PLoS ONE: HIF-1α Fremmer Epithelial-Mesenchymale Transition og Metastase gennem direkte regulering af ZEB1 i kolorektal cancer

Abstrakte

Det er velkendt, at hypoxi-inducerbare faktor 1 alfa (HIF-1α) er involveret i kræft metastase, kemoterapi og dårlig prognose. Vi har tidligere fundet, at deferoxamin, en hypoxi-mimetisk middel, inducerer epitel-mesenkymale overgang (EMT) i kolorektal cancer. Derfor her udforskede vi en ny molekylær mekanisme for HIF-1α bidrager til EMT og cancermetastase gennem binding til ZEB1. I denne undersøgelse viste vi, at overekspression af HIF-1α med adenovirus infektion fremmes EMT, celle invasion og migration

in vitro

in vivo

. På et molekylært niveau, HIF-1α direkte binding til den proksimale promotor af ZEB1 via hypoxi respons element (HRE) sites dermed øge transactivity og udtryk ZEB1. Desuden inhibering af ZEB1 kunne ophæve HIF-1α-induceret EMT og celleinvasion. HIF-1α ekspression blev stærkt korreleret med ekspressionen af ​​ZEB1 i normal colorektal epitel, primære og metastatiske CRC væv. Interessant, blev begge HIF-1α og ZEB1 positivt associeret med vimentin, en vigtig mesenkymale markør for EMT, mens negativt forbundet med E-cadherin udtryk. Disse resultater antyder, at HIF-1α forbedrer EMT og cancermetastase ved at binde til ZEB1 promotoren i CRC. HIF-1α og ZEB1 er begge almindeligt anset som tumor-initierende faktorer, men vores resultater viser, at ZEB1 er en direkte nedstrøms for HIF-1α, hvilket antyder en hidtil ukendt molekylær mekanisme for HIF-1α-inducerende EMT og cancermetastase.

Henvisning: Zhang W, Shi X, Peng Y, Wu M, Zhang P, Xie R, et al. (2015) HIF-1α Fremmer Epithelial-Mesenchymale Transition og Metastase gennem direkte regulering af ZEB1 i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (6): e0129603. doi: 10,1371 /journal.pone.0129603

Academic Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

Modtaget: Februar 3, 2015; Accepteret: 11 maj 2015; Udgivet: 9 Jun 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er til rådighed inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81172057, 81302159), præsident Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2012C003, 2012B009), og på højt niveau emne tilsvarende midler fra Nanfang Hospital (G201227)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er en afgørende begivenhed i cancermetastase, hvorunder polariseret epitelceller er tilbøjelige til at opnå visse tegn af mesenchymale celler, samt mere migration og invasive egenskaber [1]. De molekylære hallmarkers under EMT omfatter nedreguleres epiteliale markører (f.eks E-cadherin, plakoglobin og desmoplakin), opreguleret mesenchymal markører (f.eks vimentin, N-cadherin og α-glatmuskelactin) og forøget ekspression af transkriptionsfaktorer sådanne som sneglen, Slug, Twist, zinkfinger E-box binding homeobox 1 (ZEB1), ZEB2, og /eller E47, som kan binde til E-cadherin promotoren og inhibere dens transkription aktivitet og ekspression [2]. Især er tabet eller nedregulering af E-cadherin for at være den primære og vigtigste trin med EMT. E-cadherin kan afbrydes ved forskellige mekanismer, herunder afvigende methylering og transkriptionel undertrykkelse. Blandt dem, er dens transkription regulering bredt undersøgt i forskellige af maligne tumorer [3].

Hypoxi-inducerbar faktor 1 alfa (HIF-1α) er blevet rapporteret at fremme EMT i flere typer af tumorer gennem modulering én eller mere EMT-associerede gener [4]. Som en transskription faktor, HIF-1α regulerer aktiviteterne i dens downstream gener gennem binding af hypoxi respons element (HRE) i deres promotorregioner. For eksempel, HIF-1α er i stand til at transaktivere matrix metallopeptidase 9 (MMP9) i brystcancer [5]. I hepatocellulært carcinom, det aktiverer Snail dermed undertrykke E-cadherin udtryk [6]. Endvidere HIF-1α konkurrerer med transkriptionsfaktor 4 (TCF4) til direkte binding til p-catenin dermed fremme EMT i colorektal cancer [7]. Derfor findes der en tæt sammenhæng mellem EMT og HIF-1α udtryk i kræft med de mekanismer ukendte.

