PLoS ONE: En funktionel Nuclear epidermal vækstfaktor receptor, Src og Stat3 heteromerkomplekset i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Beviser præsenteres for den nukleare tilstedeværelse af en funktionel heteromerkompleks af epidermal vækstfaktor (EGFR), src og Signal Transducer og Activator af transskription (Stat) 3 proteiner i bugspytkirtelkræftceller. STAT3 forbliver nukleare og forbundet med Src eller EGFR henholdsvis på siRNA knockdown af EGFR eller Src, hvilket viser modstanden af ​​komplekset til modulation af EGFR eller Src alene. Betydeligt, chromatin immunoprecipitation (chip) analyser afslører den nukleare EGFR, er Src og Stat3 komplekset bundet til c-myc-promotoren. SiRNA knockdown af EGFR eller Src, eller den farmakologiske inhibering af Stat3 aktivitet kun marginalt undertrykt c-myc-ekspression. Derimod samtidig modulation af Stat3 og EGFR, eller Stat3 og Src, eller EGFR og Src stærkt undertrykt c-myc-ekspression, hvilket viser, at det hidtil ukendte nukleare heteromerkompleks uløseligt regulerer c-myc-genet. Forekomsten af ​​transkriptionelt funktionel EGFR, Src, og Stat3 nukleare kompleks giver en ekstra og ny mekanisme til at støtte kræft i bugspytkirtlen fænotype og forklarer til dels den ufølsomhed af bugspytkirtelkræftceller til hæmning af EGFR, Src eller Stat3 alene.

Henvisning: Jaganathan S, Yue P, Paladino DC, Bogdanovic J, Huo Q, Turkson J (2011) En funktionel Nuclear epidermal vækstfaktor receptor, Src og Stat3 heteromerkomplekset i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 6 (5): e19605. doi: 10,1371 /journal.pone.0019605

Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: November 30, 2010; Accepteret: April 12, 2011; Udgivet: 5 maj 2011

Copyright: © 2011 Jaganathan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute Grants CA106439 (JT) og CA128865 (JT), Florida Department of Health Bankhead-Coley Foundation (Bridge Grant) (HQ), delvis støtte fra World Gold Council (GROW Program) (HQ), og den National Natural Science Foundation of China Overseas Young Investigator Award (20828006) (HQ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mange intracellulære biokemiske processer er udløst af samlingen af ​​proteiner i makromolekylære komplekser. Sammenhængen mellem proteiner eller proteiner med andre molekylære enheder modulerer proteinkonformation, at tilvejebringe et middel til at regulere det utal af biokemiske processer, der tjener til effektiv håndtering af vitale biologiske reaktioner. Protein dynamik og menneskehandel, og protein stabilitet er også processer, der kan moduleres af sammenslutningen af ​​proteiner med andre. I bredere forstand, inter-molekylære foreninger tillader specialkemikalier proteiner, såsom receptorer, adaptere, enzymer og transkriptionsfaktorer til forskelligt modulere intracellulære begivenheder, og dermed skabe den mangfoldighed i fysiologiske reaktioner og fremme sammenhæng afhængighed.

Under induktion af signaltransduktion, der er samling af forskellige proteiner, som hver har specifikke funktioner er vigtige for signaltransduktion og den ledsagende biologisk respons. Den traditionelle epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) signaltransduktionsvej inkorporerer aktiveringen af ​​mitogenaktiveret proteinkinase kinase (MEK) -mitogen-aktiveret protein kinase /ekstracellulært signal-reguleret kinase (Erk

MAPK) og fremmer mitogene respons [ ,,,0],1], [2]. EGFR induktion fremmer også aktiveringen af ​​signaltransducer og aktivator for transkription (STAT) familie af proteiner, der ligeledes har en central rolle i EGF-inducerede biologiske responser [1]. De STAT-proteiner er latente cytoplasmiske transkriptionsfaktorer, som aktiveres som reaktion på cellulær stimulering med cytokiner og vækstfaktorer [3] via phosphorylering af en kritisk tyrosyl rest (Tyr705 for Stat3). Den tyrosinphosphorylering af STAT’er medieres af tyrosinkinaser af vækstfaktorreceptorer og ved cytoplasmiske tyrosinkinaser, såsom Src og Janus kinase (Jaks) familier. Aktiverede STAT’er som dimerer i kernen binder til specifikke DNA-responselementer i promotorerne for målgener at inducere gentranskription. Mekanismen nukleare translokation for STAT’er har været genstand for nylig intens efterforskning. STAT3 nuklear translokation er blevet rapporteret at være medieret af anerkendelse og transport med importin-α og Ran-GTPase [4], og ved mekanismer, der involverer chaperoning af MgcRacGAP [5], EGF-receptor-medieret endocytose [6], og ved plasmamembran-associeret lipidklumper trafficking [7].

