PLoS ONE: Evaluering af Nanopartikel Optagelse i Co-kultur Cancer Models

Abstrakt

Co-kultur modeller er i øjeblikket at bygge bro mellem de klassiske kulturer og

in vivo

dyremodeller. Udforskning denne nye fremgangsmåde låser muligheden for at efterligne tumor mikromiljø

in vitro

, gennem etablering af kræft-stroma synergistiske interaktioner. Især disse organotypiske modeller tilbyder en perfekt platform for udvikling og præklinisk evaluering af kandidat nanocarriers lastet med anti-tumor lægemidler i en high throughput screening-mode, med lavere omkostninger og fravær af etiske spørgsmål. Men denne vurdering var, indtil nu begrænset til co-kultur, der er etableret med præcise celle nøgletal, ikke tage den naturlige celle heterogenitet almindeligt forekommende i forskellige tumorer. Derfor heri multifunktionelle nanocarriers effektivitet blev karakteriseret i forskellige fibroblast-MCF-7 co-dyrkningssystemer, der indeholder forskellige celle-forhold, med henblik på at opklare de vigtigste konstruktionsparametre, der påvirker Nanobærer ydeevne og det terapeutiske resultat. Den vellykkede etablering af co-kultur modeller blev bekræftet af vævslignende fordeling af de forskellige celler i kultur. Nanopartikler inkubation i de forskellige co-kultur systemer afslører, at disse nanocarriers besidder målrettet specificitet for kræftceller, hvilket indikerer deres egnethed til at blive brugt i denne sygdom terapi. Derudover ved at anvende forskellige co-kultur-forhold, blev der opnået forskellige nanopartikel uptake profiler. Disse resultater er af afgørende betydning for den fremtidige udformning og optimering af nye drug delivery systemer, da deres kapacitet reelle målretning skal løses i heterogene cellepopulationer, som dem der findes i tumorer

Henvisning:. Costa EF, Gaspar VM, Marques JG, Coutinho P, Correia IJ (2013) Vurdering af Nanopartikel Optagelse i Co-kultur Cancer Models. PLoS ONE 8 (7): e70072. doi: 10,1371 /journal.pone.0070072

Redaktør: Michiya Matsusaki, Osaka University, Japan

Modtaget: Januar 25, 2013; Accepteret: 15 Juni 2013; Udgivet: 26 Jul 2013

Copyright: © 2013 Costa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den portugisiske Foundation for Science and Technology (FCT), SFRH /BD /80402/2011, PTDC /EME-TME /103.375 /2008 PTDC /EBB-BIO /114.320 /2009 og Pest-OE /EGE /UI4056 /2011. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i det sidste årti den spirende udvikling af nanomedicin har tilskyndet sin hurtige anvendelse i udviklingen af ​​talrige strategier til behandling forringer sygdomme, der stadig er uhelbredelige [1]. I øjeblikket har de enorme teknologiske fremskridt opnået i design og produktion af nanoparticulated systemer til kræftbehandling stammer resultatet af stadig mere dygtige og målrettede specifikke nanocarriers, der reducerer bivirkningerne forbundet med klassiske anti-cancer behandlinger, og også øge patientens overlevelsesrate [ ,,,0],2]. Ofte omfattet af biokompatible uorganiske eller organiske materialer, nanocarriers er også i stand til at forøge biofordelingen og biotilgængelighed af lægemidler, som ellers ville være dårligt tilgængelige på deres målsteder [3]. Den fleksible natur af nanopartikler er nært korreleret med de forskellige materialer, der anvendes til deres syntese, såsom metaller (guld og sølv), keramik (hydroxyapatit), lipider (kolesterol og ikke-toksiske phospholipider) og polymerer (alginat, chitosan, PEG,) [4]. Blandt disse har chitosan været en af ​​de mest udbredt anvendt til syntese af en række nanoparticulated lægemiddeladministrationssystemer på grund af dets unikke egenskaber som bioforligelighed, stabilitet, let at være kemisk modificeret og lav immunogenicitet [5]. Disse unikke egenskaber kan yderligere skræddersys ved funktionalisering partikeloverfladen med cellespecifikke molekyler, såsom antistoffer, folinsyre, biotin, eller aptamerer [6], [7], der væsentligt øger Nanobærer specificitet mod målceller, beskyttelse normale celler mod lægemiddel -afledte toksiske bivirkninger [8].

