PLoS ONE: Aktiveret K-ras og INK4a /Arf Mangel Samarbejde Under udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen ved Aktivering af Notch og NF-KB signalveje

Abstrakt

Baggrund

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, tyder på, at nye strategier for forebyggelse og behandling af PDAC er presserende behov. K-ras-mutationer observeres i 90% af kræft i bugspytkirtlen, hvilket tyder på sin rolle i initiering og tidlige udviklingsstadier af PDAC. For at opnå mekanistisk indsigt i rollen som muterede K-ras har flere musemodeller er udviklet ved at målrette en betinget muteret K-ras

G12D for den gentog PDAC. En betydelig co-brugelighed er blevet vist i tumorudvikling og metastase i en forbindelse musemodel med aktiverede K-ras og INK4a /Arf mangel. Men den molekylære mekanisme (r), hvorved K-ras og INK4a /ARF-mangel bidrager til PDAC er ikke fuldt belyst.

Metode /vigtigste resultater

For at vurdere den molekylære mekanisme (r ), som er involveret i udviklingen af ​​PDAC i forbindelsen transgene mus med aktiverede K-ras og INK4a /Arf mangel, vi bruges flere metoder, såsom Real-time RT-PCR, western blotting assay, immunhistokemi, MTT-assay, invasion, EMSA og ELISA. Vi fandt, at udeladelsen af ​​INK4a /Arf i K-ras

G12D udtrykke mus fører til PDAC, som er delvist medieret gennem aktivering af hak og NF-KB signalveje. Desuden fandt vi nedregulering af miR-200-familien, som også kunne spille en vigtig rolle i tumor udvikling og progression af PDAC i de sammensatte transgene mus.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater tyder at aktiveringen af ​​hak og NF-KB sammen med tabet af miR-200 familie mekanistisk er forbundet med udvikling og progression af PDAC i sammensatte K-ras

G12D og INK4a /ARF mangelfulde transgene mus.

Henvisning: Wang Z, Banerjee S, Ahmad A, Li Y, Azmi AS, Gunn JR, et al. (2011) Aktiveret K-ras og INK4a /Arf Mangel Samarbejde Under udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen ved Aktivering af Notch og NF-KB signalveje. PLoS ONE 6 (6): e20537. doi: 10,1371 /journal.pone.0020537

Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: April 12, 2011; Accepteret: Maj 2, 2011; Udgivet: 3 juni 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute, National Institutes of Health giver 5R01CA131151, 5R01CA131151-S02, og 5R01CA132794 (FH Sarkar) og CA-075.059 til M. Korc. Forfatterne takker Puschelberg og Guido grundlaget for deres generøse finansielle bidrag. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er en yderst aggressiv ondartet sygdom, der er rangeret som den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald med en median overlevelse på 6 måneder, og med en anslået 43,140 nydiagnosticerede tilfælde og en cirka 36.800 dødsfald i USA i 2010 [1]. Det er blevet accepteret, at udviklingen af ​​PDAC sker gennem udviklingen af ​​prækursor læsioner såsom pancreas intraepitelialneoplasi (Panin), der spænder fra lav kvalitet PanINs (Panin-1A, Panin-1B) til high-grade PanINs (Panin-2, Panin-3) [2], [3]. PDAC har vist sig at have flertrins molekylære progression herunder høj frekvens til at aktivere K-ras-mutationer og efterfølgende inaktivering af p16

INK4a, p53, Smad4, p14ARF tumorsuppressorer og andre yderligere genetiske abnormaliteter i musemodeller [4] – [ ,,,0],6] og i human [7]. Den mest almindelige K-ras-mutation i human PDAC er på kodon 12 (Kras

G12D), som er relateret til aktiveringen af ​​GTPase-aktivitet. Derfor har adskillige musemodeller for PDAC blevet genereret ved at målrette en konditionelt muterede K-ras

G12D at rekapitulere progressionen af ​​PDAC [8] – [12]. Én sammensatte musemodel indeholder aktiverede K-ras og INK4a /ARF mangel viste at samarbejde om at producere metastatisk PDAC [13], [14]. Men den molekylære mekanisme (r), hvorved aktiveret, K-ras og INK4a /Arf mangel bidrager til PDAC aggressivitet er ikke blevet fuldstændigt belyst.