forekomsten af ​​mange hyperaktive signaltransduktionsveje, der understøtter cancerfænotypen er en stor udfordring for terapi. I forlængelse af den klassiske måde at fremme crosstalks mellem flere signalveje, makro-molekylære protein forsamlinger giver yderligere unikke mekanismer til at fremkalde begivenheder, som vil støtte den maligne fænotype. En sådan ikke-traditionel signalering mekanisme er blevet identificeret for EGFR, hvilket er blevet påvist i cellekernen og observeret at fungere som en transkriptionsfaktor [8], [9]. Undersøgelser afslørede yderligere de nukleare EGFR komplekser med Stat3 i brystcancerceller, og dette kompleks inducerer specifikke gener, herunder inducerbare nitrogenoxidsyntase (iNOS) [10]. Den ekstra EGFR funktion ville forværre sin rolle som et mitogen og en promotor af celleoverlevelse, som alle favorisere kræft. I den forbindelse samtidig afvigende aktivering af EGFR og nedstrøms signal mediatorer, herunder Src og Stat3, der opstår med høje frekvenser i humane kræftformer afspejler en generel signalering kompleksitet, der understøtter kræft fænotype. For eksempel med henvisning til pancreascancer, afvigende aktivering af EGFR forekommer i 30-50% af tilfældene [11], aktiveret c-Src bemærkes i mere end 70% af tilfældene, og ofte ledsager EGFR overekspression [12], mens afvigende STAT3-aktivering er også meget udbredt [13], [14], [15]. Vigtigere er det, vores nylige rapport, kræft i bugspytkirtlen er mere følsom over for den samtidige inhibering af afvigende Stat3 og EGFR eller Src [16] viser udnyttelsen af ​​multiple afvigende signalveje for vedligeholdelse af cancerfænotypen og hvordan dette påvirker modtagelighed for terapi. At udvide vores tidligere undersøgelser [16], vi søgte at undersøge den molekylære og funktionelle samspil mellem Stat3, EGFR og Src og de underliggende mekanismer for støtte af kræft i bugspytkirtlen fænotype. Vi heri bevis for en funktionel nuklear heteromert EGFR, Src og Stat3 kompleks i bugspytkirtelkræftceller, som fremmer induktion af c-myc-gen. Vores rapport er den første på identifikation af en nuklear EGFR, Src og Stat3 heteromerkompleks der fremmer c-myc-gen induktion. Forståelse af dynamikken i EGFR, ville Src og STAT3 molekylære interaktioner i bugspytkirtelkræft giver grundlag for at designe nye effektive multiple-målrettet terapi tilgange for kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Celler og reagenser

Den menneskelige pancreascancer, Panc-1 og Colo-357 linjer er alle blevet beskrevet tidligere [16], [17]. Den udødeliggjort menneskelige pancreas kanalen epitelcelle (HPDEC) linje var en slags gave fra Dr. Tsao, OCI, UHN-PMH, Toronto) [18]. HPDEC blev dyrket i keratinocyt-SFM medium suppleret med 0,2 ng EGF, 30 ug /ml oksehypofyseekstrakt og indeholdende antimycol. Alle andre celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 5% jern-suppleret bovint kalveserum og 100 enheder /ml penicillin-streptomycin.

Peptidsyntese

Stat3 SH2-domæne-peptid inhibitor (SPI), FISKERERAILSTKPPGTFLLRFSESSK, EGFR peptid motiver, pY1068EGFR (pY1068), PEpYINQS og pY1086EGFR (pY1086), PVpYHNQP blev indkøbt fra Peptide 2.0 (Fairfax, VA) på 95% renhed

Nuclear. Uddrag forberedelse og Gel Shift Analyser

Nuclear forberedelse ekstrakt fra cellerne blev udført som beskrevet tidligere [17].

