PLoS ONE: ATR-p53 Begrænser homolog rekombination i Reaktion på replikativ Stress men begrænser ikke DNA interstrengstværbinding reparation i lungekræft Cells

Abstrakt

homolog rekombination (HR) er nødvendig for genstart af kollapsede DNA-replikation gafler og fejlfri reparation af DNA dobbelt-strenget pauser (DSB). Dog kan ikke-planlagt eller hyperaktive HR føre til genomisk ustabilitet og fremme udviklingen af ​​kræft. De cellulære faktorer, der begrænser HR-processer i pattedyrceller er kun lige begyndt at blive belyst. Tumor suppressor p53 har været impliceret i undertrykkelsen af ​​HR selvom det har været uklart, hvorfor p53, som vogter af genomet, ville svække en fejlfri reparationsprocessen. Her viser vi for første gang, at p53 nedregulerer foci dannelse af RAD51 rekombinase som reaktion på replikativ stress i H1299 lungecancerceller på en måde, der er uafhængig af dens rolle som en transskriptionsfaktor. Vi finder, at denne nedregulering af HR er ikke blot helt afhængig af bindingsstedet af p53 med replikation protein A, men også ATR /ATM serin 15 phosphoryleringssted. Genetisk analyse tyder på, at ATR men ikke ATM kinase modulerer p53 funktion i HR. Undertrykkelsen af ​​HR ved p53 kan omgås under eksperimentelle betingelser, der forårsager DSB enten direkte eller indirekte, i overensstemmelse med p53 rolle som vogter af genomet. Som følge heraf betyder transaktivering-inaktiv p53 ikke kompromittere modstand H1299 celler til interstreng tværbindingsmiddel mitomycin C. I alt vores data understøtter en model, hvor p53 spiller en anti-rekombinogene rolle i ATR-afhængige pattedyr replikationskontrolpunktet men gør ikke forringe en celles evne til at bruge HR til fjernelse af DSB induceret af cytostatika

Henvisning:. Sirbu BM, Lachmayer SJ, Wulfing V, Marten LM, Clarkson KE, Lee LW, et al. (2011) ATR-p53 Begrænser homolog rekombination i Reaktion på replikativ Stress men begrænser ikke DNA interstrengstværbinding reparation i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (8): e23053. doi: 10,1371 /journal.pone.0023053

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: May 6, 2011; Accepteret: 5 juli 2011; Udgivet: 12. august 2011

Copyright: © 2011 Sirbu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NCI tilskud R01 CA58985 (SNP) og R01 GM076388 (LZ), NCI Dana-Farber /Harvard Cancer center SPORE i lungekræft P50 CA090578 (HW, LZ), Department of Defense W81XWH-06-1-0309 (HW ), Federal Andel af programmet indkomst optjent af Massachusetts General Hospital på C06 CA059267, Proton Therapy Research and Treatment center (HW), og Deutsche Krebshilfe (tysk Cancer Aid) 10-1843-Da (JDD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Genetiske udvekslinger medieret af homologe DNA-sekvenser skal reguleres tæt for at opretholde genomisk stabilitet [1]. er behov for en aktiv homolog rekombination (HR) vej til reparation og genstart af kollapsede DNA replikation gafler [2]. Celler med defekter i HR er svækket i deres evne til at fjerne DNA interstrengstværbindinger (ICL) som fremstillet for eksempel ved mitomycin C (MMC). DNA dobbelt-strenget pauser (DSB) forekommer i S-fasen efter replikation eller i G2 repareres med HR i et typisk fejlfri måde, fordi homolog DNA-sekvens på søsterkromatid kan tjene som en nøjagtig skabelon for reparation. I modsætning hertil spontane DNA udveksling mellem homologe sekvenser i mitotisk voksende celler skal begrænses og HR aktiviteter på strandede replikationsgafler kan ikke altid være ønskeligt [1], [3], [4]. De anti-rekombinogene faktorer, der begrænser HR i pattedyrceller er kun lige begyndt at blive belyst.