I de seneste år, mange signalveje, herunder Notch pathway er blevet undersøgt og fundet at spille vigtige roller i PDAC [15]. Notch signalering har kritiske funktioner på kontrol af cellevækst, differentiering, apoptose, migration, invasion, og metastase i PDAC [16]. Notch koder for proteiner, som kan aktiveres ved at interagere med en familie af dets ligander. Til dato har fire Notch receptorer (Notch1-4) og fem ligander (DLL-1, Dll-3, Dll-4, Jagged-1, Jagged-2) blevet identificeret [17]. Interessant er det blevet rapporteret, at funktionen af ​​Notch signalering i tumorigenese kan enten være onkogen eller oncosuppressive, og funktionen er også sammenhæng afhænger i PDAC [18], [19]. Notch signalering er ofte dereguleret med opreguleret ekspression af Notch-receptorer og deres ligander i PDAC [20]. Vi har vist, at nedregulering af Notch-1 via bestemte siRNA var korreleret med nedsat proliferative, øget apoptose, reduceret migration og nedsat invasive egenskaber af bugspytkirtelkræftceller [21], [22]. For nylig har det vist sig, at aktiv Notch signalering kan virke synergistisk med K-ras i Panin initiering og progression til invasiv adenokarcinom [8], [23]. Inhibering af Notch-signalvejen resulterede i inhibering af tumorprogression i en musemodel (K-ras, p53 L /+ mus) af PDAC [24]. For nylig Mazur et al. fandt, at mangel på Notch-2 stopper Panin progression, forlænge overlevelse gennem hæmning af Myc signalering i K-ras-drevet pancreas carcinogenese [25]. Overraskende Notch-1 blev for nylig fundet en tumor suppressor i en model af K-ras-induceret PDAC [18], hvilket tyder på, at yderligere undersøgelser er nødvendige for at fastlægge den rolle, Notch signalering i PDAC.

Notch vej er blevet rapporteret at krydstale med NF-KB, en af ​​de største transkriptionsfaktoren associeret med cellevækst og apoptotiske regulatoriske veje i bugspytkirtelkræft. Undersøgelser fra vores gruppe viste, at Notch signalering kunne fremkalde NF-KB-aktivitet i bugspytkirtelkræft [21]. For nylig blev det vist, at NF-KB-vejen er nødvendig for udviklingen af ​​tumorer i en musemodel (K-ras, p53 L /L-mus) af lunge adenocarcinom [26]. Det blev desuden konstateret, at genetisk deletion af NF-KB-underenhed p65 i en K-ras-induceret lungekræft musemodel reducerede lunge tumorigenese i nærvær og i fravær af tumor suppressor p53 [27]. Det er dog i høj grad usikkert, om NF-KB er nødvendig for K-ras-induceret PDAC progression.

I den foreliggende undersøgelse vurderede vi de molekylære ændringer i musetumorer udviklet i forbindelsen transgene mus med aktiveret K- ras og INK4a /Arf mangel. Her viser vi, for første gang, at deletion af INK4a /Arf i K-ras udtrykkende mus fører til PDAC, som er delvist medieret gennem aktivering af hak og NF-KB signalveje. Endvidere fandt vi ændringer i ekspressionen af ​​MIR-200-familien, som også kan spille en vigtig rolle i tumorudvikling og progression af PDAC i forbindelsen transgene mus med aktiverede K-ras og INK4a /Arf mangel.

Resultater

Notch signalvejen er stærkt udtrykt i Pdx1-Cre, LSL-K-ras

G12D; INK4a /ARF mus

for at afgrænse den mekanistiske rolle muterede K-ras i udviklingen og progression af PDAC, vurderede vi ekspressionen af ​​Notch pathway i den murine model. I denne model er oncogene K-ras (Kras

G12D) bankede ind i sin egen locus og transskriptionelt tavshed på grund af indsættelse af et LoxP-Stop-LoxP element (LSL). Når LSL- Kras

G12D mus avlet med transgene mus, som udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af Pdx1-promotoren, ekspressionen af ​​Cre-rekombinase i pancreasstamfaderceller muliggør fjernelsen af ​​Floxed transkriptionelle STOP kassette, der fører til aktivering af onkogene K-ras allel. I denne model, var der ingen tumorer let fundet op til 30 ugers alderen i LSL- K-ras