ZEB1 er en afgørende transkriptionel faktor EMT [8-10]. Men sammenhængen mellem HIF-1α og ZEB1 er lidt kendt. I denne undersøgelse viste vi, at HIF-1α overekspression inducerede EMT og metastatiske fænotyper i CRC. HIF-1α direkte regulering ZEB1 ekspression gennem hypoxi responselementet 3 (HRE-3), som er beliggende i ZEB1 proximale promotor. Undertrykkelse af ZEB1 vendt disse virkninger fremkaldt af HIF-1α overexpresssion. Ekspressionsprodukterne profiler af HIF-1α, ZEB1 og vimentin var meget ens i CRC patienter, som var modsat E-cadherin ekspression. Disse resultater indikerer, at CRC progression og metastase, induceret af HIF-1α, medieres af direkte regulering af ZEB1.

Materialer og metoder

Celler og kliniske prøver

CRC cellelinier HT29 og HCT116 blev holdt i vores laboratorium, på betingelse med RPMI 1640 (GIBCO) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) som tidligere [26] beskrevne. Menneskelig CRC og efter tilstødende normale væv blev opnået fra ti patienter med CRC, som gennemgik koloskopi; human CRC og de matchede metastatisk lymfeknude væv blev opnået fra toogtredive CRC patienter, som gennemgik hemicolectomy i Nanfang Hospital (Guangzhou, Kina). Disse personer gav os deres skriftligt informeret samtykke (som skitseret i PLoS samtykkeerklæring) at deltage i denne undersøgelse og offentliggøre disse case detaljer. Undersøgelserne anvender humant væv blev gennemgået og godkendt af udvalgene for etisk gennemgang af forskning med mennesker i Nanfang Hospital, Southern Medical University (Permit nummer: NFYY-2012-75).

Konstruktion og produktion af rekombinant adenovirus

HIF-1α-udtrykkende plasmid, pDC316-HIF-1α-EGFP, blev konstrueret ved insertion i fuld længde HIF-1α cDNA i restriktionsstederne mellem Nhel og Notl endonukleaser i pDC316 ekspressionsvektor, som indeholdt EGFP (pDC316-EGFP). For stabil knockdown af ZEB1 blev følgende sekvenser klonet ind pDC316-HIF-1α-EGFP. shZEB1 fremad: 5′-GATCCCCAGATGATGAATGCGAGTCGttcaagagaTGACTCGCATTCATCATCTTTTTTGGAAA-3 ‘og shZEB1 revers: 5′-AGCTTTTCCAAAAAAGATGATGAATGCGAGTCAtctcttgaaCGACTCGCATTCATCATCTGGG-3’ som beskrevet tidligere [8]. Begge plasmider blev verificeret ved DNA-sekventering.

Alle adenovirus, herunder adenovirus 5 udtrykker HIF-1α (Ad5-HIF-1α), HIF-1α overekspression og ZEB1 knockdown (Ad5-HIF-1α-shZEB1) og kontrol, Ad5-EGFP, blev dannet ved anvendelse AdMax adenovirus pakkesystem (Microbix Biosystems Inc., Ontario, Canada) ifølge producentens instruktioner. Storstilet amplifikation af ovennævnte adenovirale vektorer blev udført i HEK293T celler ved homolog rekombination mellem en shuttle plasmid (pDC316) og en rygrad plasmid (pBHGlox_E1, 3Cre). Titere af de oprensede vira blev bestemt ved standard plaque-dannende assay ifølge producentens instruktioner (Virapur, San Diego, CA).

adenovirusinfektion in vitro

HT29 og HCT116-celler blev dyrket til 80% konfluens. Efter vask med phosphatbufret saltvand (PBS) blev cellerne inkuberet med Ad5-EGFP og Ad5-HIF-1α ved MOI på 0,1, 1, 10, 100 og 1000, hhv. Halvfems minutter efter infektion blev virus erstattet af regelmæssig vækstmedium. 24 eller 48 timer efter infektion, effektiviteten af ​​transduktion af EGFP udtrykkende konstruktioner blev observeret under immunfluorescensmikroskopi og HIF-1α ekspression blev analyseret ved PCR eller western blot.

