsøg blev udført i tre eksemplarer.

RNA stabilitet assay

Vi næste undersøgt den mulige virkning af varianten UGT1A6 105TT på mRNA stabilitet. 10 ug /ml actinomycin D (Sigma) blev påført cellekulturerne dyrket natten over, og celler blev høstet med valgte intervaller op til 24 timer. Af RNeasy Plus Mini kit (Qiagen) blev anvendt til at ekstrahere total RNA fra transficerede celler, før og efter inkubering med actinomycin D.

Kvantificering af transkripter

RNA blev isoleret fra 5 × 10

5-celler på de angivne tidspunkter (0, 2, 4, 8 og 24 timer) efter behandling med ActD og blev revers transkriberet til cDNA ved anvendelse af SuperScript III (Invitrogen). PCR-reaktionen blev derefter udført omfattende følgende: 1 pi cDNA, 10 pM af hver primer (UGT1A6: 5′-cagctgtcctcaagagagatgtgga-3 ‘og 5′-ccaatgaagaccatgttgggc-3′, GAPDH: 5’-tgaaggtcggagtcaacggatttggt-3 ‘og 5 ‘-catgtgggccatgaggtccaccac-3’) og 2 × Power SYBR Green Master Mix (som omfatter SYBR Green farvestof, Taq Polymearse, ROX, og dNTP) i et endeligt volumen på 20 pi. Tom vektor-transficerede celler blev anvendt som kontrol med data normaliseret ved GAPDH-ekspression. Alle PCR-reaktioner blev udført i triplikater.

Western blotting

Vi undersøgte endvidere virkningen af ​​varianten UGT1A6 105TT på proteinstabilitet. Behandlede celler blev lyseret og proteinkoncentrationer blev målt. Proteiner (7,5 ug /brønd) blev løst med 4 til 15% gradient SDS-polyacrylamidgelelektroforese (Invitrogen), efterfulgt af overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) mikroporøs membran (Millipore, Billerica, MA, USA) blokeret i PBS med 5% mælk. Efter blokering blev membranen probet under anvendelse af et kanin-anti-humant UGT1A6 primært antistof fortyndet 1:1000 (WB-UGT1A6, BD Gentest, Woburn, MA) og et gede-anti-kanin peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:10,000 fortyndet) . Blots blev afbildet af ECL reagenser (ECL Prime, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sverige) og ved film processor (Konica SRX 101). Resultaterne er fra to uafhængige forsøg.

enzymassay

Serotonin blev anvendt som substrat som det påvist substratspecificitet til UGT1A6 [22], [23], men en anden platform metode blev anvendt i denne undersøgelse. 0,01 mg af proteiner blev underkastet 384-brønds sort plade (Corning, NY) med Transcreener ® HTS fluorescensintensitet (FI) Assay kit (Bellbrook Labs, Madison, WI). Hver enzymreaktionen udførtes der omfatter følgende: 50 mM HEPES (pH 7,5) indeholdende NaCI (100 mM), MgClz

2 (4 mM), EGTA (2 mM), 0,01% Brij-35, dithiothreitol (DTT ; 2 mM), DMSO (1%), UDPGA (5 mM) og med varierende koncentrationer af serotonin (Sigma) 0,5-30 mM i et slutvolumen på 25 pi. Pladen blev inkuberet ved stuetemperatur i 45 minutter og reaktionerne blev standset ved tilsætning af 25 pi iskold methanol. Pladen blev derefter læst på en Tecan Infinite M200 pladelæser. Alle enzymreaktioner blev udført i triplikater. De første udlæsninger blev omdannet til mængden af ​​UDP dannet ved anvendelse af GraphPad Prism at interpolere disse værdier fra UDPGA /UDP standardkurver. Michaelis-Menten-kurver blev genereret under anvendelse af GraphPad Prism. Afbildede data er fra to uafhængige forsøg, og resultaterne er præsenteret som middelværdier ± S.D. af tre eksemplarer.

Statistiske Analyser

Case-kontrol forskelle i baseline-karakteristika blev evalueret ved hjælp af t-test (for kontinuerte variable) og Chi-square test (for kategoriske variable). Odds ratio (OR) blev afledt fra Chi-square test, og 95% konfidensintervaller (CI) i OR fik. Sammenhængen mellem SNPs med alder, køn, rygning status og TNM stadier blev testet i lungekræft fag ved hjælp af chi-square test. Alle statistiske analyser, herunder univariate og multivariat logistisk regressionsanalyse blev udført ved hjælp af SPSS-version 11.5 (SPSS Inc., Chicago, Ill., USA). Hardy-Weineberg ligevægt test, koblingsuligevægt analyse (betegnet som D ‘), og case-kontrol haplotypeanalyse (permutation test) blev beregnet ved hjælp SNPAlyze ver.7.

