PLoS ONE: In Vitro Drug Følsomhed Tests at forudsige Molecular Target Drug Responses i Kirurgisk resektion lungekræft

Abstrakt

Baggrund

epidermal vækstfaktor receptor-tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI’er) og anaplastisk lymfom kinase (ALK) hæmmere har dramatisk ændret strategien for medicinsk behandling af lungekræft. Patienter bør screenes for tilstedeværelsen af ​​EGFR mutation eller pighuder mikrotubuli-associeret protein-lignende 4

(EML4

) –

ALK

fusion gen forud for kemoterapi til at forudsige deres kliniske respons. Den succinatdehydrogenase hæmning (SDI) test og kollagen gel dråber indlejret kultur narkotika følsomhed test (CD-DST) er etableret

in vitro

narkotika følsomhed tests, som kan forudsige følsomhed af patienter for cytotoksisk anticancer narkotika. Vi anvendte

in vitro

stof følsomhed test for Cyclopedic forudsigelse af kliniske reaktioner på forskellige molekylære målretning narkotika.

Metoder

væksthæmmende virkning af erlotinib og crizotinib blev bekræftet for lunge cancer cellelinjer bruger SDI og CD-DST. Følsomheden af ​​35 tilfælde af kirurgisk resektion lungekræft til erlotinib blev undersøgt ved hjælp af SDI eller cd-DST, og sammenlignet med EGFR mutation status

Resultater

HCC827 (Exon19: E746-A750 del). og H3122 (

EML4-ALK

) celler blev hæmmet af lavere koncentrationer af erlotinib og crizotinib, henholdsvis end A549, H460, og H1975 (L858R + T790M) celler var. Den levedygtighed kirurgisk resektion lungekræft var 60,0 ± 9,8 og 86,8 ± 13,9% i EGFR-mutanter vs. vilde typer i SDI (p = 0,0003). Cellen levedygtighed var 33,5 ± 21,2 og 79,0 ± 18,6% i EGFR mutanter vs. vildtype sager (p = 0,026) i cd-DST.

Konklusioner

In vitro

lægemiddelfølsomhed evalueret af enten SDI eller cd-DST korreleret med EGFR-genet status. Derfor kan SDI og CD-DST være nyttige prædiktorer for potentielle kliniske reaktioner på de molekylære lægemidler mod cancer, cyclopedically

Henvisning:. Miyazaki R, Anayama T, Hirohashi K, Okada H, Kume M, Orihashi K (2016 )

In vitro

Drug Følsomhed Tests at forudsige Molecular Target Drug Responses i Kirurgisk resektion Lung Cancer. PLoS ONE 11 (4): e0152665. doi: 10,1371 /journal.pone.0152665

Redaktør: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: November 3, 2015; Accepteret: 17 marts 2016; Udgivet: 12 April, 2016

Copyright: © 2016 Miyazaki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Vores støtte oplysninger fil indeholder den minimale anonymiseret datasæt nødvendig for at kopiere vores resultater undersøgelsens

Finansiering:. undersøgelsen var fuldt finansieret af den ubegrænsede officielle fond fra Kochi Medical School, Kochi University, Japan, http: //www.kochi -ms.ac.jp/

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødelighed i mange udviklede lande, mens adenocarcinom udgør 70% af tilfældene af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). I japanske patienter, ca. 50 og 5% af adenocarcinomer har en mutation i den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) [1] og pighuder mikrotubulus-associeret protein-like 4-anaplastisk lymfom kinase (

EML4-ALK

) fusionsgen hhv. Molekylære mål anticancer stoffer som EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) og ALK-hæmmere har dramatisk ændret strategien for den kliniske behandling af cancer.

