PLoS ONE: CTA095, en roman ETK og Src Dual Inhibitor, inducerer apoptose i Prostata Cancer Cells og overvinder Modstand mod Src Inhibitors

Abstrakt

ETK er en ikke-receptortyrosinkinase, hvilket giver en stærk overlevelse signal i humane prostatacancerceller. Src, anden tyrosinkinase at cross-aktiverer med ETK, har vist sig at spille en vigtig rolle i prostatacancer metastaser. Heri, opdagede vi en ny klasse af ETK inhibitorer. Inden for disse inhibitorer, blev CTA095 identificeret som en potent ETK og Src dual inhibitor. CTA095 blev fundet at inducere autofagi samt apoptose i humane prostatacancerceller. Desuden CTA095 inhiberede HUVEC celle kanaldannelse og “sårheling” af humane prostatacancerceller, hvilket indebærer dens rolle i inhibering af angiogenese og metastase af human prostatacancer. Mere interessant, CTA095 kunne overvinde Src inhibitor modstand i prostata kræftceller. Det inducerer apoptose i Src inhibitor resistente prostatacancerceller, sandsynligvis via en mekanisme af nedregulering af Myc og BCL2. Dette fund tyder på, at samtidig målrettet ETK og Src kunne være en lovende tilgang til at overvinde resistens i prostatakræft

Henvisning:. Guo W, Liu R, Bhardwaj G, Ma AH, Changou C, Yang JC, et al . (2013) CTA095, en roman ETK og Src Dual Inhibitor, inducerer apoptose i Prostata Cancer Cells og overvinder Resistance til Src hæmmere. PLoS ONE 8 (8): e70910. doi: 10,1371 /journal.pone.0070910

Redaktør: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 7, 2013; Accepteret: 25 Juni 2013; Udgivet: 15 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af C-Tag Bioscience Inc (Research tilskud til RL); NIH tilskud DK52659 CA150197 (til HJK), og CA098116 (til KSL); og DOD Postdoc Training Award PC080859 og Auburn Community Endowment Fund Cancer (til WG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. C-Tag Inc er en kommerciel bidragsyder til dette arbejde, og begge KSL og HJK er videnskabelige rådgivere for C-TAG Inc. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft er den hyppigst diagnosticerede cancer og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald af mænd i USA [1]. Mens tidlige fase prostatacancer (CaP) effektivt kan kontrolleres af hormonterapi, metastatisk CaP forbliver uhelbredelig. Tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) er blandt de mest lovende målrettede behandlinger; endnu deres potentiale som prostatakræft terapi ikke er blevet realiseret fuldt ud og til dato, resultaterne af kliniske forsøg med TKI’er som enkelte midler generelt har været beskeden, sandsynligvis på grund af redundans i receptorbinding og signalere til intracellulære mediatorer [2]. De fleste af de TKI’er der er blevet udviklet er rettet mod receptortyrosinkinaser. ETK er en ikke-receptortyrosinkinase, som er overudtrykt i humane prostatacancer prøver og giver stærke overlevelsesfunktioner i prostatacancerceller [3], [4]. ETK medierer kritisk aktivering af STAT3 i CaP tyder på, at funktionel forstyrrelse af ETK kan svække flere vigtige signaler involveret i CaP vækst og overlevelse [5]. ETK også regulerer overlevelse [6], metastaser [7], resistens [3], [8], angiogenese [9], og apoptose [10]. Overekspression af ETK inducerer prostata intraepitelialneoplasi i en mus [11]. Nylige rapporter indikerer, at ETK spiller en vigtig rolle i selv-fornyelse og tumorigent potentiale af glioblastom stamceller gennem Stat3 aktivering [12]. Derfor kan systemisk inhibering af ETK tilbyde synergistiske antitumorvirkninger. Som i endnu, er der ingen effektiv hæmmer af denne kinase.

Src, ETK, og FAK associeret med og cross-aktivere hinanden. Inhibering af en ofte nedsætter aktiviteten af ​​de andre. Disse tre kinaser er blevet vist at spille en vigtig rolle i angiogenese og metastase af prostatacancerceller. Src inhibitor, AZD0530, er blevet rapporteret at inhibere prostatacancer knoglemetastaser i dyremodeller. Imidlertid mangler, denne inhibitor aktiviteten til at inducere apoptose af prostatacancerceller. Dobbelt inhibering af ETK og Src kunne ikke kun overvinde ulempen ved Src-inhibitorer, men kan også øge effektiviteten ved inhibering metastase af prostatacancerceller.