Reverse transcription polymerase kædereaktion (RT-PCR) blev kvantitativ real-time PCR (qPCR) og Western blotting-analyse

Disse assays gjort væsentlige som tidligere [27-29] beskrevet. Primere anvendt til RT-PCR var som følger: HIF-1α sense: 5′-TCCATGTGACCATGAGGAAA-3 ‘og antisense: 5′- CCAAGCAGGTCATAGGTGGT-3′; primere anvendt til qPCR var som følger: HIF-1α: 5’- TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA 3 ‘(sense) og 5′-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG 3′ (antisense); ZEB1: 5’-CCTGTCCATATTGTGATAGAGGC-3 ‘(sense) og 5′-ACCCAGACTGCGTCACATGT-3′ (antisense); glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH): 5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 ‘(sense) og 5’CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’ (antisense). De primære antistoffer, HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton, CO), ZEB1 (Santa Cruz), E-cadherin (Santa Cruz), vimentin (forud fortyndet, Abcam), plakoglobin (Abcam), N-cadherin (Santa Cruz) og GAPDH (Abcam) var alle kommercielle produkter.

Migration, invasion og sårheling analyser

Ubestrøget Costar transbrøndene (Corning Costar Co., Corning, NY) blev anvendt til migration assays og Matrigelcoatede transbrøndene (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) anvendes til invasion assays. Celler blev serum sultet natten over og derefter podet i det øvre kammer med serumfrit RPMI 1640-medium. RPMI 1640 suppleret med 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer. Celler, der var migreret hen over transwell membranen blev farvet og kvantificeret. Til sårheling assay blev ridsen foretaget over cellemonolaget under anvendelse af en steril spids. Cellers evne til at migrere overvågedes på forskellige tidspunkter under anvendelse af et lysmikroskopi

Histologisk og immunhistokemisk analyse

hematoxylin og eosin (H 10% af cancerceller bliver positivt farvede ansås som positiv. Til kvantitativ analyse blev forholdet af positivt farvede celler til alle tumorceller i fem tilfældige områder ved 200 ganges forstørrelse beregnes. Alle histologiske evalueringer herunder procentdelen af ​​positive celler blev udført i en dobbelt-blind måde af to patologer at minimere observational bias.

elektroforetiske mobilitet (EMSA)

EMSA blev udført under anvendelse af en dobbeltstrenget oligonukleotid, der indeholder en konsensus bindende sekvens for HIF-1α som beskrevet tidligere [27, 28]. Følgende sekvenser af sensestrenge blev brugt til de bindende og konkurrencemæssige analyser: sekvenser, der indeholder vildtype HRE (P1: 5’GAGGCGTGGGACTGATGGTAGCC -3 “, -521 ~ -517 nt; P2: 5’GGGGGCGGACACGCGAGG -3 ‘-529 ~ – 525 nt; P3: 5′-CCGGTCGCCGCGTGTCCTCGCC -3 “, -634 ~ -630 nt; P4: 5’-ATACTCCGGTCACGTTTCAGTTTTCTC -3”, -1347 ~ -1342 nt) og efter mutant HRE-sekvenser (P1-mut: 5 ‘ – GAGGCACAGGACTGATGGTAGCC -3 «P2-mut: 5’-GGGGGCGGATGTGCGAGG -3« P3-mut: 5’CCGGTCGCCGCACATCCTCGCC -3 ‘og P4-mut: 5’ATACTCCGGTTGTGTTTCAGTTTTCTC -3). Nukleotiderne blev endemærket med [γ-32P] ATP (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Fremont, CA) og T4-polynukleotidkinase (Promega). Nukleare ekstrakter fra celler inficeret med Ad5-HIF-1α-EGFP og kontrollen blev fremstillet og anvendt i ambulancereddere som vi beskrev tidligere [28]. Og blev inkuberet i 1 × bindingsbuffer indeholdende 2,5% glycerol, 50 ng /pl poly (dI-dC), 5 mm MgCl2, 0,05% Nonidet P-40, og 4 pmol biotin-mærket oligonukleotid i et totalt volumen på 20 pi ved stuetemperatur i 20 min. De bundne blandinger blev størrelsesfraktioneret på en denaturerende 6% polyacrylamidgel ved 180 V i 0,5 × TBE-buffer. Gelen blev efterfølgende tørret og autoradiograferet.