De fleste positiv EGFR-mutation lungekræft er følsomme over for EGFR-TKI’er, som bidrager at udvide progressionsfri overlevelse (PFS) og samlet overlevelse (OS) af patienterne [1-4]. Men positiv EGFR-mutation sager ikke altid udviser god klinisk respons på EGFR TKI-terapi. Ca. 30% af EGFR mutation tilfælde er resistente over for EGFR-TKI’er [3, 4]. Mutationen af ​​Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (K-RAS) og serin /threonin-proteinkinase B-Raf (B-RAF) eller andet mutationer såsom T790M vides at korrelere med resistens over for EGFR-TKI’er. [5] på den anden side, omkring 10% af tilfældene de EGFR vildtype udviser kliniske respons til EGFR-TKI’er [4]. Endvidere EGFR-TKI’er er også effektive i tilfælde af pladecellecarcinom, der almindeligvis ikke udviser EGFR genmutation [6]. Derfor er der nogle populationer af EGFR-TKI respondere, der ikke screenet for EGFR mutationer.

EML4-ALK

-positiv lungekræft er en primær malign lungetumor bestående af celler, som med en karakteristisk unormal konfiguration af DNA’et, hvor

EML4

genet er fusioneret til anaplastisk lymfom kinase (

ALK

) genet.

ALK

-hæmmere (crizotinib eller alectinib) er i øjeblikket tilgængelige til klinisk brug. Det er almindeligt at bekræfte tilstedeværelsen af ​​

EML4-ALK

bruge en fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse, men høj følsomhed immunfarvning er alternativt anvendt til screening af

EML4-ALK

. Men FISK og immunfarvning ikke nødvendigvis vedrører den kliniske responsrate til

ALK

hæmmere i praksis [7-9]. bør kræves Udviklingen af ​​molekylære target lægemidler til nye driver mutationer at omfatte undersøgelse af den ansvarlige genmutation. Der er i øjeblikket ingen etableret metode til omfattende forudsige effekten af ​​molekylære målretning midler, som virker på forskellige punkter af de forskellige signalveje.

Der er in vitro anticancer narkotika følsomhed test såsom succinatdehydrogenase hæmning (SDI) test , histoculture lægemiddelrespons assay (HDRA) metoden, og kollagen gel dråber indlejret kultur narkotika følsomhed test (CD-DST). Interessant, ordre-pigen kemoterapi med anticancer narkotika, som blev forudsagt så effektiv, faktisk udstillet højere kliniske respons end den konventionelle kemoterapi gjorde [10-12]. Desuden er der en rapport, hvilket antyder, at in vitro lægemiddelfølsomhed test kan være nyttig til at forudsige effekten af ​​adjuverende kemoterapi hos NSCLC. [13] Men der har ikke været nogen tidligere rapport om den kliniske anvendelse af in vitro drug følsomhedstest for forudsigelse af de potentielle virkninger af EGFR-TKI’er eller

ALK

hæmmere i kirurgisk resektion friske lunge kræft vævsprøver. Formålet med den aktuelle undersøgelse var at udvikle en in vitro kultur-baserede narkotika følsomhed test til at forudsige følsomhed kirurgisk resektion lungekræft til flere molekylære mål narkotika.

Materialer og metoder

A. Verifikation af hæmmende virkning af molekylære target lægemidler i lungecancer-cellelinie

De optimale doser af erlotinib og crizotinib (Funakoshi Co. Ltd, Tokyo, Japan), der anvendes i både 3- (4,5-dimethylthiazol-2 yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) assay og CD-DST blev titreret under anvendelse af følgende udødeliggjorte humane lunge cancercellelinier: HCC827 (adenocarcinom, EGFR mutation på Exon19, E746-A750 sletning), H1975 (adenocarcinom, EGFR mutation, Exon 21 L858R + T790M), H3122 (adenocarcinom,

EML4-ALK

fusion gen), A549 (adenocarcinom), og H460 (storcellet carcinom ). A549, blev H460, HCC827 og H1975 opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia USA). H3122 blev venligst stillet til rådighed af Dr. Pasi A. janne fra Harvard Medical School (Boston, MA, USA).