Sub-cellulær fraktionering, og SDS-PAGE /Western blot analyse

Western blotting-analyse blev udført som tidligere beskrevet [19], [20] på helcellelysater, og om cytosoliske og membranfraktioner, og på kerneekstrakter. Subcellulære fraktioner blev fremstillet ifølge standard protokol. Kort fortalt blev cellerne vasket under anvendelse af PBS, resuspenderet og lyseret i buffer med lavt saltindhold (20 mM HEPES (pH 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4, 1 mM Na

4P

2O

7, 1 mM dithiothreitol, 1 mM TLA, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 0,5% Nonidet P-40), og centrifugeret (13.000 x

g

, 4 ° C, 30 s) for at opnå den cytosoliske fraktion. Pelleten blev vasket tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS), resuspenderet i høj salt buffer (420 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20% glycerol, 20 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4, 1 mM Na

4P

2O

7, 1 mM dithiothreitol, 1 mM TLA og 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid), inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter , med rocking, og centrifugeret ved (13.000 x

g

, 4 ° C, 30 min) for at opnå den nukleare fraktion (supernatant). Den opnåede pellet blev vasket tre gange med PBS, resuspenderet i RIPA-lysepuffer (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 1 mM TLA, og 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid), inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C med vipning, og centrifugeret (13.000 x g, 4 ° C, 20 min). Supernatanten blev opsamlet som membranfraktionen. Primære anvendte antistoffer er imod pY845EGFR (Upstate Biotech, Millipore, Billerica, MA), pY705Stat3, Stat3, pY1068EGFR, pY1086EGFR, pY1173EGFR, EGFR, pY416Src, Src, og β-actin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), og Tata- bindende protein (TBP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). De blokerende peptider blev indkøbt fra de respektive selskaber.

Små-interfererende RNA (siRNA) Transfektion

siRNA sekvenser for EGFR og Src blev bestilt fra Dharmacon RNAi Technologies, Thermo Scientific (Lafayette, CO) . Sekvenser anvendt er: EGFR sense-strengen, 5′-GAAGGAAACUGAAUUCAAAUU-3 ‘; EGFR antisense-streng, 5’-pUUUGAAUUCAGUUUCCUUCUU-3 ‘; kontrol siRNA sense-strengen, 5’-AGUAAUACAACGGUAAAGAUU-3 ‘; og styre siRNA antisense-strengen, 5’-pUCUUUACCGUUGUAUUACUUU-3 ‘. C-Src SMARTpool siRNA reagens (NM-005.417, Catalog # M-003175-01-05) blev anvendt til Src. Transfektion ind celler blev udført under anvendelse af 20 nM af EGFR siRNA eller 25 nM Src siRNA og 8 pi Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) i OPTI-MEM dyrkningsmedium (GIBCO, Invitrogen Corporation).

Immunopræcipitation (IP), og sekventiel immunopræcipitationsundersøgelser

Disse undersøgelser blev udført som tidligere beskrevet [21] ved brug helcellelysater eller kerneekstrakter (250 pg totalt protein) og 5 pi anti-EGFR eller anti-Src polyklonale antistof eller det monoklonale anti-Stat3 antistof (Cell Signaling Technology). For specificitet, immunoblotting-analyse under anvendelse af anti-EGFR, anti-Src og anti-Stat3 antistof blev udført i nærvær af den respektive blokerende peptid. Sekventielle IP undersøgelser blev udført ifølge offentliggjorte fremgangsmåder [10] med nogle modifikationer som følger: kerneekstrakter, fremstillet som tidligere beskrevet [21], blev underkastet en lignende immunpræcipitering med hensyn til det første primære antistof, anti-EGFR-antistof (Cell Signaling ) eller IgG (Santa Cruz) ved 4 ° C natten over. Den immunecomplex blev derefter pelleteret med 20 pi protein A /G agaroseperler (Santa Cruz), vasket tre gange ved anvendelse af vaskebuffer A (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 ), og derefter to gange med vaskebuffer B (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0). Derefter blev proteinerne elueret med frisk fremstillet elueringspuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO

3) og underkastes den anden immunofældning ved inkubering med anti-Src antistof eller IgG (Santa Cruz). Komplekserne blev derefter udfældet, vasket, elueret med lamelli puffer og derefter underkastet SDS-PAGE og Western blotting-analyse probing for Stat3.

immunofarvning med laser-scanning konfokal billeddannelse Salg

Panc-1-celler vokser på dækglas i 12-brønds plader blev behandlet med eller uden inhibitorer til 1 eller 24 timer og underkastet immunfarvning og fluorescens eller laser-scanning konfokal mikroskopi som tidligere beskrevet [21]. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, vasket tre gange med PBS, permeabiliseret med 0,25% Triton X-100 i 10 minutter, og vasket tre gange med PBS. Prøver blev derefter blokeret i 0,1% BSA i PBST i 30 minutter og inkuberet natten over ved 4 ° C med monoklonalt rotte-anti-EGFR (Santa Cruz), monoklonalt muse-anti-Src (Cell Signaling), og kanin polyklonalt anti-Stat3 (Cell Signaling ) antistoffer ved fortynding 1:50 (i 0,1% BSA). Efterfølgende blev cellerne skyllet tre gange i PBST, inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i mørke med 1:1000 fortyndinger af de tre AlexFluor sekundære antistoffer, ALexaFLuor405 (gede antimuse), AlexaFluor488 (æsel-anti-kanin) og AlexaFluor546 (gede-anti -rotte) (Molecular Probes, Invitrogen) for EGFR, Src og Stat3 detektion hhv. Prøver blev derefter vasket tre med PBST. Efterfølgende blev dækglassene fjernet og monteret på objektglas under anvendelse Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL) og forhindres tørring ved forsegling kanterne med søm maling. Objektglas blev opbevaret i mørke ved 4 ° C, indtil billeder blev taget. For negativ farvning blev sekundære antistoffer tilføjet uden de primære antistoffer. Konfokal analyse blev udført ved gennemgangen af ​​dias under Leica TCS SP5 konfokalmikroskop (Tyskland) med passende bølgelængder. Billeder blev taget til fange og behandles ved hjælp af Leica TCS SP 5-softwaren.

chromatin Immunfældning (chip) og sekventiel chip Analyser

For chip assay blev celler i kultur behandlet med formaldehyd i en endelig koncentration på 1%, i 10 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af behandling med glycin i en endelig koncentration på 0,125 M i 5 minutter ved stuetemperatur til tværbinding. Efterfølgende blev cellerne vasket med iskold PBS og resuspenderet i og lyseret med lysepuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4, 1 mM Na

4P

2O

7, 1 mM dithiothreitol), 1 x TLA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 5% Nonidet P-40 og centrifugeret. Derefter nukleare pellet blev resuspenderet i kerner lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS og proteaseinhibitorer) (Roche, Indianapolis, IN). De nukleare lysater blev ultralydbehandlet (Omni International, Kennesaw, GA) ved 30% effekt i 3 pulser for 10 s intervaller på is til Shear DNA. Kromatin opløsning blev præ-clearet med protein A /G agaroseperler (Santa Cruz) i 1 time ved 4 ° C med vipning. Så de forud klarede lysater blev immunfældet ved inkubering med anti-EGFR, anti-Src, eller anti-STAT3 antistoffer eller med IgG (uden antistof) (Santa Cruz) ved 4 ° C natten over med rocking. Komplekserne blev opsamlet med 20 pi protein A /G agaroseperler (Santa Cruz), vasket tre gange ved anvendelse af vaskebuffer A (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0) og to gange med vaskebuffer B (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0). Derefter komplekser blev elueret med frisk fremstillet elueringspuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO

3). Tværbindinger blev tilbageført ved opvarmning ved 65 ° C i nærværelse af NaCI efterfulgt af proteinase K-behandling (20 pi af en 20 mg /ml) i 6 timer. DNA’et blev udvundet og oprenset ved anvendelse af DNA-oprensningskit fra Qiagen (Valencia, CA). Den oprensede kromatin immunopræcipiteret DNA blev næste anvendt som en skabelon for polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation af c-myc-promotoren under anvendelse af primerne, Forward, 5’AAAAGGGGAAAGAGGACCTGG-3 ‘, og Reverse, 5′-TAAAAGGGGCAAGTGGAGAGC-3’ eller TWIST promotor ved hjælp af primere, Forward, 5’AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG -3 ‘

Omvendt:. 5’CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG -3′ (Invitrogen). PCR-produkterne, 133 bp for c-myc og 332-bp for TWIST [22] blev opløst på 2% agarosegel. De sekventielle chip undersøgelser blev udført som tidligere beskrevet [10] og efter de sekventielle immunopræcipitationsundersøgelser beskrevne anvendelse af den første primære antistof (anti-EGFR) og det andet primære antistof (anti-Src). De udvundne komplekser efter den sekundære immunofældning blev elueret med elueringsbufferen og derefter underkastet til chip assay som beskrevet.