p53 tumor suppressor spiller en central rolle i opretholdelsen af ​​genomisk stabilitet og undertrykkelse af cellulær transformation [1], [5] . Som følge heraf er vildtype p53-funktion forstyrret af genetiske mutationer eller andre mekanismer i de fleste, om ikke alle, humane cancere [5]. p53 er opstået som en multifunktionel regulator, som er i centrum for flere involverede veje i apoptose, celle-cyklus kontrol, og DNA-reparation. Mange funktioner af p53 formidles af transkriptionel aktivering af downstream målgener [6]. Vi og andre har etableret en ekstra transaktiveringsfunktion-uafhængig rolle af p53 i undertrykkelsen af ​​HR-processer på tværs af en række forskellige celle-systemer og analyser [7], [8], [9], [10], [11], [12] , [13]. For eksempel har flere p53 mutationer såsom L22Q /W23S (p53QS), A138V eller V143A, som forringe p53 evne til at transaktivere målgener herunder p21, ikke på kompromis p53 evne til at nedregulere HR [10], [14]. p53 synes at påvirke HR gennem forskellige direkte protein- og DNA interaktioner [8], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23 ]. En direkte interaktion med enkeltstrengede (ss) DNA-bindende replikering protein A (RPA), synes at hæmme HR på et tidligt trin, og yderligere interaktioner med BRCA2 og RAD51 kan tjene samme formål [9], [10], [ ,,,0],24]. Nedregulering af HR afhænger intakte kerne og tetrameriseringsdomæne domæner af p53 [7], [8], [12], mens den C-terminale ende synes undværes [12], [13]. Opstrøms faktorer, der regulerer p53-medieret HR suppression forbliver stort set ukendt [25].

Multiple observationer link p53 direkte til DNA-replikation. p53 co-lokaliseres med steder for replikation [26], [27], er udtrykt parallelt med DNA-syntese, når cellerne genindtræde i celle-cyklus [28], og migrerer ind i kernen i S-fase [29], [30] . Replikation af beskadiget DNA blokeres af p53

in vitro

[31]. Efter inhibering af replikation forlængelse af hydroxyurinstof (HU), transkriptionelt inaktive p53 akkumuleres i S-fase [32]. I overensstemmelse med disse data, p53 nedregulerer HR hvis replikation forlængelse er blokeret [11], [33]. Hvad er forblevet ukendt, om p53 er vildtype transaktiveringsaktivitet er påkrævet for dets undertrykkende rolle i replikation-associeret HR.

P53 phosphoryleres direkte eller indirekte af ATM (Ataksi Telangiectasia muteret) og ATR (ATM og Rad3 -relaterede) kinaser [34], [35], men de funktionelle konsekvenser af disse ændringer med hensyn til HR regulering er ikke fastlagt. ATM reagerer primært DSBs og phosphorylerer et netværk af substrater [36]. ATM påvirker både HR samt fejlbehæftet og fejlfri non-homolog ende-sammenføjning [37], [38], [39]. ATR kinase spiller en central rolle i reaktionen på replikativ stress, og phosphorylering af ATR-substrater kollektivt inhiberer replikation og opretholder replikationsgafler og derved forhindre genomisk ustabilitet [40], [41]. Vigtigt er HR anvendes til at re-initiere replikation, men kan også forårsage upassende Strand-exchange begivenheder på strandede gafler, hvis ikke reguleret ordentligt [40], [42]. Sammenlignet med gær, er de anti-rekombinogene funktioner replikationskontrolpunktet i pattedyrceller dårligt forstået [40], [42].

Her viser vi, for første gang, at transaktivering-deficient p53 nedregulerer HR som reaktion til replikative stress. Vi fastslå at HR undertrykkelse af p53 forekommer inden for kun timer replikativ stress og er afhængig af både, RPA-bindingssted og ATR phosphoryleringssite serin 15, hvilket placerer p53 ind i den mammale replikation checkpoint. I modsætning til p53 rolle i den replikative stress respons, vises undertrykkelse af homologi-medieret reparation af direkte eller indirekte induceret DSB lempes i overensstemmelse med p53 rolle som vogter af genomet.