Resultater

Karakteristik af patienter og kontroller

Baseline karakteristika for patienter med lungecancer og kontrol af begge kohorter er sammenfattet i tabel 1. Der var en statistisk signifikant forskel i alder, køn og rygning status mellem patienter med lungecancer og raske kontrolpersoner, med flere mandlige (p = 0,003) og rygere (p 0,001) i lungekræft gruppen. Sammenlignet med raske kontrolpersoner, patienter med lungekræft, var generelt ældre (p = 0,04). Adenocarcinom var den mest almindelige histologiske undertype, der tegner sig for 60% i patienter med lungecancer. Der var ingen signifikant forskel i baseline karakteristika for patienter med lungecancer og raske kontrolpersoner mellem test og validering kohorter (data ikke vist).

genotype og allelfrekvenserne af UGT1A6 polymorfier (tabel 2)

af de otte genotypede SNP’er blev fem signifikant associeret med risiko lungekræft, når de testes i den første kohorte bestående af 72 lungekræftpatienter og 62 kontroller. UGT1A6 19T G, 541A G og 552a C var forbundet med øget risiko lungekræft, mens UGT1A6 105C T og IVS1 + 130G T var omvendt forbundet med risiko lungekræft. UGT1A6 19T G, 541A G og 552a C var almindelige i patienter med lungecancer med mindre allelfrekvenserne af 38%, 45% og 48% henholdsvis

Disse 5 SNPs blev yderligere vurderet i den anden kohorte bestående. af 95 kinesiske lungekræftpatienter og 100 kinesiske umatchede kontroller. UGT1A6 19T G, 541A G og 552a C forblev forbundet med øget risiko lungekræft, og UGT1A6 105C T og IVS1 + 130G T forblev signifikant associeret med reduceret risiko lungekræft

Bestemmelse af faktorer forbundet. selvstændigt med lungekræft: univariate og multivariate analyser

for at bestemme faktorer forbundet med risiko lungekræft, vi først brugt univariat analyse og identificeret følgende faktorer: alder, køn, rygning status, og fem SNP’er (tabel 3). Efter justering for covariables identificeret ved univariate analyse ved hjælp multivariat analyse fandt vi kun ryge status (OR: 3,385, 95% CI: 1,86-6,15, p 0,001), UGT1A6 541A G (OR: 3,582, 95% CI: 1,27-10,04 , p = 0,015), 552a C (OR: 5,364, 95% CI: 1,92-14,96, p = 0,001) og IVS1 + 130G T (OR: 0,191, 95% CI: 0,09 til 0,36, p 0,001) var uafhængig prædiktiv faktor for risikoen lungekræft.

Hardy-Weinberg ligevægt, koblingsuligevægt (LD) og haplotypeanalyse

Yderligere analyse af det sæt dna polymorfier, der nedarves sammen, også kendt som haplotyper blev udført med følgende results.UGT1A6 19T G og IVS1 + 130G T viste signifikant afvigelse fra Hardy-Weinberg ligevægt blandt kontroller. UGT1A6 552a C var i tæt LD med UGT1A6 541A G (D ‘= 0,9706, r

2 = 0,7795) hos patienter med lungecancer. UGT1A6 105C allelen blev stærkt knyttet til UGT1A6 541G og 552a allel i kontrol (tabel 4). Tabel 5 opsummerer haplotypefrekvenser af case-kontrol sammenligninger fra permutation tests. UGT1A6 541A G blev udelukket fra denne analyse, fordi det var i tæt LD med 552a C. Ti unikke haplotyper kunne udledes under anvendelse af 4 risiko modificerende alleler, med data censureret på frekvens på 1%.

Blandt disse fem haplotyper viste signifikant p-værdi i permutation test, hvoraf , tre blev forbundet med øget risiko lungekræft. Haplotype # 2 indeholder to risikofaktorer alleler af UGT1A6 19G og 552C havde en højere OR af 13,57 (95% CI: 6,15-29,93) sammenlignet med haplotype # 4 (OR: 2,65, 95% CI: 1,26-5,59), der indeholder en risiko allel af UGT1A6 552a og haplotype # 6 (OR: 2,35, 95% CI: 1,23-4,48), der indeholder to risikofaktorer alleler af UGT1A6 19G og 552C, og en ‘beskyttende’ allel af UGT1A6 intron 1 + 130T. To haplotyper var forbundet med nedsat risiko lungekræft, herunder haplotype # 3 (OR: 0,23, 95% CI: 0,12-0,43) og haplotype # 7 (OR: 0,13, 95% CI: 0,04-0,44).