Generering af rapporten plasmider, Transient transfektion og Luciferaseassayreagens

Produktion af vildtype og mutant reporterkonstruktioner blev udført som vi tidligere beskrevet [29]. En 567 bp af ZEB1 promotor fragment indeholdende HRE-3 element blev klonet i pGL3-vektoren for at generere vildtype reporter konstrukt, navngivet som pluc-567. Mutation ved de HRE-3-motiver (pluc-567-mut) blev indført i pluc-567 luciferase konstruktion med QuikChange steddirigeret mutagenese kit (Stratagene, La Jalla, CA, USA). Begge konstruktionerne blev verificeret ved sekventering. Celler blev inficeret med Ad5-EGFP eller Ad5-HIF-1α i 48 timer efterfulgt af transfektion med pluc-567 eller pluc-567-mut og pRL-CMV (

Renilla

luciferase). Den transaktiveringsfunktion potentiale blev testet med Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) ved at måle luciferase aktivitet efter 48 timer.

Nude mus og metastase assay

Dette dyr eksperiment var udføres i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for IACUC (Institutional Animal Care og brug Udvalg), og protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg af Nanfang Hospital (Permit nummer: NFYY-2013-56) . Alle operationer blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Efter operationen blev alle nøgne mus aflivet ved natriumpentobarbital anæstesi. Seks uger gamle BALB /c nøgne mus blev købt fra Guangdong Provincial Experimental Animal Center (Guangzhou, Kina) og tilfældigt opdelt i fire grupper (Ad5-EGFP: N = 8; Ad5-HIF-1α: N = 12; Ad5- HIF-1α-shRNA: N = 5; Ad5-HIF-1α-shZEB1: N = 5), før injektion. Dyr blev udsat i intraperitoneal anæstesi med 40 mg /kg amobarbital natrium opløsning. Efter musene dybt bedøvet, blev en lille langsgående øverste venstre flanke indsnit og milt blev forsigtigt blottet. Single suspenderede celler (1,5 x 106 celler /mus) blev injiceret i 70 pi PBS under milten kapsel. Efter fjernelse af nålen blev injektionsstedet presset med en aseptisk bomuld svamp at forhindre lækage. Efter dette blev milten tilbage i bughulen og periotneium og bugvæggen blev syet med silke [30-32]. Mus blev aflivet efter 5 uger, blev muligheden for metastase analyseret og de metastatiske steder indsamles for H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

HIF-1α overekspression induceret EMT in vitro

For at få en bedre infektion effekt af adenovirus i CRC kræftcellelinjer, HT29 og HCT116 celler blev først transduceret med adenovirus 5 udtrykker forstærket grønt fluorescerende protein (Ad5-EGFP) eller Ad5-HIF-1α-EGFP ved infektionsmultiplicitet (MOI) på 10, 100 og 1000, henholdsvis med de virkninger, der registreres ved mikroskopi på 48 timer (fig 1a). Næsten 100% af cellerne udtrykte EGFP med en MOI på 100, som var meget lig en MOI på 1000. RT-PCR (Fig 1B venstre) og western blot (Fig 1B højre) resultater bekræftede den dramatiske stigning af HIF-1α ekspression . Samme virkning blev fundet i HCT116-celler (data ikke vist). Derfor blev MOI på 100 vedtaget i alle de følgende eksperimenter. Salg