Autophagy er en katabolisk proces, der involverer nedbrydningen af ​​en celles egne komponenter gennem lysosomale maskiner [13]. Det er en tæt reguleret proces, der bidrager til at opretholde en balance mellem syntese, nedbrydning, og efterfølgende genbrug af cellulære produkter [14]. Autophagy kunne bidrage til både celle overlevelse og celle drab i en kontekst afhængig måde. Autophagy modulatorer har nu dukket op som vigtige sensibilisatorer eller modifikatorer af målrettet terapi [15], [16].

Heri vi rapporterer identifikation af en roman ETK og Src dual inhibitor, CTA095, som inducerer autophagy og apoptose, som samt synergistiske virkninger med autofagi modulatorer i prostata kræftceller. Til vores viden, dette er den første rapport af en ETK og Src dual hæmmer med en ansøgning som et anti-cancer middel.

Materialer og metoder

Reagenser

Renset ETK , Btk, Mertk, Yes og Src kinaser blev opnået fra Millipore Inc (Dundee, UK). Propidiumiodid (PI),

N

,

N

-diisopropylethylamin (DIEA),

N

,

N

-dimethylformimide (DMF), ethanol, acetonitril (ACN), 1- (3-aminopropyl) piperidin, trifluoreddikesyre (TFA) blev Pd /C, ammoniumformiat og dimethylsulfoxid (DMSO) købt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). L-phenylglycin-methylester-hydrochlorid blev indkøbt fra Chem-Impex International Inc (Wood Dale, IL). Dibenzofuran-2-carboxaldehyd blev købt fra Oakwood Products, Inc. (West Columbia, SC). Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit blev fremskaffet fra Abcam (Cambridge, MA). Omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) fra Waters Corporation (Milford, MA) blev anvendt til analyse og oprensning af CTA095. LNCAP, CWR22Rv1, RWPE1, 293 og HUVEC-celler blev opnået fra ATCC (Manassas, VA).

One-pot-syntese af CTA095

Den syntetiske fremgangsmåde CTA095, 2-(dibenzo[

b

,

d

]furan-2-yl)-7-phenyl-1-(3-(piperidin-1-yl)propyl)-1

H

-imidazo[4,5-

g

]quinoxalin-6(5

H

)-one, ligner den fremgangsmåde vi tidligere rapporteret [17]. Kort fortalt blev en opløsning af L-phenylglycin-hydrochlorid (201,7 mg, 1,0 mmol) og DIEA (383,2 pi, 2,2 mmol) i DMF (1,5 ml) tilsat dråbevis under kraftig omrøring til en opløsning af 1,5-difluor- 2,4-dinitrobenzen (204,0 mg, 1,0 mmol) i DMF (0,5 ml). Reaktionsopløsningen blev omrørt ved stuetemperatur i 45 minutter. Dette blev efterfulgt af tilsætning af en opløsning af 1- (3-aminopropyl) piperidin (159 pi, 1,0 mmol) og DIEA (174,2 pi, 1,0 mmol) i DMF (1 ml). Den resulterende blanding blev omrørt ved stuetemperatur natten over. Ethanol (20 ml) blev Pd /C (10%, 200 mg), og ammoniumformiat (1,50 g, 23,8 mmol) tilsat til opløsningen. Opløsningen blev opvarmet til tilbagesvaling i 3 timer og derefter afkølet til stuetemperatur. Pd /C blev frafiltreret og filtratet blev koncentreret med rotationsinddamper. Dibenzofuran-2-carboxaldehyd (196,2 mg, 1,0 mmol) i DMF blev tilsat til opløsningen. Den resulterende opløsning blev omrørt ved stuetemperatur i 1 dag. DMF-opløsningen blev hældt i 40 ml is. Bundfaldet blev opsamlet ved filtrering og vasket med vand, efterfulgt af RP-HPLC-oprensning. Fraktionen blev opsamlet og lyofiliseret til opnåelse af et gult pulver som det endelige produkt (fig S1). Homogeniteten af ​​forbindelsen blev kontrolleret ved analytisk RP-HPLC. Renheden blev bestemt til at være 95% ren. Identiteten af ​​forbindelserne blev bekræftet ved matrix-assisteret laser desorption /ionisering-time of flight-massespektrometri. Fundet: 554,26 Dalton (beregnet: 554,26 Dalton for MH

