PLoS ONE: MicroRNA-410 blænder Migration og Invasion ved Målretning MDM2 i Gastric Cancer

Abstrakt

mavekræft er en af ​​de hyppigste maligne sygdomme i tumorer i de østasiatiske lande. Indkredse prognostiske markører og effektive terapeutiske mål er vigtig i behandlingen af ​​gastrisk cancer. microRNA (miRNA) spiller en vigtig rolle i tumorigenese. Men de mekanismer, hvorved miRNA regulerer mavekræft metastaser forbliver dårligt forstået. I denne undersøgelse fandt vi, at niveauerne af MIR-410 i mavekræft og cellelinjer var meget lavere end i den normale kontrol henholdsvis og det lavere niveau af MIR-410 var signifikant associeret med lymfe-knude metastase. Transfektion af MIR-410 efterligner kunne signifikant inhibere celleproliferation, migration og invasion i HGC-27 gastriske cancercellelinier. I modsætning hertil knockdown af miR-410 havde den modsatte effekt på celleproliferation, migration og invasion. Desuden har vi også fundet, at MDM2 negativt reguleret af MIR-410 på post-transkriptionel plan, via en specifik målsted med 3’UTR af luciferase reporter assay. Ekspressionen af ​​MDM2 blev omvendt korreleret med MIR-410-ekspression i gastrisk cancer væv, og overekspression af MDM2 i MIR-410-transficerede gastriske cancerceller effektivt reddet inhiberingen af ​​celleproliferation og invasion forårsaget af MIR-410. Vores resultater viste således, at MIR-410 fungerede som ny tumor suppressor ved at målrette MDM2 genet og inhibering gastriske cancerceller proliferation, migration og invasion. Resultaterne af denne undersøgelse har bidraget til den nuværende forståelse af disse funktioner i miR-410 i mavekræft

Henvisning:. Shen J, Niu W, Zhou M, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) MicroRNA-410 blænder Migration og Invasion ved Målretning MDM2 i Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10,1371 /journal.pone.0104510

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: May 6, 2014 Accepteret: 9 jul 2014; Udgivet: 19 August, 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Anhui Provincial Natural Science Foundation (. NO 1208085QH169) https://220.178.98.52/zrkxjj/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forskellige strategier er blevet anvendt til behandling af gastrisk cancer (GC), som er den fjerde mest udbredte cancer og den næsthyppigste årsag til cancer dødsfald i verden [1], [2]. De fleste GC patienter er diagnosticeret på stadium III eller IV, og satsen for lymfeknude metastaser er høj [3], [4]. I dag, patienter med sen-fase GC er med en samlet 5 års overlevelse appoximately 20% [5]. Hertil, er det af stor klinisk værdi for yderligere at belyse de molekylære mekanismer involveret i GC metastaser og identificere nye markører for diagnose, prognose, og behandling for patienter med GC.

microRNA (miRNA) er små ikke-kodende RNA’er af -22 nukleotider i længden, der regulerer ekspressionen af ​​deres mål mRNA’er gennem translationel undertrykkelse eller mRNA-spaltning [6]. De er involveret i vigtige biologiske processer, herunder udvikling og differentiering [7], [8]. Den dysregulering af miRNA er korreleret til at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft og progression ved at regulere celleproliferation, differentiering, apoptose og carcinogesis [9], [10]. Afvigende ekspression af miRNA eller mutationer af miRNA gener er blevet godt undersøgt i mange typer tumorer, herunder lymfom, lunge, bugspytkirtel, leukæmi, bryst-, tyktarms- og leverkræft [11] – [15]. Imidlertid roller miRNA i GC forbliver stort set ukendt.

