PLoS ONE: Multi-Scale Genomisk, transkriptomisk og proteomiske Analyse af kolorektal kræftcellelinjer at identificere nye Biomarkører

Abstrakte

Valg kolorektale cancer (CRC) patienter tilbøjelige til at reagere på terapi er stadig en klinisk udfordring. Formålet med denne undersøgelse var at fastslå, hvilke gener differentielt blev udtrykt med hensyn til behandling følsomhed og relatere dette til at kopiere nummer i et panel af 15 CRC-cellelinjer. Kopiér nummer variationer af de identificerede gener blev vurderet i en kohorte af CRCs. IC

50’erne blev målt for 5-fluoruracil, oxaliplatin, og BEZ-235, en PI3K /mTOR inhibitor. Cellelinjer blev profileret hjælp vifte komparativ genomisk hybridisering, Illumina genekspression analyse, reverse fase proteinarrays, og målrettet sekventering af

KRAS

hotspot mutationer. Hyppige gevinster blev observeret ved 2p, 3q, 5p, 7p, 7q, 8Q, 12p, 13q, 14q, og 17q og tab på 2q, 3p, 5q, 8 p, 9p, 9q, 14q, 18q, og 20p. Ofte fået regioner indeholdt

EGFR

,

PIK3CA

,

MYC

,

SMO

,

TRIB1

,

FZD1

og

BRCA2

, mens ofte tabt regioner indeholdt

FHIT

MACROD2

.

TRIB1

blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Gene berigelse analyse viste, at differentielt udtrykte gener med hensyn til behandling respons var involveret i Wnt signalering, EGF-receptor signalering, apoptose, cellecyklus, og angiogenese. Trinvis integration af kopi nummer og genekspression data gav 47 kandidatgener, der var signifikant korreleret.

PDCD6

blev udtrykkes forskelligt i alle tre behandlingsgrupper svar. Tissue microarrays blev konstrueret til en kohorte af 118 CRC patienterne og

TRIB1

og

MYC

amplifikationer blev målt ved hjælp af fluorescens

in situ

hybridisering.

TRIB1

og

MYC

blev opformeret i 14,5% og 7,4% af kohorten henholdsvis og disse amplifikationer var signifikant korreleret (p ≤ 0,0001).

TRIB1

proteinekspression i patientens kohorte var signifikant korreleret med pERK, Akt, og caspase 3 udtryk. Afslutningsvis er et sæt af kandidat prædiktive biomarkører for 5-fluorouracil, oxaliplatin og BEZ235 beskrevet, at berettige til yderligere undersøgelse. Forstærkning af den formodede onkogen

TRIB1

er blevet beskrevet for første gang i en kohorte af CRC patienter

Henvisning:. Briffa R, Um I, Faratian D, Zhou Y, Turnbull AK, Langdon SP, et al. (2015) Multi-Scale Genomisk, transkriptomisk og proteomiske Analyse af kolorektal kræftcellelinjer at identificere nye biomarkører. PLoS ONE 10 (12): e0144708. doi: 10,1371 /journal.pone.0144708

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: Juni 16, 2015; Accepteret: November 23, 2015; Udgivet: 17. december 2015

Copyright: © 2015 Briffa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist finansieret af det strategiske uDDANNELSESFORLØB Scholarship (Malta). Stipendiet er medfinansieret af Den Europæiske Union – Den Europæiske Socialfond (ESF) under operationelle program II – Samhørighedspolitikken 2007-2013 “Empowering People for flere arbejdspladser og en bedre livskvalitet”. Dette projekt blev desuden finansieret af Medical Research Scotland

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) tegner sig for 8 % af alle kræftdødsfald [1], med variabel overlevelse på mellem 39% og 65% afhængig på scenen på diagnose [2]. Risikoen for at udvikle CRC er afhængig både genetiske og livsstilsrelaterede faktorer og øger markant med alderen [2]. Selvom behandlingen kan være helbredende, en betydelig del af CRC patienter har en høj risiko for tilbagefald efter kirurgi og kemoterapi [3].