(A) HT29-celler blev transduceret med Ad5-HIF-1α til det niveau MOI-værdier i 48 timer. Fluorescens intensitet og lyse felt på samme område blev observeret ved den oprindelige forstørrelse som 100X. (B) mRNA (til venstre) og protein (højre) udtryk for HIF-1α blev påvist ved anvendelse af RT-PCR og western blot hhv. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (C) Cell morfologien af ​​vildtype HT29 eller HT29-celler transduceret med de angivne adenovira (Original forstørrelse = 400 X). (D) Western blot-analyse af HIF-1α, E-cadherin, plakoglobin, vimentin og N-cadherin i adenovirus-inficerede HT29 og HCT116-celler. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. (E) Fold ændring af invasion og migration i de angivne celler. Kvantificering af resultaterne blev vist i søjlediagrammet med middelværdier ± SD. *

P

0,05. (F) sårhelende assay. Cellemonolag ridset med en pipettespids og billeder blev taget 0, 24 og 48 timer efter sårdannelse. *

P

0.05.

Det er interessant, når observere adenovirus-inficerede celler, fandt vi HT29-Ad5-HIF-1a celler var meget mere spindel-formet, ligesom fibrobalsts sammenlignet med vildtype HT29-celler, der var rundt med godt celle-celle adhæsion (fig 1C). Ovenstående overgang cellemorfologi faktisk var de samme som ændringen i EMT-processen. Derfor næste opdaget vi udtrykkene for EMT markører og fandt, at E-cadherin og plakoglobin, to vigtige epitel markører af EMT, var signifikant nedreguleret i Ad5-HIF-1α-inficerede HT29 og HCT116 celler i forhold til deres kontrol celler. Tværtimod blev mesenkymale molekyler, vimentin og N-cadherin steg kraftigt efter Ad5-HIF-1α-EGFP-infektion (Fig 1D). Endvidere blev en stigning i invasion og migration (afgørende træk af EMT fænotype) af begge cellelinier med HIF-1α overekspression også påvist (Fig 1E). Konsekvent, sårhelingen assay viste, at bredden i HT29-Ad5-HIF-1a-celler var meget smallere end i HT29-Ad5-EGFP-celler ved de angivne tidspunkter plots, (fig 1F). Ovenstående resultater tyder på, at HIF-1α overekspression inducerer EMT og fremmer invasion og migration i CRC-cellelinjer.

HIF-1α overekspression fremmes metastase in vivo

For at vurdere effekten af ​​HIF-1α overekspression på cancermetastase

in vivo

, HT29-celler blev transduceret med Ad5-HIF-1α-EGFP eller Ad5-EGFP henholdsvis ved MOI på 100. Otteogfyrre timer senere blev enkeltcellesuspensioner høstet og injiceret i BALB /c nøgne mus via en subsplenic metode. Som vist i figur 2A, blev flere intrahepatiske tumorknuder let inspiceres groft i Ad5-HIF-1α-EGFP-injicerede gruppe, hvorimod der ikke blev fundet mindre eller slet ingen knuder i kontrolmus. For at bekræfte ovennævnte forskel, vi undersøgte H . E-farvning (B) af lever af BALB /c-mus fem uger efter subsplenic injektion af HT29-celler transduceret med Ad5-HIF-1a eller kontrollere virus. Hvide pile angivne metastatiske knuder. (C) Sammenligning af levermetastaser mellem HT29-Ad5-HIF-1α mus (N = 12) og kontrolmus (N = 8). *

P

0,05. (D) Bekræftelse af overekspression af HIF-1α fra metastatiske knuder i mus injiceret med Ad5-HIF-1α af qPCR, sammenlignet med dem, injiceret med kontrol virus.