Tidligere undersøgelser har undersøgt rollen som MIR-410 i flere kræftformer. Gattolliat et al [16] .demonstrated at ekspressionen af ​​MIR-410 var signifikant associeret med sygdomsfri overlevelse af de ikke-amplificerede gunstig neuroblastom. Endvidere Chen på el [17] fandt, at ekspressionen af ​​MIR-410 blev reduceret i humane gliomer og tvungen ekspression af MIR-410 i gliomceller kraftigt inhiberede celleproliferation, invasion medieret af målretning MET. Desuden Chien et al [18] fandt, at MIR-410 reguleres negativt pRb /E2F-vejen ved direkte målretning CDK1, som var et onkogen i brystcancer. Dog stadig uklart, hvilken rolle MIR-410 i GC. I denne undersøgelse påviste vi, at nedsat MIR-410-ekspression er karakteristisk molekylær ændring i GC og undersøgte virkningen af ​​modulerede MIR-410 niveauer på fænotyper af GC cellelinier. Vi viste også, at miR-410 kan fungere som et onkogen ved direkte rettet mod MDM2.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle disse patienter enige om at deltage i undersøgelsen og gav skriftligt informeret samtykke. Både denne undersøgelse og samtykke blev godkendt af den etiske bestyrelsen for Anhui Provincial Hospital og overholdt Helsinki-deklarationen.

Menneskelige prøver

Menneskelig GC og deres tilsvarende ikke-tumorform gastriske prøver blev indsamlet på tidspunktet for kirurgisk resektion fra Anhui Provincial Hospital fra 2008 til 2009. skriftligt informeret samtykke blev opnået før samling. Den ene del blev fikseret med 10% formalin til histopatologisk diagnose, og den anden blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -196 ° C i flydende nitrogen indtil RNA blev ekstraheret. Anvendelse af humane væv blev godkendt af Clinical Research etiske komité i Anhui Provincial Hospital.

Cell kultur

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 og HEK293T celler købes fra Shanghai Institute for Biokemi og Cellebiologi ved Chinese Academy of Sciences. Gastric epitel-1 celle (GES) blev opnået fra Shanghai Ruijin Hospital i Shanghai Jiaotong University School of Medicine. SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 og GES blev opretholdt i RPMI1640 og HEK293T blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium medier. Medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i et fugtigt kammer indeholdende 5% carbondioxid.

plasmider og celletransfektion

MIR-410 mimic /inhibitor og kontrollerne blev indkøbt fra RiboBio (Guangzhou, Kina). De HGC-27-celler blev podet i seks-brønds plader ved 30% konfluens én dag forud for transfektion. Transfektion med MIR-410 mimic /inhibitor eller kontrollerne blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transfektionskomplekser blev fremstillet ifølge producentens instruktioner.

QRT-PCR

I QRT-PCR-assays, blev totalt RNA ekstraheret fra celler med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Revers transskription blev udført med PrimeScript RT reagens kit med gDNA viskelæder (Takara) ifølge producentens instruktioner. Ekspressionen af ​​MIR-410 blev bekræftet ved den ændrede stemloop RT-PCR med specifikke RT og PCR-primere. U6 snRNA blev anvendt som en endogen kontrol. RT-reaktioner blev udført ved anvendelse af RNA fraktionen med Promega RT Kit ifølge producentens protokol. PCR-betingelserne blev udført ved at denaturere DNA’et ved 94 ° C i 4 min, efterfulgt af 40 amplifikationscykler: 94 ° C i 40 s, 52 ° C i 40 s, 72 ° C i 40 s for dataindsamling. Kvantitativ PCR blev udført på en ABI 7500 thermocycler (Applied Biosystems) under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) Kits (Takara, Japan) ifølge producentens instruktioner.

celleproliferationsassay

i alt 10

4 celler per brønd blev udpladet i plader med 96 brønde før transfektion og dyrket i 24 timer under normale forhold. De blev derefter transficeret med MIR-410 efterligner eller anti-MIR-410-inhibitor sammen med parrede negative kontroller. Celleproliferation blev vurderet ved hjælp af Cell Counting Kit 8 (Dojindo, Tokyo, Japan) i henhold til producentens protokol.