A- (1) MTS assay i humane lunge cancer cellelinjer.

cancerceller blev overført til 96 brønds fladbundede dyrkningsplader ved en tæthed på 4,0 x 10

4-6,0 × 10

4 celler /brønd med stigende koncentrationer af erlotinib (0,002, 0,02, 0,2, 2,0, og 20 uM) og crizotinib (0,006, 0,06, 0,6, og 3 uM), og inkuberet ved 37 ° C i 72 timer eksponeret for 5% CO

2. Efter tilsætning af 20 pi Cell Titer (Promega Corporation, Madison, WI, USA) til dyrkningsmediet, blev cancercellerne inkuberet i 90 minutter, og absorbansen blev målt ved 490 nm.

A- (2) immunoblotanalyse.

immunoblotanalyse blev udført som beskrevet tidligere [14, 15] Celler blev vasket med PBS, høstet, og lyseret i RIPA-buffer (Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan) med Phosphatase Inhibitor Cocktail (Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan). Til Western blot-analyse blev 30 ug af den samlede ekstrakter suspenderet i 20 ul prøvebuffer Solution med 2-ME til SDS-PAGE (Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan), blev elektroforetisk opløst på denaturerende polyacrylamidgeler, transferd til nitrocellulose. Membranerne blev blokeret med Blokering En eller Blokering One-P (Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan) og probet med kanin-monoklonale antistoffer mod phosphoryleret human ALK (Y1604), til ALK, receptor den phosphorylerede EGF (Y1068), og til EGF-receptoren (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Derefter blev membranerne inkuberet i anti-kanin sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA). Hvert bånd blev scannet af LAS -4000.mini (FUJIFILM, Tokyo, Japan).

A- (3) CD-DST i humane lunge cancer cellelinjer.

CD-DST var udført ifølge en tidligere rapporteret fremgangsmåde [16]. Kort fortalt blev cancercellelinier behandlet med en celle dispersion enzymopløsning (EZ, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) i 2 timer. Derefter blev der kun levedygtige celler, som adhærerede til kollagengelen opsamlet og suspenderet i det rekonstruerede type I collagen-opløsning (Cellmatrix Cd, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) ved en endelig densitet på 1 x 10

5 celler /ml. Tre dråber af collagen-celle-blanding (30 uL /​​dråbe) blev anbragt i hver brønd i en 6-brønds multiplate i en 60 mm skål og fik lov at gelere ved 37 ° C i en CO2 inkubator i 1 time. Slutkoncentrationen var ca. 3 × 10

3 celler /kollagengel dråbe. Dyrkningsmediet blev lagt oven i hver brønd, og pladen blev inkuberet i en COZ

2 inkubator ved 37 ° C natten over. Tre kollagen dråber blev placeret i bunden af ​​6-brønds plader for at muliggøre dyrkning i en tredimensional (3-D) miljø, og blev inkuberet i 7 dage i serumfrit medium i nærvær af de samme koncentrationsområder erlotinib og crizotinib anvendes i MTS-assayet. Derefter blev cellerne fikseret med 10% bufret formalin-(Nacalai Tesque inc., Kyoto, Japan), og farvet med Neutral Red (Kurabo, Osaka, Japan). Billeder af de faste celler blev taget med mikroskop fotografering. Billederne herunder både kræftceller (dybt farvet) og fibroblaster (let farvet) farvet med neutral rød blev erhvervet, fibroblaster blev udvalgt og elimineret som de uniformerede spindel celler med små kerner, så antallet af levedygtige celler kræft blev kvantificeret ved hjælp af en dedikeret software (Primege, version 1.01, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) [17, 18]. Levedygtighed erlotinib eller crizotinib-behandlede celler blev sammenlignet med de ubehandlede kontrol celler.

B. Klinisk undersøgelse med kirurgisk resektion frisk lungekræft vævsprøver

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Kochi Medical School Hospital (Etik anmeldelse typegodkendelsesnummer: ERB-100.866), og blev gennemført fra juni 2013 til August 2014 . de alle deltagere, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse i henhold til godkendelsesproceduren. Tredive-fem patienter med kirurgisk resektabel NSCLC (SDI og CD-DST, n = 23 og 12, henholdsvis) blev inkluderet i den kliniske undersøgelse. Efter kirurgisk resektion, en del af friske cancer vævsprøver, kontrolleret tumorceller ved berøring smøre cytologi, blev opnået for in vitro drug følsomhed test, der i de følgende afsnit.