Ikke desto mindre før de mange nanodevices øjeblikket under efterforskning bliver egnet til klinisk brug, de har til at overgå strenge tests fastsat af reguleringsorganer, såsom Food and Drug Administration (FDA ) og Det Europæiske Lægemiddelagentur (EMEA). Inkluderet i de forskellige evaluerings- faser, nanocarriers skal overvinde, biologiske sikkerhed og aktivitetsassays antager kritisk relevans i nanopartikel pipeline udvikling [9], [10].

Især for disse testningsform, opstår cellekulturer som en usædvanligt kraftfuld og økonomisk værktøj, i sammenligning med

in vivo

modeller. Faktisk tilbyder de en unik test platform til at undersøge virkningerne af forskellige narkotika formuleringer og nanopartikler designs, under meget kontrollerede og reproducerbare betingelser [11]. Desuden cellekulturer giver en nem måde at manipulere mange eksperimentelle variabler for at reproducere nogle af de

in vivo

betingelser, og samtidig undgå etiske og juridiske spørgsmål i forbindelse med håndtering af dyr [12]. Men indtil nu den rumlige organisering af væv og celle-celle interaktioner blev almindeligt bort i de fleste af de tilgængelige

in vitro

modeller [12]. For at overvinde sådanne begrænsninger en ny kategori af cellekulturer, kaldet co-kulturer, er under udvikling [13]. Dette nye koncept er designet med det formål at dække den manglende sammenhæng mellem klassiske cellekulturer og

in vivo

systemer (figur 1) [12]. Ved at bruge co-kulturer er det muligt at genskabe nogle af de

in vivo

væv nicher [14], da celle-celle-interaktioner er etableret i tæt kontakt. Denne kritiske parameter er afgørende for etableringen af ​​cellens morfologi, fænotype, metabolisme og spredning, funktioner, der er til stede

in vivo

[15], [16], [17], [18]. Derudover co-kulturer er også et perfekt værktøj til at analysere målrettet specificitet lægemiddelafgivelsessystemer for tumorceller [19].

Cellen kulturer er i stand til at efterligne

in vivo

væv uden de etiske og omkostninger spørgsmål i forbindelse med dyreforsøg.

i øjeblikket brystkræft er en af ​​de mest undersøgte malignitet [13]. Denne sygdom er den mest almindelige årsag til kræft dødsfald hos kvinder på verdensplan [20], [21]. Brystkræft mikromiljø består ikke kun af cancerceller, men også af fibroblaster, adipocytter, blodkapillærer, endotelceller immunsystemceller og ekstracellulær matrix (ECM) proteiner [13], ligesom kollagen og elastin. Trods at blive accepteret, at kræft generelt kan opstå fra genetiske mutationer [22], vækst, invasion, og metastase er ikke kun afhængig af disse mutagene hændelser. Faktisk erkendes det, at alle celler til stede i tumormikromiljøet virker synergistisk for at fremme tumorproliferation og spredning [23], [24]. Endvidere er det for nylig blevet rapporteret af Straussman et al., 2012, er, at stromale celler rekrutteret af cancerceller til at bede tumor drug-resistens og proliferation [25].

For nylig flere behandlinger mod kræft, som målretter også fibroblaster har vist sig at hindre denne sygdom progression [26]. Disse særlige celler er beskrevet som havende en afgørende rolle i tumoren niche [27], med heterogene populationer og forskellige relative sammensætning bestående i talrige tumorer [26]. Disse celler er involveret i metabolismen af ​​ECM, ved at fremme integrin signalering [28], [29]. Fibroblaster også secernerer og interagere med flere vækstfaktorer [25], [29], som hepatocytvækstfaktor (HGF), fibroblastvækstfaktor (FGF), insulinlignende vækstfaktor (IGF) og epitelial vækstfaktor (EGF), som er ansvarlig for aktiveringen af ​​mekanismer, der bidrager til apoptose resistens [30], [31], og fremme proliferation af maligne celler [32]. Alle disse skadelige egenskaber, har tiltrukket forskere opmærksomhed at udvikle co-kulturer, der indeholder disse celletyper i et forsøg på at efterligne den faktiske tumormikromiljøet [19], [33].