Cell migration og invasion assay

For migrationen analyser, 5 × 10

4-celler blev tilsat til det øvre kammer af indsatsen (BD Bioscience, 8-um porestørrelse). For invasionen assays, 1 x 10

5-celler blev tilsat til det øvre kammer af indsatsen forud belagt med Matrigel (BD Bioscience). I begge assays blev celler udpladet i medium uden serum, og medium indeholdende 10% FBS i det nedre kammer tjente som kemoattraktant. Efter flere timers inkubation blev cellerne, som ikke migrerer eller invadere gennem porerne omhyggeligt udslettet med vat. Derefter inserterne blev farvet med 20% methanol og 0,2% krystalviolet, afbildes, og talt med en IX71 omvendt mikroskop (Olympus).

Western blot-analyse

Proteiner blev separeret på SDS-polyacrylamid gelelektroforese og overført til nitrocellulose-membran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranen blev blokeret med 5% fedtfri mælk og inkuberet med kanin-anti-MDM2 monoklonalt antistof (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) og muse-anti-b-GAPDH monoklonalt antistof (1:10000 ; Sigma). Proteinerne blev detekteret med forøget kemiluminescens reagenser (Pierce, Rockford, IL, USA).

Luciferase reporter assay

HEK293T celler blev udpladet i plader med 96 brønde. Efter 24 timers inkubation blev en blanding af 100-ng pLUC 3’UTR, 5-pmol negativ kontrol, MIR-410 mimic blev cotransficeret med 20 ng.

Renilla ind HEK293T celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000. Otteogfyrre timer efter transfektion, ildflue og Renilla luciferaseaktiviteter blev målt med Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). Den transfektionseffektiviteten blev normaliseret ved cotransfektion med en Renilla reporter vektor.

Statistisk analyse

Data blev præsenteret som et middel ± standardafvigelse på de mindst tre eksperimenter. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 15.0. En envejs variansanalyse (ANOVA) og Student t-test blev anvendt til statistisk analyse. En værdi på p. 0,05 blev anset for at indikere en statistisk analyse

Resultat

Angivelse af miR-410 var signifikant nedreguleret i GC celler og væv

For at vurdere rolle mIR-410 i GC, afprøvede vi ekspressionen af ​​mIR-410 i GC-cellelinje, væv og deres matchede normale væv under anvendelse kvantitativ RT-PCR. Vi fandt, at MIR-410 niveauer var ofte nedreguleret i GC cellelinjer sammenlignet med GES. Figur 1B viser, at MIR-410 niveauer blev nedreguleret i GC væv sammenlignet med dem i matchede normale væv. Det gennemsnitlige ekspressionsniveau i carcinoma væv (kombination) var signifikant højere sammenlignet med deres tilstødende ikke neoplastiske væv (figur 1C). Vi viste også, at ekspressionen af ​​MIR-410 i metastaserne GC væv var lavere end i ikke-metastaser væv (fig. 1d).

A. QRT-PCR-analyse af MIR-410-ekspression i fire cellelinjer afledt fra gastrisk cancer og en ikke-malign gastrisk cellelinie (GES). (B) QRT-PCR-analyse af MIR-410-ekspression i 60 par GC væv og deres tilsvarende hosliggende nontumorous væv. Udtrykket af miR-410 blev normaliseret til U6 snRNA. (C) Relative MIR-410 ekspressionsniveauer i GC væv og tilstødende normale regioner; (D) Statistisk analyse af sammenhængen mellem miRNA-niveau mellem pM etape (Ingen metastaser og Metastase henholdsvis); * P 0,05, og ** p. 0,01