HIF-1α reguleret ZEB1 udtryk

Både HIF-1α og ZEB1 har været impliceret i cancer metastaser og EMT [4, 9, 11]. Dernæst undersøgte vi, om HIF-1α overekspression haft en effekt på ekspressionen af ​​ZEB1. Faktisk opregulering af mRNA og protein niveauer af ZEB1 fandtes ledsaget med overekspression af HIF-1α i HT29-celler som vist i figur 3A 3B. Desuden tendenserne i HIF-1α og ZEB1 udtryk i CRC cellelinier (SW480, HCT116, HT29, LoVo og DLD1) var temmelig ens (figur 3C). Konsekvent, blev dette fund også præsenteret i parrede CRC prøver og tilstødende normale kolon epitel væv, som blev opdaget af western blot og IHC-farvning (Fig 3D 3E). Vi fandt også, at niveauerne af begge proteiner var meget højere i tumoren end den tilstødende normale væv. I celleniveau, blev begge HIF-1α og ZEB1 hovedsagelig udtrykkes i kernen og cytoplasmaet, især i kernen, som var teoretisk i overensstemmelse med placeringen for transkription faktor. Og også, observationerne af deres co-lokalisering afslører, at HIF-1α kan interagere med ZEB1 fysisk.

(A) Endogene ekspressionsniveauer af HIF-1α og ZEB1 i de angivne fem cellelinjer blev opdaget af qPCR med GAPDH anvendt som den interne kontrol. (B T: tumor. Niveauet af hvert protein blev normaliseret mod GAPDH. (E) Repræsentative billeder af IHC farvning om menneskelige CRC formalin-fikseret paraffinindlejrede prøver til HIF-1α og ZEB1. Venstre panel viste de tilstødende normale colorektale væv. Right panel viste CRC prøver. Original forstørrelse, 200X.

Regulering af ZEB1 ved HIF-1α gennem HRE-3

For at vurdere, om ZEB1 reguleres direkte ved HIF-1α, promotorsekvenserne af ZEB1 blev analyseret med bioinformatiske metoder. Vi fandt, at der var fire potentielle HRE sites i den proksimale promotor (~ 3500 nt opstrøms; startkodonet ATG defineret som 0), i ZEB1 genet (Fig 4A). Der var HRE-1 ved -517 ~ -521 nt; HRE-2 ved -525 ~ -529 nt; HRE-3 ved -630 ~ -634 nt og HRE-4 ved -1342 ~ -1347 nt. Baseret på disse, blev proberne P1, P2, P3 og P4 med vildtype og mutant HRE sites konstrueret henholdsvis som beskrevet i metoder og materialer. Resultaterne af EMSA-assay viste, at HIF-1α-binding var signifikant forøget efter inkubation af kerneekstrakter fra HT29-Ad5-HIF-1α celler med HRE-3-indeholdende oligonukleotid fra ZEB1 promotoren (fig 4B). Der var imidlertid kun meget uge bands eller endda intet bånd vist i HT29-Ad5-HIF-1a-celler eller andre kontrolceller med HRE-1, 2 eller 4-holdige oligonukleotid (data ikke vist). Desuden konkurrence for HIF-1α-binding med ikke-mærkede oligonukleotider indeholdende HRE-3 og prober indeholdende muterede HRE-3 viste ingen HIF-1a-bindende bånd (fig 4B). Disse resultater antydede, at HIF-1α kunne binde ZEB1 promotor via HRE-3 site.

(A) Skematisk gengivelse af den proksimale promotor (~ 3500 nt opstrøms) af ZEB1 genet. HRE: hypoxi responselement. (B) Oligonucleotider for EMSA var vildtype (bane 1-3) og mutant (bane 4-5) probe 3 fra ZEB1 promotoren, som indeholdt et konsensus HRE-3. Nukleare ekstrakter fremstillet fra HT29-Ad5-HIF-1α (bane 3 og 5) eller kontrolceller (bane 2 og 4) blev inkuberet med [γ-32P] ATP-mærket probe før elektroforese. Negativ kontrol blev udført med vildtype-probe uden kerneekstrakt (bane 1). (C) Skematisk afbildning af promotorregionen af ​​ZEB1 og rapporten anvendte konstruktioner i adenovirus-inficerede eksperimenter. Konstruktionerne indeholdt vildtype (pluc567-wt) eller mutant (pluc567-mut) HRE-3 beliggende -634 ~ -630 nt opstrøms for transkriptionsstartstedet af ZEB1. (D) Aktivering af plu567 eller pluc567-mut i Ad5-HIF-1α- eller Ad5-EGFP-inficerede HT29-celler (n = 3 replikate eksperimenter). *,

#

P

0.05.