+)

Molekylær modellering

Molekylære docking studier blev udført for at forstå bindingen af ​​CTA095 til ETK.. Energi optimeret struktur CTA095 blev beregnet ved hjælp af Merck Molecular kraftfelt (MMFF) [18], som gennemført i Marvin Suite v 5.11 (https://www.chemaxon.com/products/marvin). Den tredimensionelle struktur af humant ETK (resterne 275-675) sekvens (NCBI GI: 42.544.182) blev forudsagt ved anvendelse af en homologimodellering tilgang som implementeret i HHPred [19], [20]. For at definere et formodet bindingssted for CTA095 på ETK proteinstruktur, vi først brugt en blind docking tilgang gennemføres på SwissDock webservice (https://swissdock.vital-it.ch) [21], [22]. Blandt klyngerne genereret af SwissDock blev konformationen med den laveste frie bindingsenergi valgt. For yderligere at forstå stabiliteten og dynamikken af ​​liganden-kinase-kompleks, udførte vi en 20 ns molekylær dynamik (MD) simulering, begyndende med den bedst sammenkoblede struktur forudsagt af SwissDock. Disse simuleringer blev udført ved hjælp NAMD mod 2.7b2 [23]. CHARMM27 kraftfelter blev anvendt til at beregne potentialerne i ETK, mens CHARMM22 (som implementeret i SwissParam (https://swissparam.ch) [24] kraftfelter blev brugt til at beregne potentialer CTA095. Den kinase-ligand-kompleks blev opløste i en vand kasse med periodiske randbetingelser. Dimensioner på vandbeholderen blev udvalgt til at være mindst 10 ångstrøm større end det opløste stof i hver retning. hele systemet blev neutraliseret med 0,15 M NaCl. et første minimering trin blev udført i 6000 trin, efterfulgt med 20 ns af afslapning. baner disse simuleringer blev visualiseret ved hjælp af VMD v 1.9 [25], og samspillet mellem kinase og liganden blev plottet hjælp PyMOL og LigPlot + v 1.4 [26].

kinase inhiberingsassay

Kinase inhibering blev målt under anvendelse af tyndt-lags-chromatografi (TLC). Kort fortalt, oprensede kinaser (20 nM), det tilsvarende substrat (500 uM, TSFYGRH for ETK, YIYGSFK for de andre kinaser), og CTA095 (0 -10 pM) blev inkuberet i en kinasereaktion (100 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM MnC, blev startet ved tilsætning af 5

2 10 mM MgCl

2, 1 mM DTT) i 5 minutter, og reaktionen pCi

33P-mærket ATP. Omsætningen (10 pi) blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time og blev stoppet ved tilsætning af 10 pi H

3PO

4. Radioaktiviteten af ​​peptidsubstratet blev analyseret ved anvendelse TLC som tidligere beskrevet [27].

ETK autophosphoryleringsassay

ETK autophosphorylering aktivitet blev målt ved et in vitro kinaseassay. Kort fortalt blev oprenset ETK (100 ng) blandes med CTA095 i kinaseassaypuffer (20 mM Hepes, pH 7,55, 10 mM MgCl

2, 10 mM MnC

2, 1 mM DTT, 500 pM Na

3VO

4). Den kolde ATP (5 uM) og varmt r-

33P-ATP (5 uCi) blev tilsat til blandingen, og kinasereaktionen blev udført ved 30 ° C i 30 minutter. Reaktionerne blev afsluttet med en 4X SDS-PAGE-prøvebuffer, og derefter sat på en 8% SDS-polyacrylamidgel til elektroforese. Gelen blev tørret vakuum, og ETK auto kinaseaktivitet blev analyseret med en phosphoimager (Biorad).

Cellekultur

LNCAP, PC3, CWR22Rv1, og RWPE1 celler blev opretholdt i RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin /glutamin.

Western blotting

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [28]. Proteiner blev påvist ved anvendelse af følgende antistoffer: β-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ETK (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA), pEtk; Src, pSrc; Stat3, pStat3. For phospho-ETK blev celler forbehandlet med 100 pM pervanadat i 15 min før høst.