miR-410 hæmmede GC celleproliferation, migration og invasion

Niveauerne af miR-410 blev forøget betydeligt i GC celler der blev transficeret med MIR-410 efterligner og MIR-410 niveauer blev nedsat, der blev behandlet med MIR-410 inhibitor (fig. 2A). Opregulering af miR-410 hæmmede GC celledeling; i modsætning hertil knockdown af MIR-410 havde den modsatte virkning på celleproliferation (fig. 2B). Desuden viste transwell assay og invasion assay, at det migrerede og invasivitet af celler transficeret med miR-410 efterligner blev dramatisk faldt sammenlignet med kontrollen og ubehandlede celler. Vi viste også, at det migrerede og invasivitet af celler transficeret med MIR-410-inhibitor steg dramatisk sammenlignet med kontrollen og ubehandlede celler. (Fig. 2C og D).

udtryk for miR-410 blev normaliseret til U6 snRNA. (B) De celler behandlet med miR-410 efterligner, inhibitorer eller sramble eller ingen transfektion blev målt ved CCK8 assay på forskellige tidsperioder. (C) Transwell analyse af HGC-27 celler efter behandling med miRNA efterligner, inhibitorer eller scramble eller ingen transfektion; det relative forhold af migrerede celler pr er vist nedenfor. (D) Transwell analyse af HGC-27 celler efter behandling med miRNA efterligner, inhibitorer eller scramble eller ingen transfektion; det relative forhold mellem invasive celler pr felt er vist nedenfor, * p 0,05, ** p 0,01, og *** p. 0,001

miR-410 direkte målrettet MDM2 i GC

som forudsagt af PicTar, der var komplementaritet mellem har-mIR-410 og MDM2 3′-UTR (fig. 3A). For at demonstrere at MIR-410 direkte regulerer MDM2, anvendte vi en dual-luciferase reporter system. Vi fandt, at co-ekspression af MIR-410 undertrykte signifikant den firely luciferase reporter aktivitet af vildtype MDM2 3’UTR men ikke mutanten 3’UTR (fig. 3B). Overekspression af MIR-410 reducerede ekspressionen af ​​MDM2-mRNA og protein (fig. 3C og D).

(A) Sekvenserne af MIR-410-bindingssteder i det menneskelige MDM2 3’UTRs og skematiske reporterkonstruktioner, i dette panel, c-MDM2-WT repræsenterer reporterkonstruktioner indeholdende hele 3’UTR sekvenser af MDM2. C-MDM2-MUT repræsenterer reporter konstruktioner indeholdende muterede nukleotider. (B) Analysen af ​​de relative luciferaseaktiviteter af MDM2-WT, MDM2-MUT i 293T-celler. Fejlsøjlerne stammer fra tredobbelte expriments. (C) QRT-PCR-analyse af MDM2-mRNA-ekspression i HGC-27-celler efter behandling med miRNA efterligner eller scramble eller ingen transfektion. Udtrykket af MDM2 blev normaliseret til GAPDH. (D) Western blot-analyse af MDM2 ekspression i HGC-27 celler transficeret med MIR-410 efterligner eller scramble eller ingen transfektion. GAPDH blev også påvist som en belastning kontrol.

Overekspression af MDM2 inpaired miR-410-induceret hæmning af invasion i GC celler

Vi udførte redning eksperimenter ved transfektion af 3’UTR- negativ MDM2 sammen med mIR-410. Som forventet, transfektion med pcDNA3.1-MDM2 lindres reduktionen af ​​MDM2 skyldtes MIR-410 mimic behandling (fig. 4A). Efter aftale med ekspressionen af ​​målproteiner, transfektion med pcDNA3.1-MDM2 afbødes hæmning af celle forstærkning (fig. 4B) og stigningen af ​​invasive celler (fig. 4C) skyldtes miR-410 efterligner behandling.