B- (1) SDI forudsigelse af følsomheden over for erlotinib til kliniske lungekræft vævsprøve.

SDI er den protokol baseret på MTS assay for bulk friske vævsprøve herunder både kræftceller og ikke-kræftceller [19, 20]. Kort fortalt, de friske kirurgiske prøver (10 milliliter cubed: 1 ml) blev hakket til en pasta, behandlet med en celle dispersion enzym ved 37 ° C i 2-3 timer, centrifugeret, og derefter blev supernatanten fjernet. Levedygtige lungecancerceller blev derefter overført til plader med 96 brønde med en tæthed på 1,0 x 10

6 celler /brønd og inkuberet i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO

2 for 72 timer. Cellerne blev udsat for samme koncentrationsområde af erlotinib anvendt i MTS-assayet. Derefter blev 20 pi celle titer tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i 150 minutter efterfulgt af måling af absorbansen ved 490 nm til kvantificering cellelevedygtigheden.

B- (2) CD-DST forudsigelse af følsomheden over for erlotinib til kliniske lungekræft vævsprøve

Friske vævsprøver (3 milliliter kubik: 27μL). fås fra kirurgisk fjernet lungekræft væv blev hakket fint ved hjælp af en skalpel og fordøjet i en celle spredning enzym opløsning (EZ, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) i 2 timer. De dispergerede celler blev vasket to gange, opsamlet ved centrifugering ved 2400 rpm i 3 min, filtreret gennem en 80-um nylon mesh at få mere end 1,0 x 10

5-celler, som blev inkuberet i en kollagengel belagt kolbe (CG- kolbe, Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan) i en CO

2 inkubator ved 37 ° C i 24 timer. De udvundne celler blev derefter indesluttet i en collagen dråbe, der skal dyrkes i et 3D-miljø. Levedygtige lungecancerceller blev derefter inkuberet med 0,2 uM erlotinib (optimale dosis blev bestemt i A- (2)) i 7 dage. Tilberedte substrater (PCM) 2 blev anvendt i standard-protokol til CD-DST. Imidlertid blev signifikante resultater ikke opnås ved hjælp af den tidligere testmetode [21], og derfor PCM4 (Kurabo, oosaka, Japan), en vækstfaktor-reduceret dyrkningsmedium blev anvendt i den aktuelle undersøgelse.

B- (3)

EGFR

genmutation analyse.

Vi screenet for EGFR mutation under anvendelse peptidnucleinsyren-låst nukleinsyre polymerasekædereaktion (PNA-LNA PCR) clamp-metoden [22, 23] . Den detaljerede genmutation status for hver prøve blev bekræftet ved anvendelse af direkte sekventering metode. EGFR mutationer i det ekstraherede DNA blev undersøgt under anvendelse af PCR-baserede direkte sekventering for exon 19 og 21. Sekventering blev udført under anvendelse af Applied Biosystems PRISM dye terminator cycle-sekventering metode (Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA, USA) med en ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

C. Statistisk analyse

Vi beskrev dosisresponskurven af ​​de molekylære målretning lægemidler til lungekræft cellelinier. Sammenhængen mellem de somatiske genmutationer af

EGFR

i kræftcellerne og narkotika følsomhed over for erlotinib blev sammenlignet. Patienterne blev inddelt i to grupper: vildtype og mutant EGFR grupper. Resultaterne af lægemiddelfølsomhed test af begge grupper blev sammenlignet statistisk ved anvendelse af Mann-Whitneys U-test. Vi producentpriserne statistisk signifikant som p 0,05. Den ideelle afskæringsværdi af cellelevedygtighed udpeget til at forudsige kræftcellerne som følsomme til elrotinib blev bestemt ved anvendelse af en receiver operating characteristic (ROC) kurve. Dosis-respons og ROC kurver blev konstrueret ved hjælp af GraphPad Prism version 6.0 til Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Resultater