Fra denne stå punkt, den foreliggende undersøgelse karakteriserer cellens optagelse af funktionaliserede nanocarriers i co-kultur-modeller, for at løse deres selektivitet og biologiske aktivitet til kræftceller.

Materialer og metoder

Materialer

østrogen afhængig humant brystadenocarcinom (MCF-7) blev opnået fra ATCC (Middlesex, UK) og primære normale humane dermale fibroblaster (hFIB) fra Promocell (Heidelberg, Tyskland). De cellekultur T-kolber blev opnået fra Orange Scientific (Braine-l’Alleud, Belgien). Cell imaging plader blev erhvervet fra Ibidi GmbH (Ibidi, München, Tyskland). Rhodamin B isothiocianate (RITC), Trypsin, cellekultur Dulbeccos modificerede Eagles Medium F-12 (DMEM-F12), collagen type I, L-histidin, L-arginin,

N

– hydroxysuccinimid (NHS),

N

– (3-dimethylaminopropyl) –

N

-ethylcarbodiimide hydrochlorid (EDC) blev købt fra Sigma-Aldrich (Sintra, Portugal). Hoescht 33342® og CellLight 2.0® BacMam blev leveret af Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Ultrarent chitosan hydrochlorid (CH) (Protasan UP CL 113) blev opnået fra Novamatrix (Sandvika, Norge). Føtalt bovint serum (FBS) blev købt hos Biochrom AG (Berlin, Tyskland). (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre) blev indkøbt fra Tokyo Chemical Industry (TCI) (Tokyo, Japan). Alle andre reagenser blev anvendt uden yderligere rensning.

Co-kultur Modeller

At etablere forskellige co-kultur modeller MCF-7 og hFIB celler blev dyrket i 75 cm

2 celle T- kolber med DMEM-F12-medium suppleret med 10% (vol /vol) FBS og 1% streptomycin og gentamycin. Alle celler blev inkuberet ved 37 ° C, i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Ved opnåelse konfluens blev begge celler høstet under anvendelse 0,18% trypsin og 5 mM EDTA til opnåelse af to enkelte cellesuspensioner. Celler blev farvet med trypanblåt 4% og talt ved anvendelse af et hæmocytometer. Efterfølgende blev co-kulturer podet ved 01:01, 01:03, 01:05 og 03:01 MCF-7 til hFIB nøgletal på 6-brønds plader, med et samlet antal på 2 × 10

4 celler per brønd. Kontrolsystemer homotypiske kulturer af hFIB og MCF-7-celler blev podet ved anvendelse af samme totale antal celler per brønd i separate brønde. Co-kulturer og homotypiske kulturer blev opretholdt i DMEM-F12 komplet medium i alle eksperimenter. Udviklingen i co-kulturer i form af cellefordeling og morfologi blev analyseret ved anvendelse af et Olympus CX41 optisk mikroskop udstyret med et Olympus SP-500 UZ digitalkamera.

Syntese og karakterisering af Chitosan-histidin-Arginin

til syntesen af ​​den multifunktionelle polymer, CH blev kemisk modificeret med arginin (R) og histidin (H) gennem EDC /NHS-kobling [34], [35]. Til dette formål blev chitosan opløst (10 mM TEMED /HCL puffer, pH 6,0) til en koncentration på 1% (vægt /volumen). Efterfølgende NHS, EDC (0,6 mol: 1,5 mol) og L-histidin (0,7 mol: 1,0 mol glucosamin) blev efterfølgende tilsat til chitosanopløsningen. Reaktionen blev udført i 24 timer ved stuetemperatur. Den funktionaliserede polymer blev derefter dialyseret mod deioniseret vand (MWCO 12 000 til 14 000 Da). Det oprensede chitosan-H polymer blev derefter isoleret ved frysetørring. CH-H polymerskelet blev senere modificeret med L-arginin som førnævnte, hvilket gav CH-HR.