In vitro funktionel karakterisering af variant UGT1A6 105TT

In vitro

blev mRNA stabilitet testet efter blokering transskription ved at behandle celler med actinomycin D (ActD). Variant UGT1A6 105TT mRNA var mere stabil end vildtype med signifikant højere mRNA-niveau observeret efter 4 timer (p = 0,039) og 8 timer (p = 0,004) efter behandling med ActD (figur 1A). Øget stabilitet variant UGT1A6 105TT mRNA resulterede i højere protein-ekspression og enzym aktivitet sammenlignet med vildtype på 48 timer efter behandling med ActD (figur 1B, C og D).

UGT1A6 * 1 og UGT1A6 105TT konstruktioner var stabilt transficeret ind HEK293-celler. (A) Celler blev høstet ved behandling med ActD på forskellige tidspunkter peger op til 24 timer. De data, afbildede er tid kursændringer i den resterende mængde af UGT1A6 mRNA efter ActD behandling. Der var signifikant højere mRNA-niveauet i UGT1A6 105TT end UGT1A6 * 1 transficerede celler efter 4 timer (p = 0,039) og 8 timer (p = 0,004) efter behandling med ActD. (B) Western blot analyse. Cellelysat anvendte var fra 5 × 10

5-celler på de angivne tidspunkter (0, 8, 24 og 48 timer) efter behandling med ActD. Der var en nedregulering i proteinekspression i UGT1A6 * 1 i forhold til UGT1A6 variant på 48 timer efter behandling med ActD. UGT1A6 aktivitet vurderet ved vurdering produktionen af ​​serotonin glucuronid hjælp lysat fra variant UGT1A6 (VT) og UGT1A6 * 1 (WT) ved 0 time (C) og 48 timer (D) efter ActD behandling, med substratkoncentrationer varierede fra 0,5 til 30 mM serotonin. Aktiviteter udtrykkes som reaktion hastighed (nanomol af serotonin glucuronid dannet pr minut pr milligram protein).

Diskussion

Dette er den første undersøgelse til at beskrive sammenhængen mellem UGT1A6 polymorfier og lunge kræft. Den UGT1A6 gen er ansvarlig for afgiftning af kræftfremkaldende stoffer såsom BaP fra cigaretrøg [13] – [15]. Kvantitative eller kvalitative ændringer i UGT1A6 udtryk kan påvirke hastigheden af ​​glukuronidering, og derved modificere risikoen for at udvikle lungekræft.

Flere polymorfier er blevet rapporteret i 5′-regulatoriske region, exon 1 og introns af UGT1A6 [24 ], [25]. Blandt disse, tre ikke-synonyme polymorfier ved codon 7, 181 og 184 (UGT1A6 19t G, 541A G og 552a C), under ét benævnt UGT1A6 * 2, blev den mest almindeligt undersøgt. Det er klassificeret som en “lav aktivitet ‘variant i flere phenolforbindelser, herunder aspirin [26] og er forbundet med reduceret kolorektal adenom i fag tager langsigtet aspirin [27].

I denne undersøgelse havde vi vist, at personer med UGT1A6 * 2 (haplotype # 2 og 6) havde øget risiko for lungekræft. Vores konklusion var i overensstemmelse med en rapport med reduceret glukuronidering aktivitet hos personer med UGT1A6 * 2 allel sammenlignet med vildtype [26]. Krishnaswamy

et al

også påvist 50% lavere UGT1A6 mRNA-niveauer (p = 0,026) i bærere af UGT1A6 19T . G polymorfi i forhold til ikke-bærere, men uden signifikant virkning på indhold UGT1A6 protein eller glucuronideringsprocesser aktiviteter [24]. Det skal bemærkes, at der var modstridende rapporter fra mindst 2 undersøgelser, hvilket antyder øget enzymaktivitet i UGT1A6 * 2 allozymes [28], [29]. Men den øgede aktivitet i variant UGT1A6 allozyme ikke udslag i øget substrat clearance i variant humane levermikrosomer [29]. Det er sandsynligt, at bortset fra enzymaktivitet kan mRNA nedbrydning ansvarlig for variabilitet i UGT1A6 aktivitet