(B) Cell vækstkurver i HGC-27 celler transficeret med forskellige kombinationer. (D) Transwell analyse af HGC-27 celler behandlet med forskellige kombinationer. Det relative forhold af invasive celler pr vist med det. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

MDM2 blev omvendt udtrykt med miR-410 i GC

For yderligere at belyse forholdet mellem miR -410 og MDM2 udtryk i delprøver, for det første opdaget vi MDM2 i GC cellelinjer. Som vist i fig. 5A og 5B, mRNA og protein ekspression af MDM2 var meget higer i 4 GC cellelinier end i GES. Vi fandt også, at ekspressionen af ​​MDM2 i GC væv var signifikant højere end i de tilsvarende hosliggende normale væv (fig. 5C). Scatter plot og Pearson korrelation analyse viste endvidere, at miR-410-ekspression var negativt korreleret med target protein niveauer i GC prøver (Fig. 5D). Disse data antydede, at faldet MIR-410-ekspression var relateret til de øgede MDM2 niveauer i de fleste af de GC-patienter.

(A) De relative MDM2-mRNA-ekspression blev bestemt ved QRT-PCR i fire cellelinjer afledt af gastrisk cancer og en ikke-malign gastrisk cellelinie (GES). Udtrykket af MDM2 blev normaliseret til GAPDH. (B) Western blot-analyse af MDM2 ekspression i fire cellelinjer afledt fra gastrisk cancer og en ikke-malign gastrisk cellelinie (GES). GAPDH blev også påvist som en loading kontrol. (C) QRT-PCR-analyse af MDM2-ekspression i 40 par gastrisk cancer væv og deres tilsvarende hosliggende normale væv. Udtrykket af MDM2 blev normaliseret til GAPDH. Ekspressionen af ​​MDM2 i gastrisk cancer væv var signifikant højere end i de tilsvarende hosliggende normale væv. (D) Analyse af korrelation af miR-410 og MDM2 udtryk i mavekræft væv. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

Diskussion

miRNA har fungeret som vigtige regulatorer af genekspression ved post-transkriptionel niveau og regulere en lang række fysiologiske og udviklingsmæssige processer [6], [19], [20]. Montering beviser tyder på, at ændringer i ekspressionen af ​​miRNA bidrager til patogenesen af ​​de mest humane cancere, som de kan fungere som enten onkogener eller tumorsuppressorer [21], [22]. For nylig, akkumulere data viser, at miRNA er involveret i flere vigtige biologiske begivenheder såsom tumorigenese og kræft metastase [23], [24]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi den biologiske rolle MIR-410 i human GC tumorigenese. Vores resultater viste, at miR-410 var ofte nedreguleret i human GC og at dens nedregulering var signifikant associeret med klinisk udvikling og lymfeknude metastaser. Tvungen ekspression af MIR-410 kunne øge proliferation, migration og invasion af GC celler linie in vitro. Vi yderligere identificeret MDM2, et formodet tumorsuppressorgen, som en direkte funktionel mål for MIR-410. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at undersøge den rolle, MIR-410 i GC, og vores resultater indikerede, at MIR-410 fungerede som ny onkogen i GC.

Deregulering af MIR-410 er en hyppig begivenhed i forskellige cancerformer, hvilket antyder, at mIR-410 kan spille en vigtig rolle i tumorigenese og tumorprogression. Gattolliat og kolleger viser, at MIR-410-ekspression blev signifikant associeret med sygdomsfri overlevelse af de ikke-amplificerede gunstig neuroblastom [16]. Endvidere Chen [17] fandt, at MIR-410-ekspression blev reduceret i humane gliomer og tvunget MIR-410-ekspression i glioma-celler stærkt inhiberet af celleproliferation, invasion medieret af målretning MET. Imidlertid har ekspressionen og funktionen af ​​MIR-410 i GC udvikling ikke blevet rapporteret. I denne undersøgelse identificerede vi ekspressionen af ​​MIR-410 i flere GC cellelinier og den GES vha QRT-PCR. Udtrykket af miR-410 blev øget betydeligt i alle fire GC cellelinjer sammenlignet med i GES. Endvidere er opnået fra klinisk GC væv resultater bekræftede også, at miR-410 blev nedreguleret i GC væv sammenlignet med de parrede ikke-kræft tilstødende væv, hvilket indikerer dens mulige involvering i både onkogen transformation og tumormetastaser. Vi efterfølgende bekræftet, at inhibering af MIR-410 fremmes signifikant GC celleproliferation, migration og invasion in vitro.