Resultater

Differential regulering af HR ved transaktivering-nedsat p53

Det er tidligere blevet vist, at p53 undertrykker HR efter induktion af replikation stress [11], [33]. Men det var ikke, om p53 s transaktiveringsaktivitet er påkrævet for denne funktion. For at løse dette spørgsmål, vi udnyttet p53-nul-celler stabilt transficeret med en tidligere karakteriserede transaktivering-nedsat p53 mutanten, p53QS [10]. Vi inducerede dannelsen af ​​subnuclear RAD51 foci ved behandling af celler med inhibitorer af replikation forlængelse, thymidin og HU (figur 1A, og data ikke vist). Som svar på hvert lægemiddel, var der en statistisk signifikant suppression af RAD51 foci-dannelse i p53QS-udtrykkende celler, sammenlignet med p53-nul kontroller (figur 1BC, fig S1A). Som en kontrol, størrelsen af ​​denne virkning var lig den HR undertrykke evne endogent vildtype-p53, selvom dette eksperiment blev udført i en anden cellelinie, A549 (fig S1B). I modsætning hertil fig 1D viser, at p53QS ikke modulere RAD51 foci induktion i celler udsat for ioniserende stråling (IR), som producerer DSB hele cellecyklussen, med søsterkromatid DSB forekommende post-replikation og i G2 repareret af HR.

(A) Repræsentative billeder af subnuclear RAD51 foci-dannelse i H1299-celler, der stabilt udtrykker p53QS eller p53-nul-celler behandlet med 5 mM thymidin (TdR) i 24 timer. (B) Indvirkning af p53-status (null versus QS) på RAD51 foci-dannelse i H1299-celler behandlet med 5 mM TdR i 24 timer. Søjler repræsenterer betyde med standardfejl baseret på 3 uafhængige gentagelser. (C) Virkninger af p53-status på RAD51 foci-dannelse i H1299-celler behandlet med 1 mM hydroxyurinstof (HU) i 24 timer. Søjler repræsenterer betyde med standardfejl baseret på 5 uafhængige gentagelser. (D) Indvirkning af p53 status på RAD51 foci dannelse i H1299 celler 6 eller 16 timer (h) efter behandling med 2 Gy ioniserende stråling (IR). Søjler repræsenterer betyde med standardfejl baseret på 2-5 uafhængige gentagelser. Alle y-aksen angiver procentdelen af ​​behandlede celler med mindst 10 RAD51 foci per kerne efter subtraktion procentdelen af ​​ubehandlede celler med baggrundsniveauer af RAD51 foci. P-værdier er baseret på t-test (to-halet).

For at modellere DSB reparation på substrater ligner tilpasset søster kromatider, vi ændret en tidligere anvendt rekombination assay, der gør cellerne resistente over for mycophenolsyre efter vellykket HR. Den bakterielle

gpt

gen i rekombination substratet pDT219 blev inaktiveret ved insertion af en I-Scel genkendelsesstedet i KpnI-sitet (figur 2A). Tilpasning af en tidligere karakteriseret murin model til at studere transaktiveringsassays-uafhængige egenskaber af p53 [13] udtrykte vi transaktivering-nedsat p53-A135V i muse embryonale fibroblaster (MEF), der bærer pDT219 substrat, som huser et genkendelsessite for sjældne skæring sted- instrueret I-Scel meganuklease (data ikke vist). Vi har tidligere vist, at denne p53 mutant er i stand til at undertrykke spontane HR begivenheder, analogt med p53QS i humane celler [10], [13]. Vi først vurderede virkningen af ​​denne mutant at undertrykke DSB-induceret HR under anvendelse af homologe donorsekvens pΔ2, som er co-transficeret en I-Scel meganukleasen ekspressionsvektor. I dette system er homologi-medieret reparation medieret af strækninger af uafbrudt homologi på 202 bp og 2.333 bp opstrøms og nedstrøms for I-Scel site, hhv. Vi har ikke påvise en statistisk signifikant forskel i DSB-induceret HR frekvenser mellem celler med og uden p53-A135V (figur 2B). Der var ingen forskel i transfektionseffektiviteten mellem de forskellige kloner (data ikke vist). Dernæst vi modificeret donorplasmidet at reducere længden af ​​delte sekvenshomologi med kun 188-250 bp (pKEB1). Med denne modifikation blev den undertrykkende virkning af p53 statistisk signifikant forøget til 10-fold (p 0,01). Tilsvarende i et almindeligt anvendt GFP-baseret rekombination substrat, PDR-GFP, i hvilket HR medieres af ca. 400 bp delt uafbrudt sekvenshomologi flankerer I-Scel site, transaktivering-nedsat human eller murin p53 undertrykte DSB-induceret HR ved adskillige gange (figur S2).