A. Inhiberende virkning af molekylære target lægemidler i lungecancer-cellelinie

A- (1) MTS assay lungekræft cellelinier.

levedygtighed lungekræft cellelinier efter eksponering for 2,0 uM erlotinib i 3 dage var 98,9 ± 9,3, 99,4 ± 10,7, 85,7 ± 10,7, og 31,9 ± 1,6 (%) for H460, A549, H1975, og HCC827 hhv. Væksten i HCC827 (med

EGFR

mutation, del E746_A750), men ikke, at de andre cellelinjer uden mutation eller med 2

nd resistente mutation (T790M) cellelinje blev hæmmet efter eksponering markant til erlotinib (p = 0,030, fig 1-a). Tilsvarende levedygtighed cellelinjer efter eksponering til 0,60 uM crizotinib i 3 dage var 103,2 ± 5,67, 96,9 ± 8,05, og 35,8 ± 3,24% for H460, A549, og H3122, hhv. H3122 (med

EML4-ALK

fusion gen) udviste en betydelig vækst hæmning efter udsættelse for crizotinib (Fig 1-b)

(a) Udsættelse for erlotinib i MTS analysen:. HCC827 (EGFR exon 19 udgår) udviste en betydelig vækst hæmning, mens A549 og H460 (wild EGFR) eller H1975 (EGFR T790M modstand anden mutation) ikke var følsomme over for elrotinib. (B) Udsættelse for crizotinib i MTS assay: H3122 (

EML4-ALK

fusion) udviste en betydelig vækst hæmning, mens andre kræftceller uden fusion gen ikke var følsomme over for crizotinib. (C) Angivelse af EGFR protein og hæmning af phosphorylering med erlotinib i NSCLC cellelinjer i western blot analyse: Erlotinib hæmmede phosphorylering af EGFR (pEGFR) i HCC827, men hæmmede ikke det i H1975. (D) Angivelse af ALK og hæmning af phosphorylering med crizotinib i NSCLC cellelinjer i western blot analyse: H3122 udtrykte ALK og crizotinib hæmmede fosforylering af ALK (Palk). (E) Udsættelse for erlotinib i CD-DST. (F) Udsættelse for crizotinib i CD-DST. Sammenlignet med MTS assay, CD-DST kræves lavere doser af erlotinib at udstille signifikant forskel i væksten mellem cellelinjer.

EGFR

, epidermal vækstfaktor receptor gen;

EML4-ALK

, pighuder mikrotubuli-associeret protein-lignende 4-anaplastisk lymfom kinase gen.

A- (2) Immunoblotting analyse.

Vi undersøgte EGFR og ALK-ekspression i tumorcellerne og virkningen af ​​erlotinib og crizotinib på phosphorylering af EGFR og ALK ved Western blotting. Alle cellelinier udtrykte EGFR. EGFR-phosphorylering blev undertrykt af erlotinib i HCC827. På den anden side, havde erlotinib ikke undertrykke phosphorylering af EGFR i H1975 celler (Fig 1-c). H3122 celler udtrykte ALK, og ALK fosforylering blev undertrykt af crizotinib (Fig 1-d).

A- (3) CD-DST i humane lunge cancer cellelinjer.

cellernes levedygtighed af hver lungekræft cellelinje efter udsættelse for 0,2 uM af erlotinib i 7 dage var 87,1 ± 0,56, 72,2 ± 5,20, 55,8 ± 8,1, og 0,63 ± 0,19% for H460, A549, H1975, og HCC827 cellelinier, henholdsvis (n = 3 hver). HCC827 cellelinje viste signifikant væksthæmning efter udsættelse for erlotinib (p = 0,028). På den anden side blev der ikke vækstinhiberende virkning observeret i vild-type EGFR cellelinjer med eksponering for 0,2 uM erlotinib (fig 1-e). Levedygtigheden af ​​hver lungekræft cellelinje efter udsættelse for 0,6 uM crizotinib i 7 dage var 93,7 ± 3,13, 75,5 ± 7,43, og 20,1 ± 2,13% for H460, A549 og H3122 cellelinier, henholdsvis (n = 3 hver), og H3122 viste signifikant cellevækstinhiberingen efter udsættelse for crizotinib (fig 1-f).