Næste, vi bestemt effekten af ​​HIF-1α overekspression på transskription aktivitet ZEB1. Baseret på resultaterne af EMSA, en promotor plasmid indeholdende HRE1-3 (pluc567) og steddirigeret mutagenese af HRE-3 plasmid (pluc567-mut) blev dannet og transient transficeret ind i HT29-celler, som var præ-inkuberet med Ad5-HIF -1α eller Ad5-EGFP i 24 timer, viste Dual-luciferaseanalyse, at aktiviteten af ​​pluc567 i HT29-Ad5-HIF-1a celler steg mere end 5 gange sammenlignet med kontrol- celler, mens forstørrelsen var signifikant nedbrudt med pluc567-mut transfektion (fig 4C 4D). Disse resultater viste, at HIF-1α aktiveret ZEB1 direkte ved binding til HRE-3 site i ZEB1 proksimale promotor.

ZEB1 er kritisk for HIF-1α-induceret EMT og metastase

For at detektere hvorvidt ZEB1 er påkrævet for HIF-1α-induceret EMT og metastatisk fænotype, genereret vi et plasmid med HIF-1α udtrykker og ZEB1 knockdown, og derefter pakkes i adenovirus (Ad5-HIF-1α-shZEB1). Fordi det endogene niveau af ZEB1 i HT29-celler var meget lavere end i HCT116-celler (fig 3C, højre), hvilket var i overensstemmelse med deres proteinniveauer i vores tidligere data [12]. Derfor blev HCT116 celler udpeget til at udføre alle de ZEB1 knockdown eksperimenter.

In vitro

blev HCT116 celler transduceret med Ad5-HIF-1α-shZEB1 og Ad5-HIF-1α, henholdsvis . Western blot, invasion og migration blev udført efter 48 timer. Som vist i fig 5A, blev E-cadherin ekspression upregualted og vimentin ekspression blev nedreguleret ledsaget med knockdown af ZEB1. Konsekvent blev invasion og migration kapacitet faldt med 34% og 45%, hhv.

In vivo

observerede vi flere tumorknuder på overfladen af ​​lever og H 5E).

(A) Western blot-analyse af ZEB1, E-cadherin og vimentin i HCT116-Ad5-HIF-1α eller HCT116-HIF-1α-shZEB1 celler. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. Invasion (B) og migrering (C) blev udført i de samme to cellelinier. De repræsentative billeder af invaderede celler i inserterne af transwell kamre blev vist ved oprindelig forstørrelse = 200X. *

P

0,05. (D) Repræsentative fotografiske billeder og H 0.05.

Angivelse af HIF-1α, ZEB1, E-cadherin og vimentin i primære og metastatiske CRC prøver

For at vurdere forholdet mellem HIF-1α, ZEB1 og EMT centrale markører i kliniske væv, blev IHC farvning udført i 32 par af primære CRC prøver og metastatisk lymfeknude (fig 6A). Den gennemsnitlige procentdel af positivt farvede celler til alle tumorceller i hvert væv blev evalueret uafhængigt af to forskere, som beskrevet i materiale og metode. Vi fandt, at procentsatserne for både HIF-1α- og ZEB1-positive CRC celler var mere end 65%, mens andelen i metastatisk lymfeknude blev forøget omtrent til 86% for HIF-1α og 78% for ZEB1 (Fig 6B). Samtidig, niveauet af vimentin var også temmelig høj i både primære og metastatiske væv; selv om der var ingen signifikant forskel mellem disse to grupper. For E-cadherin, procentdelen af ​​E-cadherin-positive tumorceller i primær CRC væv var omkring 29%, mens faldet betydeligt til 12,7% i metastatisk gruppe (figur 6B). Disse resultater understøtter vores observationer med CRC cellelinjer, HIF-1α udtryk var positivt associeret med ZEB1 og vimentin, og negativt forbundet med E-cadherin, og HIF-1α og ZEB1 kan bidrage forskelligt til EMT og metastase.