(a) Plasmid substrat pDT219 bærer en kopi af det bakterielle gpt-genet inaktiveret ved insertion af en i-Scel genkendelsessted i det unikke KpnI-stedet i pSV2-gpt. HR hændelser blev induceret i 10.1 muse fibroblaster transporterer pDT219 ved co-transfektion af en I-Scel ekspressionsvektor og en homolog donor. pΔ2 er karakteriseret ved 202 bp og 2333 bp af uafbrudt sekvens homologi deles med pDT217, mens pKEB1 indeholder kun 188 bp og 250 bp af homologi flankerer pause site. Efter co-transfektion af pKEB1 eller pΔ2 sammen med en I-Scel ekspressionsvektor blev rekombinanter scoret i en koloni-dannelse assay. (B) I-Scel-induced HR frekvenser opnået med kromosomalt integreret pDT219 afsættes mod p53 status, (-) indikerer p53-null, (+) angiver af transaktivering-deficient p53-A135V mutant, som er funktionelt analoge til p53QS. Søjler repræsenterer det geometriske gennemsnit med SEM for 3-6 uafhængige forsøg. Den relative undertrykkelse af HR i nærvær af p53-A135V sammenlignet med p53-nul-celler er anført for hver af de to donorplasmider. Den relative undertrykkelse af HR blev sammenlignet ved anvendelse af uparret t-test (to-halet).

Sammen antyder disse data, at transaktivering-nedsat p53 nedregulerer HR som reaktion på replikativ stress, men påvirker ikke homologi medieret reparation af DSBs hvis længden af ​​fælles homologi overstiger 250-400 bp som ville være typisk for udveksling mellem søsterchromatider. Den observerede undertrykkelse af DSB-induceret HR i tilstedeværelse af korte homologier kan være relateret til p53 rolle i reguleringen af ​​replikation-associeret HRR og blev ikke uddybet.

HR undertrykkelse kræver serin 15 stedet for p53

Som svar på replikation gaffel blokering, er p53 fosforyleres på serin 15 (figur S3A, B) [34], [43]. Imidlertid er de funktionelle konsekvenser af denne modifikation var ukendte. Vi skabte en phospho-mutant af p53QS ved at indføre en serin 15 til alanin-mutation (p53QS-S15A) (figur 3A). Vi genererede også en RPA-bindende mutant af p53 (p53QM) ved yderligere muterer aminosyrer 53 og 54, som tidligere blev vist at være vigtigt for HR undertrykkelse [10]. Når stabilt udtrykt i p53-nul-celler (figur S4), blev alle disse mutanter associeret med lignende cellecyklus profiler som respons på thymidin-behandling (figur 3B). Som forudsagt, p53QM var ikke i stand til at undertrykke RAD51 foci-dannelse i thymidin-behandlede celler, og dette blev observeret i flere subkloner (figur 3C, og data ikke vist). Slående, blokering serin 15 phosphorylering også fuldstændigt ophævet evne p53QS at nedregulere RAD51 foci.

(A) Illustration af N-terminale p53-mutationer indført ved site-directed mutagenese. De mutante konstruktioner blev stabilt udtrykt fra en fælles kromosomal integration websted i H1299 celler (se Materialer og fremgangsmåder). (B) cellecyklus fordelingerne for H1299 kloner der stabilt udtrykker et p53-N-terminale mutant. TdR, 5 mM thymidin i 24 timer. (C) Effekt af p53-status på thymidin induceret RAD51 foci-dannelse, analogt med eksperimenterne er vist i Figur 1. p-værdi, resultatet af t-test (to-halet) sammenligning p53QS til p53-nul-celler.

for at vurdere, hvor tidligt i reaktion på replikativ understrege S15 site af p53 er påkrævet, vi studerede kinetikken af ​​foci formation. Figur 4 viser, at RAD51 foci dannelse allerede var svækket inden for 6 timer thymidin behandling i p53-nul og p53QS-S15A udtrykkende celler. I overensstemmelse med denne observation, blev S15 fosforylering i p53QS udtrykkende celler observeret inden for 6 timer efter behandling (figur S3C). Endvidere p53QS undertrykt den lokale ophobning af RPA på 6 timer, i overensstemmelse med tidligere data om p53 evne til at inhibere RPA binding til enkeltstrenget DNA, som er et nødvendigt skridt for at indlede HR (fig S5).