MTT assay

Celler blev podet i plader med 96 brønde og dyrket natten over, efterfulgt af behandling med 0,1% DMSO, som kontrol vehikel, og CTA095, i de angivne koncentrationer i 72 timer. Vækstinhibering blev målt ved anvendelse af et 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (Roche Diagnostic, Mannheim, Tyskland).

Flowcytometri

PC3-celler blev behandlet med 0,1% DMSO (kontrol) og CTA095 i de angivne koncentrationer i 24 timer. Standsning af cellecyklus blev bestemt ved inkorporering af propidiumiodid (Sigma-Aldrich) til permeabiliserede celler. Celler, som undergår apoptose, blev identificeret under anvendelse af et Annexin V-FITC Kit (Abcam) efter producentens instruktioner. Cellerne blev analyseret ved hjælp af en Coulter Epics XL flowcytometer (Beckman Coulter, Miami, FL).

Analyse af caspase-3/7 og caspase 9 aktiviteter

For caspase 3/7 aktiviteter, PC3-celler blev podet ved 5000 celler /brønd i 96-brønds plade natten over. Derefter blev cellerne behandlet med 0-10 uM CTA095 i 24 timer. Caspase-3/7-aktiviteter blev målt under anvendelse af Apo-ONE Homogen caspase-3/7 Assay kit (Promega, Madison, WI) ifølge producentens anvisninger. For caspase 9-aktivitet, blev PC3-celler podet i 10 mm vævskulturplade og voksede til 50% konfluens. Celler blev derefter behandlet med 0-10 uM CTA095 i 24 timer. Celler blev høstet og caspase 9-aktivitet blev målt ved anvendelse af et Western blot med et anti-caspase 9 antistof.

Autophagy assay

PC3-celler blev stabilt transficeret med GFP-LC3 [16]. Celler blev dyrket i en 6-brønds plade til 50% konfluens og behandlet med 5 pM CTA095 i 24 timer. Autophagy blev visualiseret ved GFP-LC3 “puncta” og immunoblot af endogene LC3 isoformer.

HUVEC celle rør dannelse assay

HUVEC celler blev podet på mitrogel og behandles med CTA095 (0 og 5 uM) i 6 timer. Vaskulær rør-dannelse blev visualiseret under anvendelse af et mikroskop.

PC3 celle “Sårheling” assay

PC3 celler blev dyrket i 6-brønds plade til 60% sammenflydning. Derefter sår blev foretaget med en spids og behandlet med CTA095 (0 og 5 uM). Cell migration (sårheling) blev visualiseret under mikroskop på de angivne tidspunkter.

Hæmning af PC3 xenograft tumorvækst ved CTA095nano (CAT095 formuleret i nano-miceller)

Denne undersøgelse blev gennemført i streng overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of California, Davis (Protokol nummer: 16697). Kort fortalt, 2 × 10

6 PC3-celler blev injiceret subkutant til flankerne af 5 uger gamle mandlige nøgne mus. Tumorvolumen blev målt med en skydelære og ved anvendelse af formlen V = (L × B

2) 1/2. Tumorerne blev dyrket til den angivne størrelse og musene blev tilfældigt opdelt i to grupper (8 mus /gruppe). Kontrolgruppen blev behandlet med vehikel. Behandlingen gruppe blev behandlet med CTA095nano ved 10 mg /kg to gange om ugen i.v. indsprøjtning. vægt tumorstørrelsen og krop blev målt en gang om ugen. Eksperimentet blev afsluttet, når tumorstørrelsen i kontrolgruppen nåede humane endepunkter ved IACUC. Kurver over tumorvolumener vers varighed blev plottet for begge grupper.

CTA095 overvinder Src inhibitor resistens i prostatacancerceller

PC3 og PC3-AZD20 (PC3 celle resistent over for 20 uM AZD0530, som er fra AstraZeneca gennem MTA med Dr. Chris Evans) celler blev podet ved 2000 celler brønds plader /brønd i 96 natten over. Cellerne blev behandlet med AZD0530 eller CTA095 i de angivne koncentrationer. Cellernes levedygtighed blev målt ved hjælp af en MTT assay efter 72 timer.