To polymorfier UGT1A6 105C . T og IVS1 + 130g T blev fundet at være forbundet med nedsat risiko lungekræft . The UGT1A6 105C T er en synonym SNP, der er placeret i exon 1 af UGT1A6 genet. Selv polymorfien ikke resulterer i kvalitativ ændring af UGT1A6, vores

in vitro

resultater har vist, at T-allelen er forbundet med øget mRNA-stabilitet og høj UGT1A6 aktivitet i variantprotein sammenlignet med vildtype. Dette kan forklare den beskyttende virkning af UGT1A6 105 T allel i at reducere risikoen for lungekræft. Desuden den beskyttende virkning af UGT1A6 105C T kan skyldes dens inverse sammenkædning med UGT1A6 * 2 (UGT1A6 541A G og 552a C).

UGT1A6 IVS1 + 130G T fandtes at være den kun SNP forbundet med nedsat risiko for lungekræft i multivariat analyse. Det er uklart, hvordan UGT1A6 IVS1 + 130G T modulerer lungekræft risiko, da det er placeret i den første intron region af UGT1A6 genet. In-silico analyse ved hjælp af menneskelige Splejsning Finder programmet (https://www.umd.be/HSF/) foreslog, at denne SNP ikke påvirkede nogen konserverede nukleotider i branchen site i intron region (data ikke vist) og ville være næppe påvirke splejsning aktivitet

Selvom vi fundet UGT1A6 IVS1 + 130G . T for at være i moderat bindingsuligevægt med UGT1A6 541A G (betegnet som UGT1A6 * 5), kan det ikke forklare den beskyttende effekt observeret. Mens UGT1A6 er den fremherskende UGT1A isoform udtrykt i lunge, andre UGT1A isoformer (UGT1A1 og 1A9) udtrykt i leveren kan fortsat påvirke den systemiske clearance af kræftfremkaldende stoffer, der er forbundet med cigaretrygning [30], [31].

Det er muligt, at IVS1 + 130G T kan være i bindingsuligevægt med polymorfier i andre UGT1A isoformer, der spiller en beskyttende rolle i fare lungekræft. . F.eks Saeki

et al

[32] viste, at UGT1A6 IVS1 + 130G T er i tæt LD med UGT1A9 * 22, en høj enzymatisk aktivitet allel, som er kendt for at øge transkription. Desuden har UGT1A6 blevet påvist at være i bindingsuligevægt med UGT1A1 og UGT1A7 [33] – [36]. Selvom det ikke er udtrykt i lunge, har disse UGT isoformer vist sig at være vigtige i clearance af BaP [30], [31].

Den største styrke i denne undersøgelse er, at vores fund blev valideret i en uafhængig kohorte. Analysen var begrænset til én etnisk gruppe til at minimere sandsynligheden for falsk-positive resultater på grund af befolkningens heterogenitet. Der er dog flere begrænsninger i vores undersøgelse, at vi anerkender. For det første blev de lungekræftpatienter og raske kontrolpersoner ikke modsvares for alder, køn og rygevaner. For det andet to SNP’er, UGT1A6 19t G og IVS1 + 130g T afveg fra Hardy Weinberg ligning. Afvigelse fra Hardy Weinberg ligning kan være forårsaget af genotypebestemmelse fejl [37], [38]. Vi havde taget foranstaltning at udelukke genotype fejl ved hjælp af både pyrosekventering og direkte sekventering metode til at identificere de variant SNPs i vores undersøgelse fag.

Som konklusion, denne undersøgelse tyder på, at UGT1A6 polymorfier kan modulere lungekræft risiko. UGT1A6 105C T blev påvist at øge mRNA stabilitet, hvilket giver en plausibel forklaring på sit samarbejde med nedsat risiko lungekræft. Vores undersøgelse tyder på, at UGT1A6 genotype kan integreres i lungekræft screening strategi til at hjælpe med at identificere sårbare grupper.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Liste over PCR og sekventeringsprimere. Liste over alle anvendte primere til at forstærke og rækkefølge, hver af de otte UGT1A6 SNP’er vises, med oplysninger om SNP rsid og deres lokalisering forudsat. Størrelsen af ​​PCR-produkter og annealing temperatur i hver PCR-reaktion er også vist. Biotinylerede primere til pyrosekventering assay er angivet med §

doi:. 10,1371 /journal.pone.0042873.s001

(DOC)

Tak

Vi takker Dr.Michael H. Retten (Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts) for at give os plasmidvektor kodning fuld længde UGT1A6 * 1 sekvens.