Medtagelsen af ​​aminosyrer i chitosan skelettet blev analyseret gennem H NMR (

1H NMR ) spektroskopi ved anvendelse af et Bruker Avance III 400 MHz spektrometer (Bruker Scientific Inc., NY, USA). Alle prøverne blev opløst i 1 ml DMSO-d

6 gennem omfattende sonikering og

1H spektre blev opsamlet med en gradient-baserede pulsprogram (zgesgp, Bruker), ved 298 K ved anvendelse af en spektral vindue på 9 kHz . NMR-spektre blev behandlet og analyseret med topspin 3.1 software (Bruker Scientific Inc., N.Y., USA). Desuden blev den aminosyresekvens koblingen også verificeret af svækkede totalreflektans-Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR) (protokol S1 i File S1 og fig S1). Den samlede grad af substitution af den oprindelige CH polymerskelettet blev bestemt ved ATR-FTIR, som tidligere beskrevet elsewere [36] (gennemsnit ± standardafvigelse .: 43.84 ± 6,67%;

n

= 3). Endvidere blev graden af ​​substitution også bestemt ved NMR-analyse ved integrering af histidin (δ = 8,1 ppm), arginin (δ = 7,41 ppm) og chitosan (δ = 1,3 ppm) karakteristiske toppe (Histidin forhold = 1,14; Arginin ratio = 0,39).

Nanopartikel Formulering og fysisk-kemiske karakterisering

for at sikre, at der findes genetisk materiale til indkapsling i nanocarriers blev pVAX1-LacZ plasmid oprindeligt forstærket i rekombinante bakterier og genvindes som tidligere rapporteret [37]. Kort fortalt, til formulering af chitosan-histidin-arginin /pDNA (CH-H-R /pDNA) nanopartikler blev polymeren opløst i acetatpuffer (pH 4,5) i den ønskede koncentration. Alle amino CH-H-R nanopartikler blev formuleret ved en tidligere optimerede amin til phosphat-forhold (N: P-forhold = 60). Nanopartiklerne blev syntetiseret ved tilsætning pDNA til polymeropløsningen ved 01:04 (v /v). Blandingen blev derefter kraftigt blandet i 1 min. Bagefter blev komplekserne stabiliseret ved stuetemperatur og udvindes ved centrifugering ved 18 000 g, i 30 min.

nanopartikler størrelse og zetapotentialet blev bestemt ved anvendelse af en Zetasizer Nano Zs instrument (Malvern Instruments, Worcestershire, GB) som vores gruppe tidligere beskrevet [37]. Alle eksperimenter blev udført ved 25 ° C, med engangs foldede kapillære celler, i automatisk drift. Dataene blev behandlet i Zetasizer software (v 6.2). Desuden blev nanopartikel zetapotentialet også screenet i en række forskellige pH-værdier (5,0 til 7,4), for yderligere at behandle pH interaktive egenskab ved dette system under forskellige betingelser. PH-screening blev udført ved resuspension af nanopartikler i buffere med en egnet bufferkapacitet (Acetate buffer, 10 mM, pH 5,0; citratbuffer 10 mM, pH 6,0 og pH 6,5; HEPES-buffer 10 mM, pH 7,0 og pH 7,4). Alle puffere blev tidligere filtreret gennem et 0,22 um filter.

De fremstillede nanopartikler blev også analyseret ved scanningselektronmikroskopi (SEM). Forud for SEM-analyse blev nanopartikler prøver farvet med 0,1% phosphorwolframsyre og sonikeret. Bagefter blev nanopartikel suspension dispergeret i aluminium stubbe, og katodecoatet med guld efter tørring ved stuetemperatur. Nanopartikler prøver blev derefter visualiseret på en Hitachi S-2700 (Tokyo, Japan) elektronmikroskop konfigureret med optimale indstillinger for billedbehandling nanostørrelse materialer.