CTA095 inducerer apoptose i Src inhibitor resistente prostata kræftceller gennem Myc og BCL2 hæmning

PC3-AZD20 celler blev podet ved 10

6 celler /brønd i plader med 6 brønde natten over. Cellerne blev behandlet med AZD0530 eller CTA095 ved 10 uM. Apoptose blev analyseret ved anvendelse af Annexin-V FITC apoptosis afsløring kit. MRNA-niveauer af Myc og BCL2 blev målt ved hjælp af real-time PCR. pEtk, ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, Myc og BCL2 niveauer blev målt ved hjælp af de tilsvarende antistoffer via en Western blot.

Statistik

En envejs ANOVA blev anvendt i kombination med en Tukey-test for parvis sammenligning. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

CTA095 som en dobbelt inhibitor mod ETK og Src tyrosinkinaser

Gennem screening en 9600-mangfoldighed kombinatorisk løsning fase lille molekyle bibliotek, hit forbindelser med inhiberende aktiviteter mod ETK blev opdaget. Efterfølgende struktur-aktivitet-relationer undersøgelser førte til identifikation af CTA095 (figur 1A). Sammenlignet med andre CT forbindelser med en kondenseret tre-ring kernestrukturen identisk med CTA095 viste CTA095 signifikant ETK inhibering (figur 1B). Interessant, var der en stærk korrelation mellem ETK hæmning og PC3 væksthæmning (figur 1C). Disse data antyder, at ETK kan være mål ansvarlig for vækstinhibering observeret for PC3-celler. Salg

kemiske struktur af CTA095 (A), identifikation af CTA095 som en potent ETK inhibitor (B) og dens cytotoksicitet til PC3 celler (C). For ETK inhibering, oprenset ETK (20 nM), de tilsvarende forbindelser (1 uM), og peptidsubstratet (YIYGSFK) blev inkuberet med

33P-ATP i en kinasereaktion. Det resulterende produkt blev analyseret på en TLC-plade. For vækstinhibering blev PC3-celler podet ved 5000 celler /brønd i 96-brønds plade natten over og behandles med de tilsvarende forbindelser (10 uM) Cellelevedygtigheden blev målt under anvendelse MTT-assay efter 72 timer. Kolonner, betyder; barer, standardafvigelse, n = 3.

Efter at have isoleret et lille molekyle, der hæmmer ETK, det næste logiske skridt var at bestemme dens specificitet for dette enzym. For at opnå dette, blev oprenset ETK, Btk, Src og Yes inkuberet i en kinasereaktionspuffer med CTA095 (0-1 uM) i nærvær af

33P-mærket ATP og et peptid (YIYGSFK), tidligere vist sig at være en fremragende substrat for både BTK og Src familie kinaser. Kinaseaktiviteten blev målt under anvendelse TLC-teknik. Denne undersøgelse viste, at CTA095 var en potent inhibitor for ETK, med en IC

50 på ca. 60 nM (figur 2A). Inhibering blev observeret på en koncentrationsafhængig måde. Desuden kunne CTA095 også hæmme Src (IC

50 ≈ 120 nM). Men Btk og ja var betydeligt mere resistente over for CTA095 hæmning med IC

50 større end 10 uM (figur 2A, figur S2).

Styrken af ​​CTA095 til ETK, Src, Btk og ja blev målt ved hjælp af TLC (A) for at identificere

33P-phosphoryleret peptidsubstrat. Oprenset TK (20 nM), CTA095 (0, 0,2, og 1 uM), og peptidsubstratet (YIYGSFK) blev inkuberet med

33P-ATP i en kinasereaktion. Det resulterende produkt blev analyseret på en TLC-plade. Virkningen af ​​CTA095 til ETK autophosphorylering (B) blev yderligere undersøgt ved inkubation af ETK med CTA095 ved de angivne koncentrationer i nærvær af

33P-ATP blev radioaktiviteten af ​​ETK målt ved anvendelse radiosensitive film. Intensiteten af ​​det radioaktive plet blev målt ved anvendelse densitometer. Kolonner, betyder; barer, standardafvigelse, n = 3.

BTK familien af ​​ikke-receptortyrosinkinaser er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​en autophosphorylering sted inden i ikke-katalytisk Src homologi 3 (SH3) -domæne. Således var det også vigtigt at bestemme evnen af ​​CTA095 at inhibere ETK autophosphorylering. Derfor er en

in vitro

ETK autophosphoryleringsassay blev etableret i hvilken oprenset ETK blev blandet med CTA095 i nærvær af

33P-ATP. Efter 30 minutter blev reaktionen afsluttet, og prøverne blev fyldt på en SDS-polyacrylamidgel til elektroforese. Efter tørring blev gelen analyseret med en phosphoimager. Figur 2B viser, at CTA095 kunne inhibere ETK autophosphorylering i en koncentrationsafhængig måde.