G12D; Pdx1-Cre (vi kaldte KC i dette manuskript) mus, er i overensstemmelse med tidligere undersøgelse [13]. Vi fandt også noget bevis for PDAC i INK4a /Arf; Pdx1-Cre (vi kaldte IC i dette manuskript) dyr til en alder af 24 uger, svarende til observation dokumenteret af andre grupper [13]. Men alle 25 mus fra LSL- K-ras

G12D; Pdx1-Cre; INK4a /Arf (vi kaldte KCI for dette håndskrift) gruppe viste sig at have pancreastumorer varierer i diameter mellem 4 og 10 mm mellem 45 og 80 dage (fig. 1A). Forbindelsen KCI mus med tumorer blev døende (fig. 1A, overlevelse kurve). Tumorerne blev bekræftet ved histopatologisk undersøgelse (fig. 1B). Ki-67, en kendt proliferationsmarkør, var stærkt udtrykt i KCI pancreas tumorer (fig. 1B). Det er blevet rapporteret, at Notch signalvej har kritiske roller i udviklingen og progressionen af ​​pancreascancer. Derfor vurderede vi ekspressionen af ​​Notch-gener i disse transgene mus væv. Det er vigtigt at bemærke, at vi fokuserede vores undersøgelser af spaltede Notch, fordi det er den aktive funktionel form af Notch. Derfor Notch i vores alle tal legender betyder aktiv kløvet Notch. Vi fandt, at Notch signalering blev aktiveret i tumorer i KCI-mus sammenlignet med pancreas af KC og IC mus (fig. 1C, D). Ekspressionen af ​​Notch-2 og Notch-4 var opreguleret både på mRNA og protein niveauer i KCI-mus. Imidlertid Notch-1-ekspression viste ingen ændring og Notch-3-ekspression blev øget kun på mRNA-niveauet i tumorerne KCI mus, hvilket antyder, at roller Notch-2, og Notch-4 kunne være vigtigere i progression af pancreascancer. Vi fandt også, at alle fem Notch-ligander var opreguleret i tumorerne afledt fra KCI-mus (fig. 2A, B). For at bekræfte disse resultater, vurderet vi udtryk for Notch nedstrøms gener såsom Hes-1 og Hey-1. Vi fandt, at ekspressionen af ​​Hes-1 og Hey-1 blev forøget i tumorerne af KCI-mus (fig. 2A, B), som blev forventet baseret på opreguleret ekspression af Notch-2, Notch-4 og deres ligander.

A, Top venstre panel: Tumor forekomst i KCI mus (N 25). Kontrolmus: KC og IC-mus. Top højre panel: Gennemsnitlig længde af tumorer i KCI mus (N 20). Bundplade: Kaplan-Meier pancreas tumor overlevelse kurve for KCI mus og kontroldyr. Kontrol mus: kombinationer af KC og IC mus. B, Topplade: Mikroskopisk undersøgelse af tumorer afledt fra KCI mus sammensat af celler, der danner kanaler på steder (røde pile). Fokalt tumorceller er i ark. Celler er store, meget atypisk, med store, pleomorfe kerner og fremtrædende 2-3 nucleoli (gule pile) pr celle. Cytoplasma er eosinofil med blege eosinofile inklusioner (grønne pile) i få celler giver en rhabdoid træk til cellerne. Omgivende stroma viser spindled celler med aflange kerner (sorte pile) og spredte inflammatorisk infiltrat bestående af neutrofiler, lymfocytter og få plasmaceller. Bundplade: Ki-67 blev stærkt udtrykt i tumorer opnået fra KCI mus som vurderet ved immunhistokemi. C, Notch signalvej var opreguleret på mRNA-niveauet som bestemt ved Real-time RT-PCR i tumorer afledt fra KCI mus. D, Notch pathway blev stærkt udtrykt i tumorer afledt af KCI mus som vurderet ved western blotting analyse og immunhistokemi, henholdsvis.