In vitro

nanopartikler Cell Optagelse

in vitro

nanopartikel optagelse i de forskellige co-kultur systemer (01:01, 01:03, 01:05, 03:01) blev analyseret ved konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM). For at skelne hFIB celler fra MCF-7, sidstnævnte blev mærket med den CellLight 2.0® BacMam Actin-grønt fluorescerende protein (GFP) probe ved at følge fabrikantens protokol. Før cellepodning, de billeddannende pladerne var overflade overtrukket med kollagen I, i 30 minutter, som anbefalet af producenterne. Efter udbrud af GFP-ekspression, diverse MCF-7 /GFP til hFIB forhold blev sub-dyrket på 8 og μ-Slide Ibidi plader ved en densitet på 2 x 10

4 celler pr. Cellerne blev dyrket i DMEM-F12-medium suppleret med 10% (vol /vol) FBS, ved 37 ° C i befugtet atmosfære med 5% CO

2. Efter den første dag i co-kultur, blev cellerne inkuberet med CH-H-R nanopartikler fyldt med RITC-mærket pDNA (1 ug /cm

2) i 4 timer [38]. Nanopartiklerne blev også inkuberet i monokulturer af hFIB, MCF-7 og Actin-GFP MCF-7-celler. Desuden blev MCF-7-celler farvet med GFP og inkuberes med nøgne RITC-pDNA anvendt som kontroller (Figur S2). Efter en 4 timers inkubation blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter, vasket grundigt med PBS og farvet med Hoechst 33342® nukleare sonde ved stuetemperatur. Cell imaging blev udført på et Zeiss LSM 710 laser scanning konfokal mikroskop (Carl Zeiss SMT Inc., USA) ved anvendelse af en plan-Apochromat 40 × /1,4 Oil DIC mål. Billederne af prøverne blev erhvervet i z-stak tilstand med en skive tykkelse på 0,23 um. Ortogonal sektionering og 3D-rekonstruktion af de forskellige z-stakke blev udført i Zeiss LSM Zen software (2010).

flowcytometrianalyse af Nanopartikel Optagelse

Virkningen af ​​forskellige co-kultur-forhold på omfanget og specificiteten af ​​nanopartikel optagelse blev analyseret ved flowcytometri ved anvendelse af en BD FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson Inc., USA). Kort fortalt, for optagelsesforsøg, co-kulturer blev podet i 6 brønds kulturplader med i alt 2 × 10

5 celler pr. Celler blev dyrket i 24 timer i DMEM-F12-10% FBS forud for alle forsøg. Desuden blev co-kulturer og monokulturer af hFIB og MCF-7 anvendt som kontroller til at etablere de korrekte gating og erhvervelse parametre i FL-1 (530/30 nm (GFP)) og FL-2 (585/42 nm ( RITC)) kanaler (fig S3). Til analysen af ​​nanopartikel optagelse i de forskellige co-kulturer CH-H-R nanopartikler blev fremstillet med frisk mærket RITC-pDNA (1 ug /cm

2) og inkuberet med cellerne i 4 timer. Bagefter blev cellerne skyllet grundigt med iskold PBS og høstet med 0,18% trypsin /5 mM EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre). For flowcytometrianalyse blev cellerne resuspendend i 600 pi af frisk PBS. Dataindsamling blev udført i CellQuest ™ Pro software, hvor 8 × 10

3 hændelser blev registreret i de indhegnede områder af interesse tildelt hFIB og MCF-7 celler. Flowcytometri data blev analyseret i prøveversionen af ​​FCS express v.4 forskning edition software (De Novo Software, Ontario, Canada). Til beregning af celleprocenten et lukket område der spænder fra 10

1 til 10

4 blev anvendt. Denne region er afgrænset af en markør i histogrammerne og svarer til R2 kvadrant i dot plots. Alle histogrammer af ikke-behandlede kontroller blev trukket til histogrammerne opnået for de forskellige forhold.

Resultater

Co-kulturer af MCF-7 og hFIB

I første omgang anderledes brystkræft co-kultur modeller blev etableret ved hjælp af forskellige celle nøgletal, der tidligere blev beskrevet i litteraturen som værende beskrivende for

in vivo

-mimicking betingelser, nemlig, 01:01; 01:03; 01:05; 03:01, MCF-7 til hFIB celler [19], [39], [40], [41], [42]. Udviklingen af ​​de etablerede co-kultur modeller er præsenteret i figur 2.

Co-kulturer af MCF-7 til hFIB af forholdet: 01:01 (A1-A5), 01:03 (B1-B5) , 01:05 (C1-C5), og 03:01 (D1-D5). Monokulturer af MCF-7 (E1-E5) og hFIB (F1-F5) blev anvendt som kontroller. Original forstørrelse 100 ×.