De store veje impliceret i colorektal carcinogenese indbefatter, men er ikke begrænset til, PI3K /mTOR pathway, den mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK) pathway, og Wnt-vejen [4], med JAK /STAT pathway, pindsvineoverføringsvejen, og NFKB pathway også involveret [5]. Disse veje styres via komplekse krydstale, negativ feedback, og andre kompenserende mekanismer. Mens aktivering af disse veje sker via mutationer i deltagende onkogener og tumorsuppressorgener, henholdsvis af de 80 somatiske mutationer i individuelle CRC, kun 15 eller muligvis mindre sandsynligvis vil være væsentlige drivere af tumor initiering, progression, og /eller vedligeholdelse [ ,,,0],6]. De hyppigst muterede gener i CRC er

APC

(70-80%),

TP53 Hotel (50%),

KRAS

(35-45%),

PIK3CA

(25-32%),

BRAF

(10-17%) og

PTEN

(4-5%) [7-12].

Første linje terapi for CRC er normalt fluoropyramidine monoterapi og oxaliplatin eller irinotecan-baseret kemoterapi [13]. For nylig er monoklonale antistoffer, såsom cetuximab, panitumumab, og bevacizumab blevet licenseret i kombination med kemoterapi for metastaserende CRC (mCRC) [14] som selektive og specifikke anticancermidler med et højt terapeutisk indeks og lavere toksicitet end traditionelle behandlinger [15]. Imidlertid respons på behandling er varierede, med mindre end en tredjedel af patienterne responderede på 5-fluoruracil [16]. Selvom

KRAS

BRAF

mutationer indikerer resistens over for EGFR-målrettede behandlinger, omkring 40-70% af vildtype

KRAS

FRK patienter udlede lidt eller ingen gavn af EGFR- målrettede behandlinger [17]. Der er stadig en mangel på prædiktive markører, der tillader læger at vælge patienter med størst sandsynlighed vil drage fordel af en specifik behandling.

Her har vi forsøgt at systematisk karakterisere et panel af CRC-cellelinjer, valgt til at afspejle mangfoldigheden af ​​denne sygdom , ved hjælp af high-throughput analyser for at identificere biomarkører for resistens over for både målrettede og ikke-målrettede behandlinger.

Metoder

CRC cellelinje panel

Femten CRC cellelinjer var studerede: de nær diploid cellelinjer DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, og LoVo (alle fra ECACC undtagen HCT116p53 – /- som var en gave fra Dr. G Smith, University of Dundee, UK [18]) og de aneuploide cellelinjer SW480, SW837, HT29, T84, Colo 201, Colo 320DM, LS411N, SK-CO-1, NCI H508 og NCI H716 (alle fra ATCC), bortset fra Colo 320DM, T84, og SW837 (alle fra ECACC) .

cellelinjerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Gibco

®, Cat nr 31885..) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, PAA, Cat no.. A15-101) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco

®, Cat. No.15140-122). Cellelinierne blev dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C indeholdende 5% CO

2. Alle cellelinier blev testet for mycoplasma ved anvendelse af Venor

™ GeM Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich, kat. Nr. MP0025). Når cellelinierne nåede 70-80% konfluens, blev de trypsinbehandlet anvendelse af 0,05% trypsin-EDTA (1X) med phenolrødt (Gibco

®, kat. Nr. 25300).

Kliniske prøver

Archival formalinfikserede, paraffin-indstøbt (FFPE) vævsprøver blev opnået fra resektion prøver fra patienter, der bor i Skotland, der blev diagnosticeret med CRC mellem 1996 og 2003 og var under 55 år på tidspunktet for diagnosen (se til S1 tabel). I alt 870 patienter var blevet ansat som tidligere beskrevet [19]. Alle tilfælde blev gennemgået af en gastrointestinal histopatolog før TMA konstruktion for at sikre, at vævet var består primært af tumor. Alle kræftformer blev iscenesat Dukes ‘A og B. Kohorte materiale og kliniske optegnelser adgang blev ydet af Tissue udvalg, Edinburgh Eksperimentel Cancer Medicine (Ref: TR029), Lothian Research Ethics Committee (Ref: 08 /S1101 /41) og sydøstlige Skotland HSS (SAHSC) Bioressource. (Ref: SR117)

Drug følsomhed analyser

5-fluorouracil (5-FU) 50 mg /ml opløsning til injektion blev købt fra Medac GmbH. Oxaliplatin (L-OHP) 5 mg /ml koncentrat til infusionsvæske, opløsning (Fresenius Kabi Oncology plc, UK) blev opnået fra den vestlige General Hospital Apotek, Edinburgh. Den målrettede inhibitor BEZ235 (kat. Nr. S1009) blev købt fra Selleck Chemicals. Hver plade med 96 brønde bestod af seks brønde indeholdende celler i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin, der tjente som kontrol. Cellerne blev podet i 48 timer før tilsætning af lægemidlerne. Otte forskellige koncentrationer blev anvendt pr lægemiddel i området mellem 5 uM til 100 uM (5-FU, L-OHP) og mellem 2,5 nM og 80 nm, (BEZ235) hhv. Cellerne blev inkuberet med lægemidler til 96 timer. For at bestemme cellelevedygtighed, blev 20 pi af Alamar Blå tilsat i hver brønd i 6 timer inden aflæsning af plader under anvendelse Fluoroskan Ascent FL. Alle lægemiddelfølsomhed assays blev gentaget mindst to gange og seks brønde blev podet ved hver medikamentkoncentration.