A, var et udtryk for Notch ligander og Notch nedstrøms gener steget mRNA niveau som bedømt ved Real-time RT-PCR i tumorer afledt fra KCI mus. B, Ekspressionen af ​​Notch-ligander og Notch nedstrøms gener blev højt udtrykt i tumorer afledt fra KCI-mus som bedømt ved western blotting-analyse. C, NF-KB p65-aktivitet blev forøget i tumorer afledt fra KCI mus ved ELISA. D, Venstre panel, er NF-KB-p65-DNA-bindende aktivitet steget i tumorer afledt af KCI mus som vurderet af EMSA. Right panel, phospho-p65 blev stærkt udtrykt i tumorer opnået fra KCI mus som vurderet ved immunhistokemi.

NF-KB-DNA bindende aktivitet blev aktiveret i KCI mus væv

NF KB er blevet rapporteret til cross-talk med Notch vej [28]. Vi har rapporteret tidligere, at Notch-1 kan opregulere NF-KB-DNA-bindingsaktivitet i pancreascancer [22]. Derfor undersøgte vi, om den nedstrøms virkning Notch opregulering kunne mekanistisk associeret med aktiveringen af ​​NF-KB-vejen i tumorer i disse dyr. Det er velkendt, at NF-KB familien er sammensat af homo- og heterodimerer af Rel-proteiner; NF-κB1 (p50); NF-KB (p52), RelA (p65), RelB, og c-Rel (Rel). NF-KB (p50 /p65) er en allestedsnærværende, konstitutiv og inducerbar heterodimer. Generelt er DNA-bindingsaktivitet af NF-KB traditionelt refererer til p50 /p65 (p50 /RelA) heterodimer-medieret binding til DNA’et, og det er et kendt regulator af celleoverlevelse og anti-apoptose signalering. I kernen, den p65 NF-KB-underenheden er en stærk aktivator af en lang række forskellige gener; Derfor vurderede vi den nukleare ekspression af p65-protein ved immunohistokemi. Kerneproteiner fra tumorerne opnået fra de transgene mus blev også udsat for NF-KB p65 ELISA, og NF-KB p65 DNA-bindingsaktivitet som målt ved EMSA. Resultaterne viste, at NF-KB p65-aktivitet som vurderet ved ELISA, og NF-KB p65 DNA bindingsaktivitet blev aktiveret i tumorer afledt fra forbindelsen KCI mus (fig. 2C, D). Disse resultater viste en øget nukleare akkumulering af p65 i tumorerne KCI mus, hvilket antyder, at både aktivering af K-ras og INK4a /Arf mangel er nødvendige for forbedret NF-KB-aktivering. Desuden immunfarvning viste også, at phospho-p65 blev højt udtrykt i den nukleare rum i tumorvæv KCI mus (fig. 2D).

NF-KB nedstrøms gener aktiveres i KCI mus

det er blevet rapporteret, at Notch pathway stimulerer NF-KB-aktivitet i cervicale cancerceller ved at associere med IKK signalosom gennem IKKα [29]. Tidligere undersøgelse har vist, at Notch vej regulerer IKKα udtryk i bugspytkirtelkræft [30]. Således undersøgte vi ekspressionen af ​​IKK-protein i tumorerne KCI mus. Vi fandt, at alle IKK familiemedlemmer såsom IKKα, IKKβ og IKKγ blev aktiveret i tumorer i KCI-mus (fig. 3A). For yderligere at udforske virkningerne af NF-KB-aktivering, undersøgte vi ekspressionsniveauerne af visse NF-KB målgener herunder COX-2, cyclin D1, MMP-9, MMP-2, Bcl-2, c-myc, og survivin ved real-time RT-PCR og western blotting, henholdsvis, ved hjælp af tumorvæv opnået fra forbindelsen KCI transgene dyr. Real-time RT-PCR og Western blot-analyse viste, at ekspressionen af ​​disse gener blev aktiveret i tumorer i KCI-mus (fig. 3A, B). Vi fandt også, at ekspressionen af ​​Stat3 blev aktiveret i tumorerne danner KCI-mus (data ikke vist). Det er velkendt, at disse gener spiller en kritisk rolle i cellevækst, invasion og metastase. Derfor er disse resultater støtter yderligere rollen af ​​NF-KB i tumorvækst og progression i de sammensatte KCI mus.