Gelfiltreringskromatografi

færdigpakkede Superdex 200 10/30 GL glaskolonne blev købt fra GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). Kromatografien systemet anvendt i undersøgelsen var BioLogic Duoflow System (Bio-Rad, Hercules, CA). Kromatografien blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner med en generel run sekvens af ækvilibrering belastning, eluering, regenerering og opbevaring. RIPA buffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Nonidet P-40) blev anvendt som den mobile fase buffer. Prøver (Panc-1-cellelysat, 2 mg totalt protein i et volumen på 250 pi) blev påsat til kolonnen, hvorefter strømningshastighed blev indstillet til 0,25 ml /min, og derefter fraktion (500 pi) indsamling blev indledt lige efter at prøven lastning og overvåges af eluenten absorbans ved 280 nm. Ifølge absorbanstoppene blev fraktionerne 21-34 udvalgt og underkastet immunoblotting-analyse under anvendelse af antistoffer mod EGFR, Stat3, og Src (Cell Signaling), og imod RNA-helicase A (RHA) (Abcam, Cambridge, MA). For immunpræcipitationsassay, 100 pi hver af fraktionerne 23-27 blev puljet, hvorfra EGFR immunecomplex blev udfældet ved anvendelse af anti-EGFR-antistof (Cell Signaling) og underkastet immunblotting analyse for Stat3, Src og EGFR.

Fremstilling af anti-EGFR og mus IgG1-BNI sonder

Guld nanopartikler (BNI), 0,1 nM, med en diameter på 40 nm blev købt fra Ted Pella Inc. (Redding, Californien). Muse monoklonalt anti-EGFR [F4] antistof blev købt hos Abcam (kat. Nr. Ab62, konc. 1,2 mg /ml), og ikke-specifikt monoklonalt muse IgG1 blev indkøbt fra Sigma (kat. Nr. M9629, konc. 1 mg /ml). Polyklonalt anti-Stat3 (konc. 0,2 mg /ml), polyklonalt anti-Src (0,1 mg /ml), polyklonalt anti-EGFR (0,2 mg /ml) og ikke-specifik kanin IgG (0,4 mg /ml) blev indkøbt fra Santa Cruz. Alle andre kemikalier og buffer ingredienser til assayet udvikling blev indkøbt fra Sigma. Anti-EGFR-BNI probe blev fremstillet ved tilsætning af 10 pi monoklonalt muse-anti-EGFR-antistof til 1 ml BNI. Efter inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur blev proben blokeret med 2,5 mg BSA i 30 min. Efter centrifugering ved 10.000 rpm i 5 minutter, supernatanten blev kasseret, og nanopartikel remanensen gendispergeres i 0,5 ml 0,25% BSA i 10 mM phosphatpuffer (PB). Sonden blev derefter anvendt i assayet. Den negative kontrol muse IgG1-BNI probe blev fremstillet ved tilsætning af 10 pi monoklonalt muse IgG1 antistof til 1 ml BNI, og efter proceduren identisk med den, der anvendes til EGFR sonde forberedelse. Muse IgG1 blev anvendt her til at fremstille kontrolprobe, fordi anti-EGFR monoklonale antistof er et muse IgG1 typen antistof.