En gennemsnitlig RFU målingen blev foretaget for hver lægemiddelkoncentration og cellelevedygtighed blev beregnet som en procentdel af den ubehandlede kontrol. Fejlbjælker blev beregnet ved anvendelse korreleret standardafvigelse af midlerne. IC

50’erne for 5-FU, L-OHP og BEZ235 blev bestemt ved hjælp af XLfit 5.0 softwarepakke (ID Business Solutions, UK). Ingen ekstrapolation blev udført ved fastlæggelsen IC

50 værdier og outliers blev beregnet som havende et konfidensniveau større end 0,05.

DNA, RNA og protein udvinding

Genomisk DNA blev ekstraheret fra hver cellelinie ved anvendelse DNeasy blod og væv Kit (Qiagen, kat 69.504) ifølge producentens instruktioner. DNA-koncentrationer blev verificeret ved hjælp af NanoDrop 2000 mikro-volumen spektrofotometer (Thermo Scientific). Tilfredsstillende DNA renhed blev betragtet som større end eller lig med en 260/280 forhold på 1,8, hvilket sikrer minimal protein kontaminering af prøven. Kvaliteten af ​​DNA-prøverne blev yderligere analyseret under anvendelse af agarosegelelektroforese. Efter elektroforese blev gelen forsigtigt fjernet og DNA-båndene blev visualiseret under anvendelse af Gel Documentation System.

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinjer i to eksemplarer ved anvendelse af RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, kat. Nr. 74.204 ) og miRNeasy Mini Kit (Qiagen, kat. nr. 217.004). Koncentrationen af ​​RNA blev verificeret under anvendelse af NanoDrop 2000 spektrofotometer. Tilfredsstillende RNA renhed blev betragtet som en 260/230 forhold på ca. 2,0.

Proteinlysater fremstilledes når cellelinierne var ca. 80% sammenflydende, som beskrevet detaljeret andetsteds [20]. Proteinkoncentrationen af ​​lysaterne blev bestemt via bicinchoninsyre (BCA) assay (Sigma-Aldrich, kat. Nr. C2284-25ML, katalog-nr B9643-1L).

KRAS

blev analyseret mutation analyse af Sanger sekventering

Hotspot mutationer i codon 12 og 13. Primeren sæt er designet ved hjælp af Primer Premier

® V6.0 software (PREMIER Biosoft International). Primersekvenserne (5 ’til 3′) for

KRAS

01 var som følger: GGT ACT GGT GGA GTA TTT GAT AGT GT (fremad) og TGA ATT AGC TGT ATC GTC AAG GCA CT (tilbage).

KRAS

exon 2 amplifikation blev udført under anvendelse af Hotstar Hi Fidelity Polymerase Kit (Qiagen Quality

®, kat. Nr. 202.602). PCR-reaktionen blev udført i DNA Engine Opticon 2 Real-Time Cycler (GMI, Inc). Forventede varighed af PCR-produktet blev bekræftet ved tilstedeværelsen af ​​et enkelt bånd på et passende molekylvægt. Sanger sekventering blev udført på Medical Research Council Human Genetics Unit (MRC-HGU), Edinburgh. Produkter blev sekventeret under anvendelse af ABI Prism

® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) og data blev analyseret ved anvendelse Mutation Surveyor

® DNA Variant Analysis V3.97 programmel.

Microarray analyser

Array komparativ genomisk hybridisering.

sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) blev udført ved anvendelse af NimbleGen microarray (Roche). Prøve mærkning blev udført med NimbleGen tofarvet DNA Labeling Kit (Roche, kat. Nr. 06 370 250 001). Hybridisering blev udført i MRC-HGU, Edinburgh anvendelse af en NimbleGen hybridisering Kit (Roche, kat. Nr. 05 583 683 001), NimbleGen Sample Tracking kontrol Kit (Roche, kat. Nr. 05 223 512 001) og to humane CGH 12 x 135K Whole-Genome Fliselægning Arrays V3.0 (Roche, kat. nr. 05 520 878 001). NimbleScan software blev anvendt til at generere par indberetningsfiler anvendes til kopital dataanalyse. Dataene er deponeret på det nationale center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus med tiltrædelsen nummer GSE72296.