tidsforløbet for induceret RAD51 foci i thymidin behandlet H1299 kloner blev målt analogt med eksperimenterne er vist i figur 1.

afhængighed af p53-medieret HR undertrykkelse på ATR

S15 site af p53 er modificeret ved ATM og ATR kinaser [34], [44], [45], og begge kinaser er blevet vist at fremme HR i celler med nedsat eller mistet vildtype p53-funktion [39], [46], [47]. Som forventet, efter behandling med koffein, som inhiberer ATR samt ATM, cellers evne til at danne RAD51 foci som reaktion på thymidin stærkt formindsket (figur 5A). Slående, blev evne p53QS til at reducere RAD51 dannelse i forhold til p53-nul eller p53QS-S15A celler ophævet. For at skelne mellem funktionen af ​​ATM versus ATR, vi behandlede celler med ATM-hæmmer KU55933. I denne indstilling, blev HR undertrykkende effekt af p53QS bevaret, hvilket indikerer en afhængighed af ATR frem ATM. For at bekræfte dette fund, behandlede vi cellerne med siRNA rettet mod ATR som ingen specifik ATR inhibitor er til rådighed. Tilstrækkelig ATR-protein depletering blev opnået efter dobbelt siRNA transfektion og celler bevaret normal vækst i 48-timers varighed af forsøget (figur 5B og data ikke vist). Som tidligere observeret, var der en p53-uafhængig reduktion af HR i ATR siRNA behandlede celler: procentdelen af ​​RAD51 foci positive p53-nul-celler blev reduceret med 16% sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA, dvs. fra 40% til 24% (figur 4C). Sammenlignet med kontrol siRNA transficerede celler, den relative p53-medieret suppression af HR i ATR siRNA transficerede celler blev mindre udtalt, men ikke fuldstændigt ophævet som er konsistent med residual p53QS funktion. Tilsammen antyder disse data at ATR regulerer HR gennem p53-afhængige og -uafhængige mekanismer.

(A) H1299 kloner blev behandlet med thymidin (5 mM i 24 timer) med eller uden samtidig koffein (5 uM) eller KU55933 (20 uM) behandling. (B) Western blot illustrerer siRNA medieret udtømning af ATR i H1299 celler. sc, krypterede siRNA kontrol. (C) Effekt af p53QS status og ATR udtynding på RAD51 foci induktion, målt analogt til figur 1.

p53 bringer ikke RAD51 svar på DSB efter thymidin eller MMC

HR udnyttes til replikation gaffel reparation og genstart [2], en proces, som ikke bør modarbejdet af p53, som det er nødvendigt for opretholdelse af genomisk stabilitet og celleoverlevelse. Efter frigivelse fra en 24-timers inkubation med thymidin (som vist i figur 4), observerede vi en stigning i γ-H2AX foci, konsistent med forekomsten af ​​DSB på sammenklappede replikationsforgreninger (figur 6A). Der var en lignende relativ stigning i RAD51 foci, der var uafhængig af p53-status og i overensstemmelse med HR-medieret gaffel restart (figur 6B). Derfor i denne indstilling, p53QS ikke udøver en undertrykkende effekt på RAD51 foci formation.

(A) farvning for γ-H2AX som en markør for DSB dannelse, illustrerer stigning i DSB i begge H1299 kloner inden for 4 timer efter frigivelse fra thymidin (5 mM i 24 timer). (B) Tidsforløb for RAD51 foci induktion, analogt til figur 4, efter fjernelse af thymidin. For at illustrere den tilsvarende stigning i RAD51 foci induktion uanset p53 status, blev procentdelen af ​​celler med foci normaliseret til 0 til tiden 0 timer (h), dvs. på tidspunktet for fjernelse af thymidin. (C) Virkninger af p53-status på RAD51 foci induceres 4 timer efter behandling med mitomycin C (MMC) (0,5 ug /ml i 1 time). Y-aksen viser procentdelen af ​​celler med mindst 10 induceret RAD51 foci per kerne. Lignende resultater blev set efter 24 timer (data ikke vist). (D) Indvirkning af p53 status på γ-H2AX foci dannelse 24 timer efter behandling med MMC. Y-aksen viser procentdelen af ​​celler med mindst 20 inducerede foci per kerne. (E) Klonogen overlevelse H1299 kloner med varierende p53 status. Alle datapunkter er baseret på 2-3 uafhængige gentagne eksperimenter.