A, Western blot-analyse, der viser opreguleret ekspression af IKK, p65, og NF-KB nedstrøms gener i tumorer afledt fra KCI-mus. B, Real-time RT-PCR viser forøget ekspression af NF-KB nedstrøms gener, såsom survivin, cyclin D1, Bcl-2, C-myc, MMP-2, og MMP-9 i tumorerne afledt fra KCI mus. C, Ekspressionen af ​​MIR-200 familie blev nedreguleret i tumorer i KCI-mus som bedømt ved real-time RT-PCR. D, Real-time RT-PCR viste reduceret ekspression af E-cadherin, og forøget ekspression af vimentin, og en beskeden stigning i ekspressionen af ​​ZEB1 henviser en 30 gange forøget ekspression af ZEB2 i tumorer afledt fra KCI mus.

Den miRNA-200 familie blev nedreguleret i KCI mus

mIR-200 familien har vist sig at regulere Notch signalvej [31]. MIR-200 familie har fem medlemmer: miR-200a, miR-200 mia, miR-200C, miR-141 og miR-429. Vi fandt, at Notch-1 kunne være en af ​​de målgener af MIR-200 familie (MIR-200 mia, MIR-200C), fordi overekspression af disse miRNA signifikant inhiberede Notch-1-ekspression i prostatacancer [31] og pancreascancer ( upublicerede data). For at løse, om MIR-200 familien er involveret i tumorerne af KCI-mus, som udviste høj ekspression af Notch (Notch-2 og 4) signalvejen, vi undersøgte ekspressionen af ​​MIR-200-familien. Som forventet ekspressionen af ​​MIR-200a, MIR-200b og MIR-200C blev signifikant reduceret i tumorerne KCI mus (fig. 3C). Disse resultater antyder, at tumorerne er udviklet i de sammensatte mus kunne vise aggressiv adfærd såsom erhvervelse af epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) fænotype, og således har vi yderligere undersøgt den molekylære sammensætning af tumorerne afledt af forbindelsen KCI transgene mus som beskrevet nedenfor.

Bevis for EMT fænotype i tumorer afledt fra forbindelsen KCI transgene mus

for nylig mange undersøgelser har vist, at miR-200 familien regulerer EMT ved at målrette zink-finger E -boks bindende homeobox 1 (ZEB1) og ZEB2. EMT er en proces, hvorved epitelceller undergår bemærkelsesværdige morfologiske ændringer karakteriseret ved en overgang fra epithelial brosten fænotype til aflange fibroblastisk fænotype. Vores tidligere undersøgelser har vist, at MIR-200a, MIR-200b, og MIR-200C blev nedreguleret i gemcitabin resistente bugspytkirtelkræftceller, i overensstemmelse med den observerede EMT fænotypen [32], [33]. Vi har desuden vist, at MIR-200 familien regulerer ekspressionen af ​​ZEB1, slug, E-cadherin, og vimentin, og således foreslået genekspressionen af ​​MIR-200 kunne være nyttige til reversering af EMT fænotype til mesenchymale-til- epitelial overgang (MET), som er blevet delvist dokumenteret i vores seneste publikation [34]. Da vi fandt lav ekspression af MIR-200 familien i tumorerne KCI mus vurderede vi EMT markører for at undersøge, om tumorer i KCI mus undergik EMT eller ej. Vi fandt tab af E-cadherin ekspression og forhøjet ekspression af vimentin og ZEB2 i tumorerne KCI mus selvom ekspressionen af ​​ZEB1 udviste beskeden stigning (fig. 3D), hvilket antyder, at ekspressionen af ​​disse faktorer kan være vigtigt at inducere EMT fænotype i de tumorer i KCI mus, hvilket forekommer at være i overensstemmelse med aggressiv adfærd af tumorerne udviklet i sammensatte KCI transgene mus.

Hæmning af Notch vej forårsagede nedsat kræft cellevækst i en mus PDAC cellelinie

for yderligere at vurdere den potentielle rolle Notch vej i bugspytkirtelkræft, brugte vi Rink-1 cellelinie, som var afledt fra KCI pancreas væv og studeret virkningerne af hæmmere af Notch vej. Tidligere undersøgelser har vist, at Rink-1-celler udviste hurtig vækst