Detection og kinetiske binding undersøgelse af EGFR fra kerneekstrakt til BNI prober

Den kerneekstrakt prøve Panc-1 blev fortyndet i phosphatbuffer (PB) til 1 mg /ml totalt protein. I en prøvecelle til dynamisk lysspredning (DLS) måling (Hellma kuvette QS 3 mm), 20 pi anti-EGFR-BNI probe blev blandet med 2 gi af prøven, og stigningen partikelstørrelse blev aflæst med en DLS instrument (Zetasizer Nano ZS90 DLS-system, Malvern Instruments Ltd, England) ved præcis 1, 6, 11, 16, og 30 minutter efter blanding. Det samme eksperiment blev også udført ved hjælp af musen IgG1-BNI probe. For at bekræfte specificiteten af ​​det anti-EGFR-BNI probe til påvisning af EGFR fra kerneekstrakt blev en inhibering eksperiment udført ved at behandle 5 pi af prøven med 1 pi af monoklonalt anti-EGFR-antistof ved stuetemperatur i 7 min og 24 min før anvendelse af prøven i assayet. Efter denne inkubation blev 20 pi af anti-EGFR-BNI probe blandes med 2 pi af den behandlede prøve, og partikelstørrelsen blev aflæst ved 1, 6 og 11 min efter blanding.

Protein kompleks binding partner undersøgelse under anvendelse af polyklonalt antistof

i et 1,5 ml mikrocentrifugerør blev 80 pi af anti-EGFRGNP probe blandet med 8 pi af prøven. Efter inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur blev denne opløsning opdelt i fire 20 pi portioner. Efter overførsel til prøvecellen, blev partikelstørrelsen af ​​hver af disse portioner læses med en DLS instrument. Efter denne behandling blev opløsningen tilsat et polyklonalt antistof: enten med 1 pi anti-Stat3 eller 2 pi anti-Src eller 1 pi af anti-EGFR eller 0,5 pi kanin-IgG. Stigningen partikelstørrelse blev læst på præcis 5 min og 10 min efter start af førstebehandlingen.

Dynamic Light Scattering (DLS) målinger

DLS målinger af alle prøveopløsningerne blev udført ved hjælp af en Zetasizer Nano ZS90 DLS-system udstyret med en rød (633 nm) laser og en lavine fotodiode detektor (APD) (quantum effektivitet 50% ved 633 nm) (Malvern Instruments Ltd). DTS applikationer 5.10 software blev brugt til at analysere dataene. Den gennemsnitlige partikelstørrelse (Z-gennemsnit) af opløsningen blev opnået under anvendelse af en Cumulant metode. For hver prøve blev ti DLS målinger udført med et løb, og hver kørsel varede i 10 sekunder. Alle målinger blev udført i en 90 ° detektering vinkel.

Resultater

Påvisning af nukleare EGFR, Src og Stat3 heterokompleks

Vi søgte at undersøge signalering kompleks samling og dynamikken af samspillet mellem den hyperaktive Stat3, EGFR og Src [14], [16], [23] i forbindelse med den humane pancreascancer fænotype. Co-immunpræcipitering (co-IP) med immunoblotting analyse viser, EGFR immunecomplex fra Panc-1 eller Colo-357 helcellelysater indeholdt både Src og Stat3 (fig. 1A (i)), Src immunecomplex indeholdt både EGFR og Stat3 (Fig . 1A (ii)), mens Stat3 immunpræcipitat indeholdt EGFR og Src (fig. 1A (iii)). For specificitet, den ikke-specifikke kanin-IgG i immunpræcipitering og immunblotting analyse for Src, Stat3 eller EGFR viste ingen påviselig protein (fig. 1A, IgG, og data ikke vist), og immunoblotting analysen foretages på immun udfældes i nærvær af de respektive blokerende peptider (BP) viste en fuldstændig eller næsten fuldstændig blokering af immunsystemet påvisning af Stat3, Src eller EGFR, sammenlignet med niveauerne detekteret i fravær af de blokerende peptider (fig 1B (i) -. (iii), sammenligne + BP, underpanel til – BP, øvre paneler). Vi bestemt effekten af ​​siRNA knockdown af EGFR eller Src på den komplekse formation. Co-immunpræcipitering med immunoblotting studier af helcellelysater fra Panc-1-celler viste, at når EGFR knockdown af siRNA (Fig.1C (i), øvre bånd), forbliver Src immunecomplex forbundet med Stat3 (fig. 1C (i), IP: Src), og vice-versa (fig 1C (i.), IP: Stat3). Ligeledes når Src er knockdown af siRNA (. Figur 1C (ii), øvre bånd), forbliver EGFR immunecomplex forbundet med Stat3 (Fig 1C (ii), IP:. EGFR)., Og omvendt (Fig 1C (ii) , IP: Stat3). Scrambled (con) siRNA har ingen effekt. Disse resultater viser, at med hensyn til EGFR, Src og Stat3 heteromerkompleks, STAT3 proteiner forbliver forbundet med Src eller EGFR henholdsvis på siRNA knockdown af EGFR eller Src.