Gennem analysen af ​​figur 2, er det tydeligt, at celler er vedhængende og stand til at forblive i co-kultur i flere dage uden løsrivelse eller unormal celledød. Interessant nok i co-kulturer, der blev etableret med flere fibroblaster end brystkræftceller (Figur 2 B1-B5 og C1-C5), MCF-7 celler udviklede en svag tendens til at danne agglomerater omgivet af fibroblaster. Dette byområde er især tydeligt efter 8 dages co-kultur (figur 3), og det er forbundet med de fænotypiske karakteristika af brystkræftceller, der er organiseret i acinære strukturer [43].

Co-kulturer af MCF- 7 og hFIB 01:01 (A, B) og 01:05 (C, D). Oprindelig forstørrelse 100 ×.

Syntese og karakterisering af CH-H-R Multifunktionel Polymerer

Tilsætning af aminosyrerester til chitosan skelettet blev bekræftet ved

1H NMR-spektroskopi. Resultaterne i figur 4 A og B viser tilstedeværelse af yderligere proton toppe ved δ≈1.5 ppm (-CH

2-, L-arginin og L-histidin, nummer 1) og δ≈2.8-3.0 ppm (-CH

2NH-, L-arginin, nummer 2) i sammenligning med spektrene for chitosan alene. Signalerne, der svarer til C

3-C

6 carbonatomer i chitosan er maskeret af opløsningsmiddeltoppe. Chitosan anomere carbon signaler opnås mellem δ≈4.6-4.9 (nummer 7 og 7 *) [44]. Protonen signal ved δ≈1.9 ppm (nummer 6) svarer til -CH

3 grupper knyttet til acetamido dele med chitosan [44]. Eksistensen af ​​den karakteristiske peak proton δ≈7.41 ppm (-NHCH = NHNH

2, nummer 3) tildeles guanidin funktionelle gruppe [45] til stede i L-arginin tyder den vellykkede integration af denne aminosyre. Derudover, udseendet af karakteristiske proton toppe af L-histidin imidazolringen δ≈8.0-8.5 ppm (-N = CH-NH-, nummer 5) viser også dets optagelse i chitosan polymer. Histidin præsenterer også proton toppe ved δ≈7.1-7.2 ppm, der svarer til den H2 hydrogen (HN-CH-C, nummer 4) i imidazolringen. Disse resultater er i overensstemmelse med dem, der opnås ved ATR-FTIR-analyse (figur S2).

1H NMR spektre af umodificeret CH (A) og CH-H-R (B og D). Zeta potentiale (C) og SEM-analyse (D) af CH-HR /pDNA nanopartikler henholdsvis.

nanopartikelformulering og fysisk-kemiske karakterisering

syntese af CH-HR /pDNA nanopartikler blev fremmet af etableringen af ​​attraktive elektrostatiske kræfter mellem den positivt ladede polymer rygrad og de negativt ladede pDNA biomolekyler. Nanopartikel størrelse karakterisering ved dynamisk lysspredning (DLS), viste, at de nanodevices fremstillet gennem denne proces har sub-cellulære størrelse i nanoskala område (figur 4C), en værdifuld egenskab, hvis terapeutiske anvendelser er forudset. SEM-analyse viste også, at partikler udgør en sfærisk morfologi (figur 4D). Derudover viser analysen af ​​zetapotentialet viste, at overfladeladningen af ​​nanopartiklerne er yderst positiv og i området partikelstabilitet,

dvs..,

Ingen partikelaggregering blev observeret (figur 4 C og D). Ændringen af ​​zeta-potentialet af nanopartiklerne med miljømæssig pH blev også undersøgt for yderligere at støtte erhvervelsen af ​​en pH-reagerende adfærd, når de aminosyredele blev podet i native chitosan (figur 5). De opnåede resultater viser, at nanopartiklerne har en høj positiv ladning i området lysosomale pH (pH 5,0 til 6,0). Interessant, ved højere pH, overfladeladningen af ​​nanopartiklerne aftager, illustrerer deprotonering af de primære aminer med chitosan og det positivt ladede imidazol i histidin (figur 5).