Repræsentative billeder af IHC (A) og kvantificering af positive tumorceller (B) i både primære CRC prøver og den ifølge metastatisk lymfeknude. Original forstørrelse, 200X. *

P

0,05 og

#

P

0.05.

Diskussion

En af de grundlæggende måder til kræftbehandlingen er forståelsen af ​​molekylære mekanismer for tumorgenese og kræft metastaser. I denne undersøgelse viste vi, at ZEB1 er en nedstrøms mål for HIF-1α og har en kritisk rolle i EMT og metastatiske fænotyper induceret af overekspression af HIF-1α. Vi foreslår, at HIF-1α direkte binder til promotoren af ​​ZEB1 og tjener som dens kritiske positiv regulator og dermed fremme EMT og cancermetastase. Vores resultater afdække en roman mekanisme, hvorved HIF-1α regulerer tumor progression og invasion.

HIF-1α udtryk er almindeligt opreguleret i en masse af maligne tumorer, og mange publikationer har rapporteret den tætte sammenhæng mellem HIF-1α udtryk og øget aggressivitet og højere metastatisk kapacitet i æggestokkene, bryst, lunge, prostata, colon og bugspytkirtel karcinomer [11-14]. For molekylært niveau, HIF-1α udøver sin biologiske funktion gennem aktiverende target gener, såsom sneglen, Twist og TCF3, som alle er forbundet med EMT og metastase [15-18]. Det er imidlertid vigtigt at identitet mere ukendte mål og for at afsløre forbindelsen mellem HIF-1α aktivering og andre onkogen eller tumor suppressorer.

ZEB1, en pro-metastatisk transskriptionsfaktor, er involveret i cancer progression og metastase [ ,,,0],19, 20]. Mekanistisk, ektopisk ekspression af ZEB1 er tilstrækkelig til at nedregulere E-cadherin og at inducere EMT i brystcancer ved binding til de konserverede E-bokse i E-cadherin promotoren. Inhiberingen funktion ZEB1 på E-cadherin dermed fremme EMT er også observeret i xenograftmodeller af CRC [8]. Endvidere ZEB1 medierer claudin-1-regulerede ændringer i celleinvasion og anoikis i CRC [21]. Svarende til ZEB1, Sneglen og Twist er også vigtige EMT transkriptionsfaktorer ved lyddæmpende E-cadherin gennem binding til E-box element i E-cadherin promotor [22]. Snegl er identificeret som en HIF-1α målgen i mus [23]; Twist er direkte reguleret af HIF-1α i hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) [18, 24]. Med andre ord, de betyder også, at HIF-1α pathway kan regulere E-cadherin undertrykkelse, formentlig via snail eller Twist. Derfor, på grund af de tilsvarende evner HIF-1α og ZEB1 at inducere EMT og overlappende fænotyper af HIF-1α og ZEB1 i null mus, er det sandsynligt, at disse to gener er placeret i samme pathway at regulere cancermetastase. Derfor vi hypotese, at der kan være en stærk interaktiv forbindelse mellem ZEB1 og HIF-1α. Vi fandt faktisk, at HIF-1α var i stand til at binde ZEB1 promotor gennem HRE-3 og positivt reguleret ZEB1 transactivity. Disse resultater antyder også, at sneglen, Twist og ZEB1, kan de tre store EMT regulatorer regulerer EMT og metastase med nogle meget lignende mekanismer. Interessant, Peinado et al rapporterede, at Snail, Slug, ZEB1 og ZEB2 rekruttere specifikke kromatin-remodeling komplekser understøtter en dynamisk sammenhæng mellem transskription undertrykkelse og epigenetiske gener lyddæmpningssystemer af E-cadherin under tumor progression og EMT [25].