Udover BTK familie tyrosinkinaser, den inhibitoriske aktivitet af CTA095 til andre kinaser, herunder Lyn, Axl, Mer, EGFR, og Abl, blev undersøgt ved anvendelse af et TLC assay. Som vist i tabel 1, synes CTA095 at have en stærk reaktivitet mod ETK og Src, langt højere end i nogen andre testede.

CTA095 hæmmer ETK gennem binding af dets ATP bindende omegn

at udforske den formodede mekanisme ansvarlig for ETK hæmning af CTA095 blev molekylær docking og dynamik studier udført. Disse undersøgelser forudsiger, at CTA095 interagerer med back-lomme af ATP-bindende region. Denne binding lomme er dannet af resterne i glycinrigt loop, ‘gatekeeper’ T489 og hængselregionen (figur 3A). R

3 gruppe CTA095 interagerer med gatekeeper-molekylet Thr489, og også stabiliserer Phe555 af DFG motiv i en inaktiv ‘out’ position (figur 3B). Desuden tre-ring kerne i forbindelsen interagerer med Cys496, som er meget unikt for ETK. Kun 8 kinaser ud af de 491 kinaser, der blev analyseret i en tidligere undersøgelse [29], [30] viser threonin og cystein i disse positioner. Således CTA095 samspil med både Thr489 og Cys496 kan give det unikke kinase selektivitet. Vi har også brugt LigPlot + at forudsige hydrogenbinding og /eller hydrofobe interaktioner i bindingslommen, og vores resultater viste, at flere hydrofobe interaktioner er ansvarlige for CTA095-ETK binding (figur S3A og S3B). Sidekæder, der formodet interagerer med CTA095 er vist i figur S3C. Analyse af de molekylære dynamik baner viser også, at R

3 gruppen og tre-ring kerne vekselvirker stærkt og stabilt med sidekæder i bindende lomme, mens R

1 og dele af R

2 er opløsningsmiddel udsat for, og kan tjene som mål for yderligere forbedring af CTA095 bindende og specificitet (film S1).

(A) Overflade billede af ETK forankret til CTA095 efter 20 ns af MD minimering og afslapning. R

3 og de tre-ring kerne kuperet dybere mellem Glycine-rige loop region (cyan) og hængsel region (orange), R

1 og R

2 er solvent eksponerede. Blå: Helix C; Rød: Aktivering Loop; Grøn: DFG motiv (554-556); Cyan: Glycin-rige loop; Orange; Hængselsregion. (B) Cartoon repræsentation viser forudsete vekselvirkninger af CTA095 med gatekeeperen Thr489, DFG (554-556) motiv, og Cys496. CTA095 binding stabiliserer Phe555 i “out” konfiguration, og påvirker den aktive tilstand salt bro dannelse mellem Lys445 og Glu460. Blå: Helix C; Rød: Aktivering Loop; Grøn: DFG motiv (554-556); Cyan: Glycin-rige loop; Orange; Hængselsregion. Figurerne blev genereret under anvendelse PyMOL.

modsætning ETK-CTA095 binding, Src kinase viser binding med CTA095 i det aktive sted lomme dannet af N-lap, C-lap og aktiveringen sløjfe. CTA095 i sin forankret position spænder resterne Asp404 og Asn 391, som er både vigtige for Mg

2+ og ATP binding. CTA095 også formodentlig interagerer med funktionelt vigtige Tyr416 rest, som er en del af aktiveringen loop regionen (figur S4). , Generelt mener vi, at CTA095 blokerer ATP bindende lomme i Src kinase, og hæmmer ATP bindende i ETK ved at inducere konformationsændringer via back-lomme.