in vitro

og dannede tumorer i nøgne mus [14]. Da Notch signalering er aktiveret

via

aktiviteten af ​​γ-sekretase, har flere former for γ sekretase inhibitorer, herunder DAPT og L-685,458 blevet anvendt til at inaktivere Notch pathway. Derfor bestemte vi cellen levedygtighed Rink-1 celler behandlet med GSI af MTT-analysen, og dataene er vist i figur 4A. Behandlingen af ​​Rink-1-celler i 72 timer med DAPT og L-685,458 resulterede i cellevækstinhibering. For at bestemme hvilken Notch receptor kunne være et effektivt terapeutisk mål for kræft i bugspytkirtlen, blev effekten af ​​Notch 1-4 siRNA på cellevækst af de bugspytkirtelkræftceller undersøgt. Effekten af ​​GSI og Notch siRNA til knockdown af Notch protein blev bekræftet gennem western blotting. Vi observerede, Notch proteinniveau var knap påviselig i GSI behandles eller Notch siRNA transficerede celler (fig. 4B). Meget interessant, kun inaktivering af enkelt Notch-receptor ikke signifikant inhiberer cellevækst (fig. 4A). Disse resultater antyder, at inaktivering af flere Notch receptorer ved GSI er god måde at behandle PDAC. For at bekræfte denne konklusion, testede vi udtryk for Notch målgener i Rink-1 celler behandlet med GSI eller Notch siRNA. Fordi kun Notch-2 og Notch-4 siRNA lidt inhiberede cellevækst, detekteres vi ekspressionen af ​​Notch målgener i Rink-1 celler behandlet med disse to siRNAs. Som vi forventede, fandt vi, at GSI inhiberede ekspressionen af ​​Notch målgener herunder Hes-1, Survivin, Bcl-2, c-myc, uPA til mere grad, sammenlignet med Notch-2 siRNA eller Notch-4 siRNA transfektion (fig. 4C). Derfor brugte vi GSI i de følgende eksperimenter. Dernæst testede vi effekten af ​​behandling på celle levedygtighed ved klonogene assay. GSI behandling resulterede i en signifikant inhibering af kolonidannelse af Rink-1-celler sammenlignet med kontrollen (fig. 5A). Samlet viser resultaterne fra klongenicitetsassayet stemte overens med MTT data tyder på, at inaktivering af Notch pathway kunne hæmme cellevækst af Rink-1-celler.

A, Venstre panel, Inhibering af Rink-1 cellevækst ved Notch 1-4 siRNA testet af MTT-assayet. Resultaterne blev plottet som middelværdi ± SD af tre separate forsøg med seks bestemmelser pr eksperiment for hver eksperimentel betingelse. Midterste og højre panel: L-685,458 og DAPT var y-sekretase-inhibitorer (GSI), som forhindrer spaltningen af ​​Notch-receptoren, blokerer Notch signaltransduktion. GSI inhiberede Rink-1 cellevækst signifikant. Celler blev podet i 96-brønds plader med 5.000 celler per brønd og behandles med GSI i 72 timer. Efter behandling blev celledensiteter bestemmes ved MTT-assayet. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SD (n = 6) af tre uafhængige forsøg. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. B, Ekspressionen af ​​Notch pathway blev nedreguleret i Rink-1 celler behandlet med GSI eller transficeret med Notch 1-4 siRNA som vurderet ved Western blotting-analyse. C, Ekspressionen af ​​Notch målgener blev nedreguleret i Rink-1 celler behandlet med GSI eller transficeret med Notch-2 siRNA eller Notch-4 siRNA som vurderet ved som vurderet ved real-time RT-PCR.

A, Top, Venstre panel: Cell overlevelse Rink-1 celler behandlet med GSI. Celler behandlet med GSI i 72 timer blev evalueret ved den klonogene assay. Fotomikrografi forskel i kolonidannelse i celler ubehandlede og behandlede med GSI. Højre panel: Der var en signifikant reduktion i kolonidannelse i Rink-1 celler behandlet med GSI sammenlignet med kontrolceller.