Genekspression profilering.

Tre sæt RNA-prøver blev forberedt på Illumina

® Whole Genome Gene Expression Profiling, hvor 48,804 udskrifter per prøve blev genereret. De tre sæt bestod af to sæt biologiske gentagelser og et sæt tekniske gentagelser. Alle RNA-prøver blev fortyndet til en koncentration på 500 ng /11μl. Illumina

® TotalPrep

™ RNA Amplification Kit (Ambion

®, kat. Nr. AMIL1791) blev anvendt til at generere biotinyleret, amplificeret RNA til hybridisering med Illumina

® human HT-12 v4. 0 BeadChip. Før forløber med forberedelsen af ​​RNA-prøver til microarray analyse blev RNA integritet vurderes yderligere med Agilent

® 2100 Bioanalyzer hjælp af Agilent

® RNA 6000 Nano Kit (Agilent, kat. Nr. 5067-1511) . Prøver med en RNA Integritet Number (RIN) på 7 eller bedre blev anset for acceptabel for hybridisering.

Prøverne blev analyseret på Wellcome Trust Clinical Research Facility, Edinburgh (Gene Expression Project-CRF E11960), hvor de var fortyndet til en koncentration på 150 ng /pl og hybridiseret på tre humane HT-12 v4 Expression BeadChip arrays. To tekniske replikater blev hybridiseret på hvert array til at tjene som en intern kvalitetskontrol. Prøverne blev tilfældigt hybridiseret langs tre Illumina

® HumanHT-12v4 Expression BeadChip arrays.

Post-hybridisering, arrays blev scannet ved hjælp af Illumina HiScan

® Platform (Illumina

®, kat. nr. SY-103-1001). De BeadArray datafiler blev eksporteret fra Illumina s scanning software og importeret til genekspression modul af GenomeStudio software (Illumina

®), hvor efterfølgende datafiler blev omdannet til fanen afgrænsede filer. Dataene er deponeret på det nationale center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus med tiltrædelsen nummer GSE72544 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE72544). Salg

omvendt fase proteinarrays

omvendt fase proteinarrays (RPPA) er en medium-throughput teknik, der tillader screening af prøver med et stort panel af proteiner af interesse i en relativt kort tid , mens anvendelse af minimale mængder af både prøve og antistoffer [21]. De denaturerede og reducerede protein prøver af de 15 CRC-prøver blev spottet i tre eksemplarer på hver pude af et 2-Pad FAST

® nitrocellulose belagt objektglas (Whatman Ltd., kat. Nr. 10.485.317) under anvendelse af en BioRobotics Microgrid MG II Biobank (Isogen Life Science). Efterfølgende blev de med held probet med et panel af 31 optimeret, in-house valideret, total og fos- antistoffer som beskrevet tidligere (S2 Table) [20]. Disse antistoffer blev udvalgt til at målrette vigtige proteiner involveret i celleproliferation og overlevelse, invasion, metastase, angiogenese, DNA-skader, og apoptose blev optimeret og valideret via Western Blotting. De RPPA pletter blev kvantificeret ved hjælp MicroVigene

™ RPPA Analysis Module software (VigeneTech Inc.). Data blev analyseret som beskrevet tidligere [22].

De RPPA pletter blev kvantificeret ved hjælp MicroVigene

™ RPPA Analysis Module software (VigeneTech Inc.).

Dataanalyse

Genomisk dataanalyse.

Sanger sekventering blev analyseret ved hjælp Mutation Surveyor

® DNA Variant Analysis Software V3.97 (Soft Genetics

®, USA). De rå datafiler .ab1 genereret af ABI Prism

® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) blev importeret til softwaren og analyse standardindstillingerne blev anvendt. Genbank annotationsfiler blev automatisk hentet og reference- filer, der anvendes til mutation afsløring blev automatisk syntetiseret.