B. Klinisk undersøgelse

I alt femogtredive (SDI: 23, CD-DST: 12) patienter blev indrulleret i denne undersøgelse (tabel 1). Fire af 24 tilfælde (16,7%) i mænd og syv af 11 sager (63,6%) hos kvinder udtrykte EGFR mutation. Ved histologisk subtype, 8 af 11 tilfælde (72,7%) af papillær adenocarcinom, 3 af 4 tilfælde (75%) af BAC; bronkiole-alveolær carcnoma udtryk i, og en af ​​7 tilfælde (14,3%) af acinar adenocarcinom udtrykte EGFR mutation.

B- (1) SDI for klinisk prøvemateriale.

Evaluering af den væksthæmmende effekt af erlotinib med SDI-metoden viste, at kræftcellen levedygtighed blev reduceret koncentration-afhængigt i

EGFR

mutation-positive tilfælde, men næppe i

EGFR

-negative tilfælde selv ved høj koncentration på op til 20 mM (data ikke vist). Hertil kommer, efter eksponering erlotinib 20 uM, levedygtighed

EGFR

vildtype tilfælde var 86,3 ± 11,2%, mens den for mutanterne var betydeligt lavere på 60,0 ± 9,8% (p = 0,0004, fig 2- a).

Distribution kort over cellelevedygtighed evalueret i kirurgisk resektion frisk lungekræft væv ved hjælp af (a) SDI efter udsættelse for 20 uM erlotinib, med et tilfælde uden

EGFR

mutation undertrykt af 20 uM erlotinib og (b) CD-DST efter udsættelse for 0,2 uM af erlotinib. Statistisk signifikans observeret i celle levedygtighed mellem to grupper af

EGFR

mutation-positive og vildtype (p = 0,026).

B- (2) CD-DST for klinisk prøvemateriale.

Efter udsættelse for 0,2 uM erlotinib, levedygtigheden af ​​

EGFR

mutanter og vilde-typer blev 33,5 ± 21,2 og 79,0 ± 18,6%, henholdsvis og der var en betydelig forskel i cellen levedygtighed (p = 0,026, figur 2-b). De repræsentative CD-DST resultater af både

EGFR

mutant og vilde sager typen er illustreret i figur 3. Dataene i EGFR mutation status og cellernes levedygtighed af hver kliniske patienter blev vist i S1 tabel.

CD-DST resultaterne af to repræsentative tilfælde med kræftceller i hver dråbe dyrket med eller uden 0,2 uM af erlotinib i 7 dage. Øverste række viser fotografier af kollagen gel dråber indeholder kræftceller, midterste række viser dråber scannet ved hjælp af dedikeret billede scanning system, og nederste række viser dråber med elimineret fibroblaster farvede svagere end cut-off point. Case med exon 19 del i

EGFR

(venstre to kolonner) viser antal af kræftceller blev reduceret til 32,0% af ubehandlet kontrol, når de udsættes for 0,2 uM erlotinib. Patient med

EGFR

vildtype tilfælde (højre to kolonner) viste 88,4% vækst i forhold til kontrollen.

ROC kurve blev konstrueret til at bestemme cut-off værdi til at forudsige tilstedeværelsen af ​​

EGFR

mutationer fra væksthæmning på in vitro-drug følsomhedstests [24]. I SDI testen, arealet under kurven (AUC) for cellelevedygtighed var 0,958 (Fig 4-a). Forholdet viste den bedste kombination af følsomhed og specificitet for forudsigelse af narkotika følsomhed ved værdier 72,7% (93,3 og 100% følsomhed og specificitet, henholdsvis). I CD-DST viste ROC kurve, AUC var 0,963 for cellelevedygtighed (figur 4-b), mens den bedste kombination af følsomhed og specificitet for forudsigelse af lægemiddel følsomhed var på 55,9% (88,9 og 100% følsomhed og specificitet, henholdsvis ).