P

værdier repræsenterer sammenligninger mellem celler behandlet med GSI og kontrol ved hjælp af parrede

t

test. Bund, Venstre panel: Karakterisering af apoptose blev udført efter propidiumiodid (PI) og Annexin V-FITC farvning med apoptose afsløring kit efterfulgt af flowcytometrisk analyse efter 48 h GSI behandling af Rink-1 celler. Procentdelen af ​​apoptotiske celler steg fra 10% i kontrollen til 28-33% i GSI behandlede celler. Højre panel: GSI induceret apoptose i Rink-1 celler. Rink-1-celler blev udsat for GSI i 72 timer. Apoptose blev målt ved Histon DNA ELISA. Værdier rapporteres som middelværdi ± SD. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. B, Top, Venstre panel, Invasion assay under anvendelse GSI behandlede celler, der viser lav penetration af celler gennem Matrigel-coatede membran sammenlignet med kontrol celler. Højre panel: Graferne viser værdien af ​​fluorescens fra invaderet Rink-1 celler. Værdierne angiver den sammenlignende mængde invaderet Rink-1-celler. Bunden, blev Sårheling assay udført for at vurdere kapaciteten i cellemigrering. GSI behandling nedsatte cellemigrering i Rink-1-celler. C, GSI inhiberede NF-KB-DNA-bindingsaktivitet i Rink-1-celler som bedømt ved EMSA. D, Real-time RT-PCR og Western blot analyse viste, at L-685,458 hæmmede udtryk for Survivin, c-myc, Bcl-2, og uPA generne.

Hæmning af Notch vej forårsagede apoptotiske celledød i Rink-1-cellelinien

Dernæst undersøgte vi, om de samlede væksthæmmende effekter af GSI er delvis på grund af induktion af apoptose, der blev undersøgt ved anvendelse af en ELISA-baseret assay. Disse resultater forudsat overbevisende data, som GSI induceret apoptose i Rink-1-cellelinien (Fig. 5A). For at bekræfte disse resultater, vi brugte også annexin V-FITC metode til påvisning af apoptose induceret af GSI for hvilke Rink-1-celler blev behandlet med GSI i 48 timer. Ved farvning af celler med annexin V-FITC og PI, blev FACS-analyse anvendes til at skelne og kvantitativt bestemme procentdelen af ​​døde, levedygtige og apoptotiske celler efter behandling. Vi fandt, at procentdelen af ​​apoptotiske celler steg fra 10% i kontrollen til 28-33% i Rink-1-celler efter GSI behandling (fig. 5A). Disse resultater er overbevisende data, der viser, at inaktivering af Notch pathway kunne inducere apoptose i Rink-1 bugspytkirtelkræftceller.

Inhibering af Notch pathway faldt kræft cellemigration og invasion

Notch pathway menes at være kritisk involveret i den igangværende tumorcelleinvasion og metastase. Tidligere undersøgelser har vist, at pancreas tumorer opstået i forbindelsen KCI mus har omfattende invasion af tilstødende organer, herunder duodenum, mave, lever og milt [13]. For bedre at forstå, om Notch pathway har en kritisk rolle ved invasionen, testede vi virkningerne af inaktivering af Notch pathway på cancercelleinvasion. Vi fandt, at GSI behandlede celler viste et lavere indtrængen gennem Matrigelcoatede membran sammenlignet med kontrolcellerne. Værdien af ​​fluorescens fra den invaderede Rink-1 cancerceller faldt omkring 5-7 gange sammenlignet med den for kontrolceller (fig. 5B). For yderligere at undersøge effekten af ​​GSI på celle migration og invasion, der gennemføres i vi sårheling assay i Rink-1 celler. Resultaterne viser, at GSI behandling inhiberede kapacitet sårheling i Rink-1-celler (fig. 5B), hvilket antyder, at GSI kan inhibere cellemigrering og invasion. Disse resultater antyder en direkte rolle Notch signalering i Rink-1 cancercelle migration og invasion, og disse resultater stemmer overens med aggressivitet af tumorer udviklet i forbindelsen KCI transgene dyr.

Inhibering af Notch pathway faldt NF-KB DNA-bindingsaktivitet

Vi undersøgte, om den nedstrøms virkning af Notch-1 nedregulering blev mekanisk forbundet med NF-KB-vejen. Kerneproteiner fra GSI behandlede celler blev underkastet analyse for NF-KB p65 DNA-bindingsaktivitet som målt ved EMSA. Resultaterne viste, at GSI signifikant inhiberede NF-KB p65 DNA-bindingsaktivitet sammenlignet med kontrol (fig. 5C). Disse resultater fremlagt dokumentation til støtte for en mekanistisk krydstale mellem Notch og NF-KB i bugspytkirtelkræft. Endvidere har vi også fundet, at GSI inhiberede NF-KB nedstrøms genekspression, såsom Survivin, Bcl-2, c-myc, og uPA (fig. 5D).