Immunblotting-analyser af immunecomplexes af EGFR (IP : EGFR), Src (IP: Src), og Stat3 (IP: Stat3), eller af ikke-specifikt IgG ikke-immunpræcipitat fremstillet ud fra hel-cellelysater af Panc-1 eller Colo-357-celler utransficerede (A og B) eller transficeret med EGFR siRNA, Src siRNA, eller kontrol (con) siRNA (C) og sondering for Src, Stat3 og EGFR i fravær (A og C) eller nærvær (B) af Stat3 blokerende peptid (Stat3 BP), Src blokerende peptid (Src BP) eller EGFR blokerende peptid (EGFR BP). Bånd svarende til proteiner i gelen er vist; input: medmindre andet er angivet, repræsenterer immunoblotting for det respektive immunopræcipiterede protein i den samme mængde lysat anvendt i assayet; Data er repræsentative for 3 uafhængige undersøgelser.

Vi spurgte, om den observerede EGFR, Src og Stat3 heteromerkompleks var til stede i kernen. Co-immunpræcipitering med immunoblotting analyse af nukleare ekstrakter viser, at EGFR immunecomplex indeholdt både Stat3 og Src (figur 2A (i), IP:. EGFR), immunecomplex Src indeholdt både Stat3 og EGFR (fig 2A (ii), IP:. Src) , mens Stat3 immunecomplex indeholdt både EGFR og Src (fig 2A (iii), IP:. Stat3). Disse data viste tilstedeværelsen af ​​EGFR, Src og Stat3 heteromerkompleks i kernen. For specificitet af de immunoreagenser, de ikke-specifikke kanin IgG pull-down prøver, der blev tilsvarende immunoblottet viste ingen påviselig EGFR, Src eller Stat3 (fig. 2A, IgG og data ikke vist). Immunblotting analyse sondering for Tata-bindende protein (TBP) bekræftede, at ekstrakterne, der anvendes i disse undersøgelser er af nuklear oprindelse (fig. 2A (iv)). Den heteromere kompleks blev valideret ved at udføre sekventielle immunpræcipitationsanalyse, hvorved EGFR immunecomplex (IP: EGFR) blev yderligere udsat for en sekundær immunpræcipitering under anvendelse af anti-Src antistof (IP: EGFR /IP: Src) og derefter immunoblottedes for EGFR og Stat3. Resultaterne af disse undersøgelser viste tilstedeværelsen af ​​EGFR og Stat3 i de sekventielle immunopræcipitater (Fig 2B, IP:. EGFR /IP: Src). Derimod IgG pull-down, der blev underkastet immunoblotting for EGFR eller Stat3 viste ingen påviselige niveauer (fig. 2B, IgG), hvilket yderligere bekræfter specificiteten af ​​immunoreagenser anvendte.

(A og B) Immunoblotting analyser af immunecomplexes af EGFR (IP: EGFR), Src (IP: Src), Stat3 (IP: Stat3), EGFR /Src (IP: EGFR /IP: Src), eller af ikke-specifik IgG ikke-immuneprecpitate fremstillet af nukleare ekstrakter af Panc-1 eller Colo-357-celler og sondering for Stat3, EGFR, Src, eller TATA-bindende protein (TBP); og (C), immunoblotting-analyse af membranen (MEM) og cytosoliske (CYTO) fraktioner og nuklear (nuc) ekstrakter fra Panc-1-celler sondering for (i) EGFR, (ii) Stat3 og (iii) Src. Bånd svarende til proteiner i gelen er vist; input: medmindre andet er angivet, repræsenterer immunoblotting for det respektive immunopræcipiterede protein i den samme mængde kerneekstrakt anvendt i assayet; IP: EGFR /IP: Src, sekventiel immunpræcipitation med anti-EGFR og derefter anti-Src antistof; Data er repræsentative for 3 uafhængige undersøgelser.