Vi har også eksponerede celler til tværbindingsmidlet MMC, hvilket fører til dannelsen af ​​DSB på sammenklappede replikationsforgreninger. I overensstemmelse med dataene i figur 6B, havde p53QS ikke undertrykke RAD51 foci-dannelse i respons på MMC (figur 6C). Vigtigere, var der ingen forskel i rest γ-H2AX foci i p53-nul og p53QS udtrykkende celler 24 timer efter MMC eksponering, hvilket antyder, at p53 ikke kompromitterer DSB-reparation (figur 6D). Endelig gjorde udtryk for p53QS ikke forringe overlevelsen af ​​MMC-behandlede celler i overensstemmelse med de tilsvarende RAD51 og γ-H2AX foci niveauer udtrykkende celler (Figur 6E). Tværtimod var der en lille, men robust stigning i resistens over for MMC efter ekspression af nogen af ​​p53 mutantformer. Interessant nok blev en lignende resultat ses, når ekspression af p53-A135V mutant i muse embryonale fibroblaster (figur S6). De mekanismer, som transaktiveringsfunktion-inaktiv p53 kan fremme MMC overlevelse mangler at blive bestemt (se Diskussion).

Diskussion

Mens p53 rolle som transskription faktor, der styrer apoptose og cellecyklus progression er fast etableret, et utal af undersøgelser i det forløbne 15 år har tilskrevet et væld af yderligere biokemiske og cellulære funktioner til p53 [1], [6]. En transaktiveringsfunktion-uafhængig rolle af p53 i nedregulering af HR er blevet reproducerbart beskrevet af flere laboratorier, herunder vores egen [7], [8], [10], [14], [48]. Fordi omhyggelig styring af HR-aktiviteter er vigtig for respons på gået i stå eller kollapsede replikationsgafler, belyse rolle p53 i HR er afgørende for en bedre forståelse af tumor initiering og progression.

Vi viser her for første gang at p53 nedregulerer HR som reaktion på replikativ stress på en måde, der er uafhængig af dens rolle som en transkriptionsfaktor (figur 1, 2, 3). Vores data er i overensstemmelse med tanken om, at p53 rolle i HR er afhængig af interaktioner med RPA og ATR-kinase, hvilket implicerer p53 i ATR replikation checkpoint (figur 3, 5). Samlet set anti-rekombinogene funktioner replikationskontrolpunktet endnu ikke fuldt etableret [40], [49]. I fission gær, den Chk1 homolog inhiberer Mus81 og Rad60 funktion, for derved at forhindre uønsket rekombination [50], [51]. I højere eukaryoter, ATR phosphorylerer BLM, et kendt anti-rekombinogene faktor [52], [53]. På den anden side har ATR vist sig at fremme HR [46], [47]. I overensstemmelse med disse data, vores resultater indebærer, at både ATR og ATM fremme RAD51 foci-dannelse som reaktion på replikativ stress i en p53-uafhængig måde (figur 5). Der kan således eksistere en positiv og negativ (via p53) regulering af HR af ATR.

Med hensyn til potentielle begrænsninger af vores arbejde, en iboende begrænsning af foci undersøgelser er, at de ikke direkte kan måle protein aktiviteter på replikation gafler (figur 1, 3, 4). Imidlertid er foci slutpunkter almindeligt anvendt i litteraturen til at bestemme molekylære mekanismer og genetiske determinanter for HR [15], [46], [54]. For det andet, en lignende begrænsning gælder for vores plasmid (figur 2), som ikke kan være en nøjagtig måling af fysiologiske HR begivenheder, der er under p53 kontrol. For det tredje, mens alle vores og andre data tyder på, at de menneskelige p53QS mutant og mus p53-A135V (eller humane homolog) er funktionelt ækvivalente med hensyn til at undertrykke HR i en transaktiveringsfunktion-uafhængig måde (f.eks figur S2) [7], [10], [12], [13], kan vi ikke udelukke, at der kan være ukendte forskelle. Endelig har vi også advare om, at resultater opnået med en cellelinje, såsom H1299 lunge kræftceller i denne undersøgelse, kan ikke umiddelbart generaliseres til andre cellelinjer.