(a) ROC kurver til cellelevedygtighed evalueres ved hjælp af SDI forudsige

EFGR

mutation viser AUC på 0,958. (B) ROC kurver for cellelevedygtighed vurderet ved anvendelse kollagengel droplet indlejret kultur lægemiddelfølsomhed test (CD-DST) at forudsige

EGFR

mutation. AUC var 0,963.

Fremadrettet to patienter med EGFR-mutation fik tilbagevendende sygdom efter den aktuelle undersøgelse. Cellen levedygtighed af kræftcellerne afledt af disse patienter var 55,6% og 31,4% med eksponeringen af ​​erlotinib i CD-DST. Erlotinib udstillet de fremragende klinisk respons for disse patienter. Den ene patient havde de forstørrede metastatiske lymfeknuder. Efter 8 måneders erlotinib behandling, det metastatiske lymfeknuder skrumpet fra 10,5 mm til 3,2 mm og SUV (standardiseret optagelse værdi) af 18F-FDG (18F-fluorodeoxyglukose) reducerede 4,44-0,69. Virkningen blev bedømt som CR (fuldstændig reaktion) radiologisk (Fig 5-a). Den anden patient havde pleural formidling med elevation af CEA (carcinoembryonisk antigen); en af ​​de serologiske tumormarkører for lungekræft. Som et resultat af Erlotinib behandling, niveauet af CEA reduceret fra 146,0 til 25,6 (ng /ml) (figur 5-b). Virkningen af ​​de molekylære målretning lægemidler til patienter med positiv følsomhed i in vitro drugsensitivity tests og negative gen alterlation er at blive afsløret.

(a) Sag # 1 havde udvist 55,6% af cancercellevækst med erlotinibeksponeringen i CD-DST. Den cancer spredes til medianstinal lymfeknude (gule pile). Efter erlotinib behandling, det mediastinale lymfeknuder skrumpet fra 10,5 mm til 3,2 mm i størrelse, og SUV af FDG faldt fra 4,4 til 0,69. (B) Case # 2 havde udviste 31,4% af cancercellevækst med erlotinibeksponeringen i CD-DST, Patienten forårsagede pleural formidling med højt CEA. Erlotinib behandling resulterede i en reduktion af CEA 146,0-25,6 (ng /ml). 18F-FDG: 18F-fluorodeoxyglukose. PET: positoron emission tomografi. SUV: standardiseret optagelse værdi. CEA:. Carciono-emboryonic antigen

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, vi først bekræftet, at erlotinib og crizotinib udstillet dosisafhængig vækst hæmning af dyrkede lunge kræftceller. Den hæmmende effekt af erlotinib var stærkere i lungekræft cellelinjer med

EGFR

mutation, end det var i dem uden mutationen. Ligeledes viste crizotinib stærkere hæmning af lungekræft-cellelinjer med en tilbagevendende gen fusion mellem

EML4

ALK

end den gjorde i dem uden fusionsgenet. For det andet, vi påvist, at vækstinhiberende virkning af erlotinib vurderet ved enten SDI eller cd-DST var signifikant korreleret til

EGFR

mutation status i den kliniske undersøgelse under anvendelse af de kirurgisk resektion lung cancer vævsprøver. Celledyrkning-baserede in vitro drug følsomhedstests kan være i stand til at forudsige følsomheden af ​​cancerceller til forskellige molekylære target lægemidler under udvikling til fremtidig klinisk anvendelse.

SDI udført på kliniske prøver viste væksthæmning hos patienter med

EGFR

mutation. Imidlertid SDI krævede højere koncentrationer af erlotinib for celleproliferation inhibering end normalt fremstillet i blodet efter administration af standard orale doser [25]. Desuden SDI krævede mere end seks sæt af 1,0 × 10

6 celler, mens CD-DST kræves mindre end 1,0 × 10

5 celler til at udføre undersøgelserne. Med mindre mængde krav væv, CD-DST næppe påvirker patologisk undersøgelse.