CTA095 hæmmer fosforylering af ETK, Src og downstream signaler Stat3 og Akt i prostatacancerceller

Den inhiberende aktivitet af CTA095 mod phosphorylering af ETK i intakte celler blev undersøgt ved Western blot. ETK, samt Src phosphorylering i PC3-ETK (PC3-celler stabilt transficeret med ETK), celler blev inhiberet signifikant ved 5 uM og 10 uM. Den Src hæmning vil sandsynligvis resultere fra både direkte hæmning af CTA095, samt nedsat aktivitet ETK, som aktiverer Src. En selektiv mål for ETK og Src er STAT3, hvis fosforylering hæmmes også ved CTA095. Akt er en anden vigtig nedstrømseffektor af ETK, og dets phosphorylering blev inhiberet af CTA095 (figur 4).

Celler blev dyrket i 10 mm plade til 50% konfluens og behandlet med CTA095. Celler blev høstet efter 24 timer. pEtk, ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, Pakt og AKT niveauer blev målt ved hjælp af de tilsvarende antistoffer ved Western blot. En af tre lignende forsøg er afbildet.

CTA095 fortrinsvis hæmmer væksten af ​​maligne prostata celler

For at bestemme virkningen af ​​CTA095 på spredning, et panel af cancer cellelinjer, herunder LNCAP, CWR22Rv1 , PC3 og den normale prostata celle RWPE1 blev inkuberet med CTA095 og deres proliferation blev målt under anvendelse af MTT-assayet. CTA095 var effektiv til at inhibere væksten af ​​prostatacancerceller (LNCAP, CWR22Rv1 og PC3), mens den immortaliserede normal prostata celle RWPE1 var mere resistent over for CTA095 (figur 5), sandsynligvis på grund af “afhængighed” af ETK signal ved prostatacancerceller som vist tidligere [11].

celler blev podet ved 5000 celler /brønd i 96-brønds plade natten over og behandles med CTA095 i de angivne koncentrationer. Cellelevedygtigheden blev målt under anvendelse MTT-assay efter 72 timer. prikker, mener; barer, standardafvigelse, n = 3.

CTA095 inducerer autophagy i prostatacancerceller

Tidligere viste vi, at Src inhibitor AZD0530 inducerer autophagy i prostatacancerceller, som bidrager til apoptose modstand og formindsker effektiviteten af ​​Src inhibitor [16]. For at bestemme om CTA095 kan udløse autofagi blev PC3 celler stabilt transficeret med GFP-LC3 behandlet med CTA095, derefter undersøgt under fluorescensmikroskopi. Efter 24 timer behandling med CTA095, disse celler gav omfattende særskilte “puncta” autophagosome morfologi, mens køretøjet behandling ikke gjorde (figur 6A). Evne CTA095 at fremkalde autofagi i PC3 celler blev yderligere bekræftet ved omdannelse af endogene LC3-I til LC3-II formularer (Figur 6B). Således ligesom Src tyrosinkinaseinhibitoren, inhibering af ETK inducerer også autofagi. Salg

Celler blev dyrket i 6-brønds plade til 50% konfluens og behandlet med CTA095. Autophagy blev visualiseret ved GFP-LC3 “puncta” (A) og immunoblot af endogene LC3 isoformer (B). Alle forsøg blev udført 24 timer efter behandlingen.

CTA095 inducerer apoptose i prostatacancerceller

For at afgøre, om væksten hæmning fremkaldt af CTA095 på PC3 celler skyldtes apoptose, flow cytometrisk analyse blev udført. Efter behandling med CTA095 i 24 timer, en dosisafhængig akkumulering af en “sub-G1” fraktion blev observeret ved anvendelse af PI-farvning (figur 7A). Data baseret på Annexin-V reaktivitet også indikeret en dosisafhængig forøgelse af apoptose af PC3-celler efter behandling med CTA095 (figur 7B). Yderligere undersøgelse viste, at behandling af PC3-celler med CTA095 resulterede i en dosisafhængig aktivering af caspase3 /7 (figur 7C) og caspase 9 (figur 7D). Således i modsætning til Src inhibitor AZD05350, denne ETK inhibitor inducerer en betydelig grad af apoptose, på trods af sin stimulering af autofagi pathway. Mere interessant, 293-celler (ETK negativ) er resistente mod inducere apoptose ved CTA095, hvilket indikerer specificiteten af ​​denne forbindelse til ETK (fig S5). Som det vil blive diskuteret senere, ETK direkte styrer overlevelse pathway, uden hvilke tilsyneladende kan tilsidesætte den beskyttende virkning af autofagi. Som følge heraf kan CTA095 induceret apoptose yderligere forbedres ved en autofagi blokade (se nedenfor).