Hvad er de molekylære mekanismer, som S15 fosforylering af p53 kunne undertrykke HR? I en tidligere offentliggjort model, vil binding af RPA fra ssDNA hæmme efterfølgende lastning af RAD51, og dermed er et af midlerne, hvormed p53 undertrykker HR [10]. P53 N-terminus konkurrerer med ssDNA for OB-fold domæne af RPA1 s N-terminus [55]. Således har vi spekulere at mekanismer kan eksistere hvorved N-terminale phosphorylering af p53 fremmer binding til RPA1, hvilket kan indvirke på ssDNA-bindende affinitet af DNA-bindende domæner af RPA. For eksempel, ændret ssDNA-RPA binding kan føre til uforudset udslip af RPA fra ssDNA svækkende med ordentlig RAD51 lastning, eller p53 kan fælde RPA på ssDNA og forsinke RAD51 belastning. Der er stærke indbyrdes afhængighed mellem N-terminale p53 phosphoryleringssteder [56], [57]. I H1299 celler, mutere S15 fører til reduceret S37 fosforylering efter bestråling [57]. Interessant, Lowry et al. nylig fundet beviser for en kollapset region i uløseligt ustrukturerede p53 domæne med en løkke struktur centreret omkring rester 34-36 [58]. Disse forfattere foreslået, at S37 phosphorylering kan føre til en åben konformation af dette domæne og derved fremme binding til RPA1. Således ville mutation af S15 forringe HR indirekte gennem en hæmmende effekt på tilstødende S37 fosforylering.

Forestillingen om, at p53 kan undertrykke DSB reparation er kommet fra en række undersøgelser ser på effekten af ​​p53 på site-directed DSB i kromosomalt integreret plasmid substrater [7], [12], [59]. Vi fandt, at størrelsen af ​​den undertrykkende p53 virkning er korreleret med længden af ​​sekvenshomologi stede (Figur 2, S2). Vi postulerer, at pDT219 /pΔ2 systemet (figur 2) er repræsentativ for søsterkromatid reparation på grund af omfanget af tilgængelige sekvenshomologi er i kb rækkevidde. Mens vi anerkender, at en sammenligning mellem forskellige rekombinationssystemer har forbehold, en afhængighed af p53 er undertrykkende effekt på homologi længde er i fremragende aftale med en tidligere undersøgelse fra Wiesmüller et al. [12]. Disse forfattere, der brugte et panel af kromosomale EGFP-baserede substrater, viste, at nedregulering af genet konverteringshændelser ved p53 især var udtalt når længden af ​​fælles homologi blev reduceret til 168-233 bp. Det er muligt, at p53 danner en tærskel mellem korte og lange homologier, som kan hjælpe med at forebygge fejlbehæftet reparation og skadelige omlejringer ved forskydning af repetitiv DNA. En sådan model vil være i overensstemmelse med den observation, at cellulære p53 status ikke har nogen direkte effekt på gen-targeting og søsterkromatidudvekslinger, som typisk er medieret af lange homologier i størrelsesordenen kilobaser [60]. Denne model forudsiger også, at p53 ikke negativt vil påvirke reparation af kromatid DSB skyldes ioniserende stråling eller andre midler, hvilket er i overensstemmelse med celle overlevelsesdata [61]. Vore data antyder også, at HR færdighed målt med en I-Scel baseret plasmid, såsom PDR-GFP (fig S2) er ikke altid en god surrogatmarkør for HR-afhængig reparation af exogent DNA-beskadigelse. Endvidere seneste data tyder på, at HR-reparation af kromosomal I-Scel-induceret DSB er cellecyklusafhængig og underlagt transkriptionel regulering af p53 (Rieckmann et al., Ikke publiceret 2011). Således er det muligt, HR aktiviteter til afhjælpning af replikation stress eller regulær DSB differentielt reguleret af vildtype og mutant p53-varianter. Vi kan heller ikke udelukke, at de regulerende virkninger kan variere fra cellelinjer.