Skematisk repræsentation af zetapotentialet falde som en funktion af pH. Data præsenteres som gennemsnit ± sd

Effekt af Cell Ratio på effektiviteten af ​​Nanopartikel Cellular Optagelse

Efter bekræftelse af vellykket syntese af nanoparticulated systemer, og at MCF-7-hFIB celler forblev stabil i co-kultur blev forskellige celle nøgletal derefter etableret i co-kultur med det formål at skabe en platform til at vurdere celle uptake begivenheder et multifunktionelt nanopartikel-system består af CH-HR og pDNA. Cellulær optagelse af nanopartiklerne blev indledningsvis karakteriseret ved konfokal mikroskopi for at vurdere deres celle internalisering kapacitet. Analysen af ​​3D-rekonstruktion af co-kultur modeller viser, at nanocarriers er udstrakt til stede i cytoplasmaet (figur 6 A). PDNA nanopartikler er også lokaliseret i cellekernen som vist i ortogonale skiver (figur 6 B, B1, B2, hvide pile) og nukleare sektioner (Figur 6 C, hvide pile). Desuden blev en colokalisering analyse også udført for yderligere at bekræfte disse resultater. Som vist i figur 6 D (colokalisering kanal – grå farve) der er en synlig colokalisering mellem RITC-mærkede nanocarriers og det intracellulære rum (lilla pil). Derudover nukleare colokalisering illustrerer også eksistensen af ​​nanocarriers i den nukleare rum.

konfokal mikroskopi billeder af MCF-7 brystcancerceller efter 4 timers inkubering med nanocarriers (A, B), ortogonale skæring i xy aksen (B1, B2), 3D-rekonstruktion af cellekernen (C). Colokalisering Røde og grønne kanaler (D). En lokalisering af de røde og blå kanaler. Rød kanal – RITC mærket pDNA /CH-H-R; Grøn kanal – Actin-GFP farvning af MCF-7 Blå Channel – Hoechst 33342® nukleare farvning. Grå kanaler:. Colokalisering analyse

Nanodevice målrettet kapacitet blev også evalueret i de forskellige co-kultur modeller af konfokal mikroskopi og flowcytometri ved mærkning pDNA stede i nanopartikler med RITC og også kræftceller med et GFP actin probe. Gennem denne fremgangsmåde var vi i stand til at skelne nanopartikel optagelse i begge celletyper (figur 7). Analyse af forskellige CLSM billeder, vi se, at for de forskellige co-kultur-forhold, nanopartikel internalisering er markant højere i MCF-7-celler i sammenligning med hFIB (figur 7). Faktisk flowcytometri analyse bekræfter bemærkninger CLSM billeder. Figur 8 viser, at CH-R-H /pDNA nanopartikler indtaste fortrinsvis i MCF-7 cancerceller, i bekostning af hFIB, for alle co-kultur-forhold. Dette fund understreger en mulig selektivitet dette system i retning af maligne celler i heterogene mikromiljøer. Endvidere nanopartikler optagelsesforsøg i monocultured MCF-7-celler og hFIB viser, at nanocarriers er mere internaliseres i maligne celler end i normale celler (fig S4), yderligere at understrege resultaterne opnået for de co-kultur eksperimenter.

co-kulturer af MCF-7 til hFIB i forhold på: 01:01 (A-C), 01:03 (D-F), 01:05 (G-i) og 03:07 (J-L) efter 4 timers inkubation med nanopartikler. Rød kanal – RITC-mærket pDNA /CH-H-R nanopartikler; Grøn kanal – Actin-GFP farvning af MCF-7; Blå Channel – Hoechst 33342® nukleare farvning; Grå Channel: DIC; Merged -. Overlejring af alle kanaler

Repræsentative dot plots af nanopartikel optagelse i de forskellige co-kultur forhold (A-D). R2 kvadrant blev anvendt som en gate for histogram analyse. Repræsentative histogrammer af nanopartikel optagelse i MCF-7-celler (E-H) og hFIB (I-L) populationer med forskellige co-kultur-forhold efter 4 timers inkubering med RITC-mærkede pDNA /CH-HR nanopartikler.