PC3-celler blev podet ved 10

6 celler /ml (2 ml) i en 6-brønds plade natten over og derefter behandlet med CTA095 i de angivne koncentrationer i 24 timer. Cellecyklusstop blev analyseret under anvendelse PI-farvning (A). Apoptose blev analyseret ved anvendelse af Annexin-V FITC apoptosis afsløring kit (B). Caspase 9-aktivering blev målt ved anvendelse western blot (D). For caspase 3/7 aktivitet blev PC3-celler podet ved 5000 celler /plade brønd i 96 brønd natten over og behandlet med CTA095 ved 0-10 uM i 24 timer. Caspase-3/7-aktiviteter blev målt under anvendelse af Apo-ONE Homogen caspase-3/7 Assay kit (Promega, Madison, WI) ifølge producentens anvisninger. Kolonner, betyder; barer, standardafvigelse, n = 3 5 uM og 10 uM er væsentligt forskellige fra 0 pM (*, p 0,05, en-vejs ANOVA med Tukey test for par kloge sammenligning)

CTA095. hæmmer HUVEC celle rør dannelse og prostatakræft celle migration

ETK er stærkt udtrykt i endotelceller og vist at være involveret i angiogenese [31]. For at undersøge evnen hos CTA095 at inhibere angiogenese, blev vaskulær rør dannelsen af ​​HUVEC endotelceller efter behandling med CTA095 undersøgt. Som forventet blev røret dannelsen af ​​HUVEC-celler sprængt ved CTA095 (figur 8A). At udforske evne CTA095 at hæmme celle migration, “sårheling” af PC3 celler blev målt efter behandling med CTA095. Som vist i figur 8B, “sårheling” af PC3-celler blev stærkt inhiberet af CTA095 efter 48 timer. Disse resultater antyder, CTA095 har evnen til ikke blot at undertrykke prostatakræft cellevækst, men også at reducere angiogenese.

Inhibering af vaskulær rør dannelsen af ​​HUVEC endotelceller (A) og inhibering af migration (sårheling) af PC3 humane prostata kræftceller (B) ved CTA095. (A) HUVEC celler frø på mitrogel og behandles med CTA095 (0 og 5 uM) i 6 timer. Vaskulær rør-dannelse blev visualiseret under anvendelse mikroskop. (B) PC3 celler blev dyrket i 6-brønds plade til 60% sammenflydning. Derefter sår blev fremstillet og behandlet med CTA095 (0 og 5 uM). Cell migration (sårheling) blev visualiseret under mikroskop på de angivne tidspunkter.

CTA095 som en kemo-sensibiliserende

Vores indledende undersøgelser indikerede, at CTA095 har god cytotoksicitet mod et panel af prostata cancerceller. For at undersøge om ETK og Src dual inhibitor virker effektivt som en kemo sensibilisator, PC3-celler blev co-behandlet med CTA095 og paclitaxel (PTX) (2 ng /ml), eller autophagy inhibitoren chloroquin (CQ) (10 uM). Vækstinhibering blev bestemt under anvendelse af et MTT-assay efter 72 timer. Interessant nok blev en synergistisk effekt af CTA095 med PTX eller CQ til prostatacancerceller observeret (figur 9). Dette antyder, at CTA095 er en kemo sensibilisator, og blokering af autophagy af CQ fremmer CTA095 induceret celledød.

vækstinhibering af CTA095 og i kombination med 10 pM chloroquin (CQ) eller 2 ng /ml paclitaxel (PTX ) til PC3 humane prostatacancerceller. Celler blev podet ved 5000 celler /brønd i 96-brønds plade natten over og forbehandlet med de tilsvarende co-behandlinger for 1 h, derefter behandlet med 2,5 uM CTA095. Cellelevedygtigheden blev målt under anvendelse MTT-assay efter 72 timer. Kolonner, betyder; barer, standardafvigelse, n = 3.

CTA095nano hæmmer PC3 xenograft tumorvækst in vivo

I betragtning af den

in vitro

aktivitet CTA095 mod prostatakræft celler, er det vigtigt at validere disse resultater

in vivo

. Da CTA095 er meget tungtopløseligt i vand, vi formuleret CTA095 i nano miceller. Denne micelle blev udviklet i vores laboratorium og er blevet anvendt med held at formulere hydrofobe lægemidler såsom paclitaxel og vincristin [32], [33].