aCGH blev analyseret ved hjælp af Partek

® Genomic Suite

™ Version 6.6 (Partek Inc.). Dataene blev oprindeligt normaliseret ved hjælp Løss Normalisering og Genomisk Segmentering algoritmen blev anvendt til at analysere kopi nummer amplificeringer og sletninger. Den brugerdefinerede segmentering parametre var følgende: mindstekravene genomiske markører var 10, p-værdien var 0,001, og signal-til-støj-forholdet var 0,03. En region blev rapporteret som tabt, hvis log2 kopitalsforholdet den var under -0,3 og vundet, hvis log 2 kopiantals forholdet var over 0,15. Tre forskellige region lister blev skabt: (1) regioner, der blev opnået i syv eller flere cellelinier; (2) regioner deleteret i syv eller flere cellelinier; (3) de, der indeholder de højeste amplifikationer, dvs. log2-forhold lig med eller større til 1,0 (svarende til en kopi antal 2). Derudover blev genomisk segmentering clustering udført under anvendelse euklidiske afstand og gennemsnitlig binding. Kopien nummer analyse blev udført på kromosom 1 til kromosom 22 og udelukkede de to kønskromosomer.

transkriptom dataanalyse.

Prøven gen profil fil genereret fra genekspression analysen var fraktil normaliseret og filtreret for disse prober, hvor påvisningen p-værdi ≤ 0,05. Dataene blev derefter log2 transformeret og betyder centreret for at opnå relative værdier mellem cellelinjer. Prøven gen profil fil blev derefter kommenteret hjælp Hg18 før udførelse differential genekspression analyse (DGEA).

DGEA blev udført ved hjælp af ArrayMining, en online microarray data mining softwarepakke [23]. Differentiel genekspression blev udført ved anvendelse SAM-analyse at liste gener udtrykkes differentielt i forhold til behandlingsrespons. Tre forskellige analyser blev udført: (1) 5-FU meget følsomme cellelinjer

vs

. 5-FU mindre følsom cellelinjer, hvor meget følsomme cellelinjer blev defineret som at have en IC

50 ≤ 30 pM; (2) L-OHP meget følsomme cellelinjer

vs

. L-OHP mindre følsom cellelinjer, hvor meget følsomme cellelinjer blev defineret som at have en IC

50 ≤ 10 pM; (3) BEZ235 følsomme cellelinjer

vs

. BEZ235 ufølsom cellelinjer, hvor følsomme cellelinjer blev defineret som at have en IC

50 80 nm.

Fortolkning af data blev udført ved hjælp af Funktionel Annotation Clustering i DAVID bioinformatik ressourcer [24].

Integration af hyppigt forstærkede regioner med genekspression data.

genekspression data for de gener lokaliseret i de ofte opnået regioner blev filtreret fra. Brug Pearsons korrelationskoefficienter med Bonferroni korrektion blev en liste af gener, der havde en signifikant sammenhæng mellem log2 kopi talværdi og genekspression genereret. Genekspressionen data for cellelinier blev analyseret med hensyn til behandlingsrespons ved hjælp Wilcoxon Rank Sum anvendelse af GraphPad Prism 6.

proteomiske dataanalyse.

Data genereret fra RPPA blev normaliseret under anvendelse Cluster 3.0 , et open source clustering værktøjet [25]. Data blev log-transformeret, mener centreret i Cluster 3,0, og grupperet af korrelation centrering og gennemsnitlig kobling hjælp MeV 4.8 [26]. RPPA resultater for de 15 CRC-panelet blev analyseret med hensyn til behandlingsrespons ved hjælp Mann Whitney U test anvendelse af GraphPad Prism 6.

Tissue microarray (TMA), automatiseret kvantitativ analyse (AQUA), og FISH

Fem-um hæmatoxylin og eosin-farvede objektglas blev fremstillet ud fra FFPE blokke, og tumorområder var præget af en patolog og uddannet forskning tekniker. Efter histopatologisk undersøgelse blev 118 sager udvalgt ud af den oprindelige kohorte og et væv microarray (TMA) blev bygget af en kvalificeret tekniker. Fire biologiske replikater (TMA000034A-D) blev konstrueret som beskrevet detaljeret andetsteds [27] og skæres i 5 um sektioner under anvendelse af en mikrotom og monteret på objektglas. Kliniske og patologiske parametre for denne kohorte er sammenfattet i S1 tabel.

Protein udtryk for TRIB1 blev vurderet med anti-TRIB1 kanin polyklonale antistof i CRC TMA hjælp Automated kvantitativ analyse (AQUA), beskrevet i detaljer andetsteds [28 , 29]. TRIB1 ekspression i både cytoplasmiske og nukleare rum blev efterfølgende korreleret med andre proteiner tidligere målte i denne kohorte. TRIB1 udtryk blev også undersøgt med hensyn til patientens overlevelse, som beskrevet nedenfor.