diskussion

i øjeblikket har nødvendigheden af ​​at forbedre effektiviteten af ​​anticancer-midler fremmet udviklingen af ​​dygtige nanoskala fremføringsmidler, der er i stand til at reducere lokaliserede og systemiske bivirkninger af konventionelle kemoterapeutika [8]. Disse nanodevices besidder en række unikke egenskaber, der forbedrer de farmakokinetiske og farmakodynamiske profil af bioaktive molekyler, hvilket øger deres biotilgængelighed ved målsteder [6]. Faktisk, på grund af deres alsidighed, nanocarriers kan manipuleres til selektivt genkender målrette tumorceller og omgå first pass metabolisme, fagocytose eller hurtig blodclearance, faldende sandsynligheden for off-target begivenheder [3]. Desuden når lokaliseret i det cellulære rum, nanocarriers beskytte deres last fra naturlige lægemiddel-resistensmekanismer i tumorceller, såsom de afhængige ABC transportører, og også vejlede de terapeutiske molekyler til deres intracellulære mål [46]. Alle disse centrale egenskaber er meget afhængige af de forskellige stadier af Nanobærer design og montage. Derfor er afgørende for dens vellykkede anvendelse

in vivo en ordentlig evaluering under nanopartikel udviklingsprocessen.

Faktisk evalueringen af ​​nye doseringssystemer skal være grundigt udføres for at forhindre potentielle sundhedsmæssige risici og identificere optimale egenskaber [9]. Generelt er prækliniske evaluering af den biologiske ydeevne af en nanodevice udføres både

in vitro

under anvendelse cellekulturer, og

in vivo,

med dyremodeller. Imidlertid har den aktuelle efterspørgsel på at reducere dyreforsøg på grund af de dermed forbundne etiske og økonomiske spørgsmål bedt udviklingen af ​​alternative metoder såsom cellekulturer. med henblik på at frigøre det fulde potentiale af cellekultur modeller og få mere livagtige resultater, forskellen mellem simple cellekulturer og

in vivo

væv skal imidlertid blive reduceret. Derfor har udviklingen af ​​nye modeller baseret på co-kulturer frembragt muligheden for at efterligne tumorvæv på en sådan måde, at det fysiologiske miljø fundet

in vivo

kan replikeres

in vitro

. Test Nanobærer kandidater i disse co-kulturer systemer, giver mere præcise resultater, da disse reproducere tumor progression, lægemiddelresistens og også celle-celle kommunikation [47]. Alle disse begivenheder i sidste ende påvirker den biologiske ydeevne af et givet Nanobærer system og dets lastede bioaktive molekyler.

Derfor bliver det værdifuldt at karakterisere nanopartikel cellulær optagelse ved sam-dyrkning modeller til at vurdere deres målretning specificitet. Ikke desto mindre, da virkningen af ​​nanopartikler kan ændre sig alt efter egenskaberne ved de tumor mikromiljøer, evaluere forskellige betingelser er et afgørende krav i præklinisk udvikling. Gennem denne analyse kan derefter indstilles virkningen af ​​funktionaliserede nanopartikler mod maligne celler afhængigt af tumoren niche og dens omgivende normale celler. Til det, bliver det vigtigt at udvikle forskellige co-kultur modeller, der gengiver dynamiske miljøer. Således blev heri chitosan funktionaliserede nanopartikler testet i co-kulturer med forskellige maligne-til-normal-forhold. For at udføre disse assays blev forskellige forhold af hFIB og brystcancerceller (MCF-7), der anvendes. Disse modeller blev etableret ved at tage hensyn til tidligere rapporter, hvor disse særlige celle nøgletal blev brugt til at efterligne kræft miljøer [19], [39], [40], [41], [42]. Figur 2 viser den høje proliferationshastighed af begge celletyper, uden unormal celledød, sammenlignet med deres monokultur modstykker. Desuden er resultaterne vist i figur 2, bekræfter de gode interaktioner mellem MCF-7 brystkræftceller og hFIB, og derfor den vellykkede etablering af disse co-kultur-modeller.

Med hensyn til celle morfologier, de optiske billeder (figur 2 ) viser, at begge celletyper bevare deres fænotypiske træk. Cancerceller fastholdt deres epithelmorfologi, med en polygonal form [48], [49].