I CD-DST, erlotinib viste vækst hæmmende effekt med lavere koncentration end MTS analysen. HCC827 cellevækst blev undertrykt næsten fuldstændigt ved udsættelse for 0,01 uM erlotinib medens den af ​​H460, A549 og H1975-celler var en smule undertrykt efter eksponering for 0,2 uM, hvorefter den steg koncentrationsafhængigt måde. Disse resultater antyder, at CD-DST detekteret forskellen i væksthæmmende effekter i alle tilfælde ved koncentration af erlotinib så lav som 0,2 uM, hvilket er lavere end serumkoncentrationen af ​​patienter, som regelmæssigt fik administreret 150 mg erlotinib dagligt [25].

et kontroversielt resultat blev rapporteret 0,35 uM gefitinib undladt at hæmme tumorvækst i patienter, som er mutation-positive i en tidligere undersøgelse, der undersøgte korrelationen af ​​

EGFR

mutation og narkotika følsomhed ved hjælp af cD- DST [21]. Vores undersøgelse benyttede PCM4 serumfrit dyrkningsmedium med reducerede vækstfaktorer i stedet for den konventionelle pCM2, dette måske grunden vores resultat udviser korrelation EGFR mutation med deres følsomhed med succes. Men sammensætningen af ​​PCM4 ikke frigives på grund af beskyttet patent.

histoculture lægemiddelrespons assay (HDRA), er et andet lægemiddel følsomhed test, der anvender en tredimensionel kollagengel, og dosis-respons-kurven for gefitinib for lungekræft blev rapporteret ved hjælp af denne metode. Men undersøgelsen ikke omfatter korrelere

EGFR

mutation og effekter af gefitinib [26].

I fremtiden kan nye molekylære abnormiteter blevet klart sammen med den forventede udvikling af relevant molekylær målrettet lægemidler til deres behandling. Derfor er der et presserende behov for at udvikle metoder, der samtidig kan forudsige de kliniske respons af hver molekylær målrettet lægemiddel til en rimelig pris. Nylige fremskridt i genetiske søgeteknikker har aktiveret rapportering af omfattende genekspressionsprofilering systemer [27, 28]. Men disse systemer er stadig ualmindeligt,. Desuden til forudsigelse af følsomhed over for ALK-hæmmere,

EML4-ALK

bør påvises ved FISH eller IHC stedet genmutation analyse [29, 30]. Det er kompliceret at udføre de forskellige former for screening kræves til påvisning af genændringer. Celle-kultur baseret in vitro vækst analyser har fordel, fordi de undersøger narkotika på samme tid. CD-DST især har den fordel, at minimere mængden af ​​cancervæv (3mm kubik) i vurderingen af ​​klinisk vævsprøve sammenlignet med SDI (10mm længdeenhed) Salg

Undersøgelse begrænsninger:. I denne undersøgelse, vi viste, at in vitro drug følsomhed var signifikant korreleret til

EGFR

mutation status. Men både

EGFR

mutation analyse og in vitro drug følsomhedstests er de potentielle forudsige faktorer af kliniske reaktioner på EGFR-TKI-terapi. Derfor bør gyldigheden af ​​de forudsige faktorer i sidste ende vurderes ved at undersøge deres korrelation til kliniske respons, som kræver afklaring i fremtidige prognose-relaterede undersøgelser.

Støtte Information

S1 Table. Karakteristik af kliniske patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152665.s001

(PDF)

anerkendelser

Forfatterne takker Prof. Kazuhiko Nakagawa af Institut for Medicinsk Onkologi, Kinki University Fakultet Osaka-Sayama, Japan og Dr. Isamu Okamoto af Forskningsinstitut for Sygdomme i bryst, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Fukuoka, Japan for venligt at give lungekræft-cellelinjer. Forfatterne også erkende Mr. Takehiro Tatenuma, Ms Mai Taguchi, og Ms. Yoko Asakura for deres tekniske bistand in vitro drug følsomhedstests.