Endelig p53 ikke kompromittere RAD51 foci respons og celle overlevelse efter eksponering for tværbindingsmidlet MMC (figur 6). Tværtimod der var endda en lille stigning i celleoverlevelse efter ekspression af transaktiveringsassays-deficient p53 mutanter (figur 6E, S6). Den underliggende mekanisme er endnu ikke fastslået, men kan vedrøre en eventuel stabilisering af multi-protein-komplekser på replikationsgaflen ved p53 (LMM, HW, upublicerede data). Den observerede stigning i MMC modstand er i overensstemmelse med andre rapporter, som viser, at i mangel af apoptose, er tilstedeværelsen af ​​p53 associeret med cisplatin resistens [62], [63], [64]. I modsætning hertil i cellesystemer eller assays er modtagelige over for apoptose, er resistens over for DNA-beskadigende midler typisk forårsaget af tab af vildtype p53 [65], [66]. Samlet rolle p53 ved bestemmelse af celleoverlevelse som respons på DNA-skader er klart kompleks og en afspejling af p53 mange funktioner i apoptose, cellecykluskontrol, og DNA-rekombination. Studiet af disse spørgsmål i definerede cellesystemer er en lovende allé af undersøgelsen med potentielle kliniske relevans til behandling af maligne tumorer hvoraf de fleste har mistet p53 funktion. Hertil kommer, at biologiske betydning af p53 funktion i HR regulering, især med hensyn til dets rolle i tumor undertrykkelse, stadig at blive etableret.

Materialer og Metoder

Cellelinjer

NCI-H1299 lungecancerceller (p53-null) blev opnået fra ATCC og deres anvendelse har tidligere [10] blevet offentliggjort. A549 lungecancerceller blev også opnået fra ATCC. Muse embryonale fibroblaster (BALB /c 3T3 10.1 klon, p53-nul) var en gave fra Dr. Arnold Levine og deres anvendelse er blevet offentliggjort [14], [61]. H1299 /FRT-kloner der bærer forskellige p53 mutanter blev genereret i henhold til producentens anvisninger (Flp-In, Invitrogen). Kort fortalt, H1299-celler var elektro-transficeret med pFRT /LacZ efterfulgt af Zeocin (100 ug /ml, Invitrogen) markering til at etablere kromosomale integranter. Single-kopi integranter med lav transkriptionsaktivitet baseret på co-integrerede β-galactosidase reporter blev udvalgt til transfektion med forskellige pcDNA5 /FRT-p53-konstruktioner, samtidig med pOG44 til målrettet integration i FRT acceptor site. Efter selektion med 400 ug /ml Hygromycin (Invitrogen) blev kolonier ekspanderet og helcellelysater opnået at vurdere proteinekspression. For nogle forsøg H1299-celler bærer en tilfældigt integreret p53QS konstruere (pRc /CMV L22Q /W23S, venligt tilvejebragt af Anindya Dutta) blev anvendt. MEF’er blev transficeret med en ekspressionsvektor for p53-A135V og selekteret med 500 ug /ml G418 (Fisher Scientific), som tidligere [13] beskrevne. Alle cellelinjer testede mycoplasma-fri.

RNA-interferens

ATR blev ramt af en tidligere anvendt og valideret siRNA oligonukleotid, 5’CCUCCGUGAUGUUGCUUGAtt -3 “(Applied Biosystems) [67]. Eksponentielt voksende H1299-celler blev udpladet 16 timer før transfektion. ATR siRNA eller et kodet Kontrollen blev fortyndet i 100 pi Opti-MEM (Roche), hvilket gav en slutkoncentration på 100 nM, og blandet med 10 pi X-tremeGENE transfektionsreagens (Roche) i 100 pi i Opti-MEM. Kompleksdannelse lodes forløbe i 20 minutter ved stuetemperatur før dråbevis tilsætning til celler. siRNA komplekser blev inkuberet med celler i 4 timer, på hvilket tidspunkt cellerne blev ændret til normal vækst medier. Transfektionen blev udført to gange, 24 timer fra hinanden, for at opnå optimal knockdown. Hele cellelysater blev opnået efter 24 og 48 timer. Lysater blev denatureret og reduceret, og derefter kørt på 3-8% Tris-acetat gel (Invitrogen) i 2,5 timer ved 150 V. Prøverne blev overført til en PVDF-membran med en halvtør apparat (BioRad) i 1 time ved 12