Over-ekspression af MIR-200b hæmmede cellevækst gennem Jagged ligander

For nylig er det blevet rapporteret, at mIR-200 familiemedlemmer målrette Notch pathway komponenter, såsom Jagged-1 [35], [36]. For at undersøge, om miR-200 familien regulere Notch vej, vi transficeret miR-200b forløber i Rink-1 celler. Vi bekræftede, at transfektion af MIR-200b precursor øgede det relative niveau af MIR-200b i Rink-1-celler (fig. 6A). Over-ekspression af MIR-200b faldt de relative mRNA-niveauer af Jagged-1, Jagged-2 og deres målgener ved real time RT-PCR assay (Fig. 6A). Dataene fra Western blot-analyse viste, at overekspression af MIR-200b faldt de relative proteinniveauer af Jagged-1 og dets målgen såsom Hes-1, Hey-1, og Bcl-2 (fig. 6B). Endvidere fandt vi, at overekspression af MIR-200b inhiberede cellevækst i Rink-1-celler (fig. 6B). Dernæst vi opdaget, om hæmning af Jagged-1 kunne hæmme cellevækst. Jagged-1 siRNA faldt betydeligt ekspressionen af ​​Jagged-1 og dets mål Hes-1 og Hey-1 ved mRNA og protein niveauer (fig. 6C). Endvidere fandt vi, at inhibering af Jagged-1 ved Jagged-1 siRNA inhiberede Rink-1 cellevækst (fig. 6C), hvilket antyder, at Jagged-1 kunne være et potentielt mål for kræft i bugspytkirtlen.

A, Venstre panel, blev Re-ekspressionen af ​​miR-200b etableret i Rink-1 celler ved transfektion med dens forløber. Midterste panel, Re-ekspressionen af ​​miR-200b ikke regulere ekspressionen af ​​Notch-receptorer i Rink-1 celler. Right panel, Re-ekspressionen af ​​miR-200b reguleret ekspression af Jagged-1 og Jagged-2 mRNA i Rink-1 celler. B, Venstre og midterste panel, Re-ekspressionen af ​​miR-200b hæmmede ekspressionen af ​​Jagged-1 målgener på mRNA og protein niveauer i Rink-1 celler. Right panel, Re-ekspressionen af ​​miR-200b hæmmede Rink-1 cellevækst test af MTT-analysen. C, Venstre og midterste panel, Jagged-1 siRNA hæmmede ekspressionen af ​​Jagged-1 target gen HES-1 og Hey-1 ved mRNA og protein niveauer i Rink-1 celler. Right panel, Jagged-1 siRNA hæmmede Rink-1 cellevækst test af MTT-analysen.

Diskussion

PDAC er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA [ ,,,0],1]. Selv om nogle fremskridt i kemoterapi, strålebehandling, og kirurgisk teknik, den samlede overlevelse sats for fem år er mindre 4% af alle patienter diagnosticeret med PDAC [1]. Disse skuffende resultater tyder på, at nye og alternative tilgange til forståelsen af ​​mekanismerne i PDAC progression er kritisk behov. Transgene mus er gode modeller til at identificere det patogene rolle af specifikke genmutationer og centrale signalveje forbundet med kræft i bugspytkirtlen.

Det er kendt, at K-ras-mutationer observeres i 80% -90% af pancreascancer. Onkogent K-ras er involveret i initiering eller tidlige stadier i udviklingen af ​​PDAC. Derfor er de betingede KC mus anses for gode værktøjer til mekanistiske studier af kræft i bugspytkirtlen progression. Da KC mus efterligne langsom progression fra Panin til invasiv cancer i omkring 12-15 måneder [6], [37], men KC mus opdrættet med mange andre transgene mus viste en hurtig udvikling af PDAC. For eksempel Smad4 /Dpc4 haploinsufficiency forkortet levetid KC mus til median overlevelse på ca. 8 måneder [10]. LSL- K-ras

G12D; Pdx1-Cre; Trp53R mus har en dramatisk forkortet median overlevelse på ca. 5 måneder [6]. Den mediane overlevelsestid på KC mus med LKB1 heterozygoti var 4,5 måneder [11]. PTEN haploinsufficiency væsentligt forkortet levetid KC mus til en median overlevelse på omkring 3,5 måneder [9].