Tilstedeværelsen af ​​EGFR, Src og Stat3 kompleks i kernen af ​​bugspytkirtelkræftceller blev yderligere undersøgt ved at underkaste præparater kerneekstrakt til gelfiltreringssøjlekromatografi analyse (Superdex200 , udelukkelse begrænser 200 kD), som beskrevet i “Materialer og metoder”, sammenholdt med immunoblotting analyse. De opsamlede fraktioner, der viste peak absorbans ved 280 nm (data ikke vist) blev immunoprobed. Resultaterne viste, at EGFR-protein vises først i fraktionen 23 og er til stede sammen med Stat3 og Src, og de tre proteiner samtidig detekteret i fraktionerne 23-29 (fig. S1a). Resultaterne viste også påviselige STAT3 og Src proteiner i fraktionerne 30 til 32 godt efter EGFR blev fuldstændig elueret (fig. S1A). Analyse af tidligere rapporterede EGFR protein partner, RNA-helicase A (RHA) [24] viste også påviselige niveauer, der var overvejende i fraktionerne 23 og 24 (fig. S1a, RHA). Disse fraktioner blev yderligere underkastet co-immunudfældningsanalyse til at validere tilstedeværelsen af ​​komplekset. Immunoblotting-analyse af EGFR immunecomplex fremstilles ud fra de samlede fraktioner 23-27 yderligere viste tilstedeværelsen af ​​Src og Stat3 (fig. S1B). Den tidlige og den samtidige eluering af EGFR, Src og Stat3 hæve den mulighed, at hver af proteinerne er en del af en højere molekylvægt proteinkompleks, og også, at de tre proteiner associerede som en del af det samme kompleks, som foreslået af immunecomplex formation . Der har været en tidligere rapport om nuklear EGFR /Stat3 kompleks under betingelser cellulær stimulation af EGF [10]. Vi undersøgte således, om den nukleare EGFR, Src, Stat3 komplekset var til stede konstitutivt (uden ligand stimulation) i tumorceller. Immunblotting analyse ikke afsløre eventuelle væsentlige niveauer af Stat3 eller Src i EGFR immunecomplex eller Src eller EGFR i Stat3 immunopræcipitat fra de nukleare ekstrakter fremstillet af humant brystkræft, MDA-MB-231 og den menneskelige ikke-småcellet lungecancer, A549 linjer (fig. S1c), hvilket antyder en minimal mulighed for eksistensen af ​​en konstitutiv nukleart EGFR, Src, Stat3 kompleks i de to cancer celletyper. Disse undersøgelser viser for første gang, at EGFR, Src og Stat3 danner et heteromerkompleks i kernen af ​​bugspytkirtelkræftceller.

I betragtning påvisning af EGFR, Src og Stat3 kompleks i hel-celle og nukleare lysater vi var interesseret i at bestemme de relative niveauer samt størrelsen af ​​EGFR, Src og Stat3 i de forskellige sub-cellulære fraktioner. Membran og cytosoliske fraktioner, og kerneekstrakter blev fremstillet fra Panc-1-celler ifølge etablerede protokoller og som indebar anvendelse af 10% Nonidet P-40 lysis, og en saltfattig HEPES buffer udtræk til cytosolisk ekstrakt, en høj-salt HEPES buffer ekstraktion for kerneekstrakter (18, 22), og 0,5% SDS puffer til membranfraktionen. Immunoblotting analyse af prøver med ens totale proteinindhold fra de sub-cellulære fraktioner viser, at med hensyn til hver af EGFR, Src, eller Stat3 protein, størrelsen er den samme i membranen (MEM), cytosolisk (Cyto), eller nukleare fraktion (Nuc) (fig. 2C). Resultaterne viser endvidere, at niveauet for den samlede EGFR protein er højest i membranen, og er højere i den cytosoliske fraktion end i kerneekstrakt (fig. 2C (i)). Derimod viser resultaterne, at STAT3 er højest i den cytosoliske fraktion, og højere i kerneekstrakt, sammenlignet med de niveauer, der er forbundet med cellemembranen (fig. 2C (ii)). Resultaterne for Src viste også betydelige forskelle, med membranassocierede niveauer højere end både den cytosoliske og nukleare niveauer, som var næsten identiske (fig. 2C (iii)). S2.