Vi udforskes yderligere den molekylære mekanisme, der ligger rolle MIR-410 og identificeret MDM2 som en direkte funktionel nedstrømsmål af mIR-410 i GC-celler. Bioinformatik tilgange, som blev brugt til at forudsige mål for miRNA, fremhævet en høj frit energi frø match ved velbevarede miRNA-bindingssted og sit mål mRNA, men specificiteten forblev et problem med at definere mål for mange miRNA. Således over-ekspression af et miRNA kunne nedregulere ekspressionen af ​​målproteinet. Komplementær sekvens af MIR-410 identificeres i 3’UTR af MDM2-mRNA. Endvidere påviste vi, at MIR-410 direkte målrettet mod 3’UTR af MDM2, som dets overekspression var forbundet med undertrykkelse af luciferaseaktivitet. Desuden blev en signifikant nedregulering i niveauet af MDM2 protein observeret efter MIR-410 overekspression, hvilket indikerer posttranskriptionel regulering af MDM2 via målrette sin 3’UTR. Disse resultater indikerede, at MIR-410 kan fungere som en tumorsuppressor delvist medieret ved at undertrykke MIR-410-ekspression i GC udvikling.

MDM2 er et onkogen, der blev først opdaget i et locus amplificeret på dobbelt minute kromosomer i en tumorigen musecellelinie (3T3-DM) [25]. Den vigtigste funktion af MDM2 er at inhibere p53 bioaktivitet ved at blokere den transskriptionelle aktivitet af p53 og fremme p53 proteinnedbrydning [26] – [28]. Høje MDM2 niveauer faldt p53 protein niveauer og kan dæmpe p53 funktion, som steg kræftrisiko og /eller accelereret tumor dannelse og progression [29]. Den MDM2 onkogen spillede en vigtig rolle i cancer progression [30]. Overekspression af MDM2 i tumorceller induceret celleproliferation, inhiberer celle apoptose [31]. Adskillige undersøgelser har vist, at MDM2 overekspression var forbundet med dårlig overlevelse og var en nyttig prædiktiv faktor for dårlig prognose hos mennesker med levercellecancer og bryst karcinomer [32], [33]. Desuden har den seneste undersøgelse viste, at MDM2 blev udtrykt ved højere niveauer i GC væv end i ikke-kræft maveslimhinden, og MDM2 udtryk var forbundet med clinicopathologic funktioner hos patienter behandlet kun med kirurgi [34], [35]. Endvidere knockdown af MDM2 eller overekspression af JWA har synergistisk virkning på undertrykkelsen af ​​mavekræft celleproliferation og migration [35]. Men mekanismen hvordan MDM2 var overekspression er stadig ukendt. Disse resultater viste, at evnen hos MIR-410 til at målrette MDM2 kan tilvejebringe en sådan mekanisme for post-transkriptionel kontrol af MDM2.

Sammenfattende har vores resultater viste, at MIR-410 var signifikant nedreguleret i GC celler og væv. Tvungen udtryk for miR-410 øget GC celleproliferation, migration og invasion gennem direkte målrettet MDM2. Disse resultater tyder på, at denne nye miR-410 /MDM2 akse giver ny indsigt i mekanismerne bag tumormetastaser, og undertrykkelse af miR-410 udtryk kan være en potentiel terapeutisk strategi til behandling af GC i fremtiden.

Støtte Information

tabel S1.

Clinicopathologic charateristics af patienter med GC

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s001

(DOCX)

tabel S2.

Primer sekvens

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104510.s002

(DOCX)