TRIB1

og

MYC

forstærkning i CRC patient kohorte blev undersøgt ved hjælp af fluorescens

i situ

hybridisering (FISH). En MYC /CEN8p sonde blev købt fra Abnova (kat. Nr. FG0065) og TRIB1 /CEN8p sonde blev custom designet af Abnova. Proteasen behandlingstid blev varieret for at optimere fordøjelsen og sikre god kvalitet hybridisering. Visualisering blev udført ved hjælp af DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole-2-hydrochlorid (Abnova) til at farve kerner.

Klar-til-brug dual-mærkede prober til

MYC

TRIB1

blev købt fra Abnova. Den MYC /CEN8p FISH probe bestod af en ~ 160KB

MYC

sonde placeret på 8q24.12-q24.13 med en Texas Red fluorophor sammen med en ~ 520kb CEN8p sonde placeret på 8p11.21 med en FITC fluorophor. Det TRIB1 /CEN8p FISH probe bestod af en ~ 260kb

TRIB1

sonde placeret på 8q24.13 med en Texas Red fluorophor sammen med en ~ 520kb CEN8p sonde placeret på 8p11.21 med en FITC fluorophor.

Scoring blev udført af en uddannet tekniker og konsulent patolog. Glassene blev scoret med et Leica DMLB fluorescerende mikroskop ved hjælp 100X olie nedsænkning linse. De Colorado Scoring kriterier blev anvendt [ ,,,0],30] for at score de TMA lysbilleder. højst tyve kerner per kerne blev scoret i de fleste tilfælde, men i nogle tilfælde mindst ti kerner blev scoret på grund af ikke at have tyve scorable kerner. Summen af ​​de røde og grønne fluorophorer blev noteret for hver kerne, og det endelige resultat bestod af forholdet mellem den røde fluorophor til den grønne fluorophor. FISH scores mindre end 1,8 blev fortolket som negative [31].

statistiske analyser

TRIB1 protein udtryk data genereret fra AQUA-analyse blev korreleret med AKT, caspase 3, cyklin B1, ERK, Ki67, MYC, S6, PTEN, Pakt, pERK, pHistone H3, pMEK, og PS6 proteinekspression. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Pearsons korrelationer, og p-værdier blev justeret for multipel testning ved hjælp af Bonferroni korrektion. Et open source program TMA Navigator (https://www.tmanavigator.org/) blev anvendt til statistisk analyse. Survival analyse for

TRIB1

og

MYC

forstærkning i CRC kohorten blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 6.

Resultater

Single gen mutationsanalyse er utilstrækkelig til stratificering af tumorer med hensyn til terapi

efter behandling med 5-fluorouracil (5-FU) i 96 timer, viste tretten CRC cellelinier varierende grader af følsomhed, når de behandles med lægemiddelkoncentrationer i området fra 2.5μM til 100 uM ( fig 1A). To CRC cellelinjer (Colo320DM, T84) var ufølsomme over for 5-FU i en koncentration på 100 uM. IC

50 værdier for 5-FU varierede fra 3,1 til 100 pM med en median på 19.6μM. De mest følsomme cellelinjer var HT29, LS411N, og HCT116. DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, og LoVo rapporteres at være fejlparringsreparation mangelfuld [32]. Denne profil af mismatch repair status korrelerede ikke med 5-FU følsomhed (p = 0,713; Mann-Whitney U-test). I modsætning til en undersøgelse foretaget af Bracht og kolleger [33]

A. Waterfall plot for de 5-fluorouracil IC

50 (uM) værdier. B. Waterfall plot for oxaliplatin IC

50 (uM) værdier. C. Waterfall plot for BEZ235 IC

50 (NM) værdier. D. Uovervåget hierarkisk klyngedannelse for IC

50 værdier for 5-FU, L-OHP og BEZ235 hjælp Pearsons Korrelation med komplet kobling.

Selv om en række

in vitro

undersøgelser har antydet, at

TP53

mangel bidrager til resistens [34], vi kunne ikke se en forening (p = 0,238; Mann-Whitney U-test). HT29, LS411N, HCT116 p53 – /-, SW837, NCI H508, NCI H716 er alle

TP53

mangelfuld (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/), men de var stadig følsomme over for 5-FU i denne undersøgelse. Mariadason et al., Men rapporterede ingen forskel i 5-FU-induceret apoptose i mutant og vilde typen p53 cellelinjer [35].

Efter behandling med oxaliplatin (L-OHP) i 96 timer, CRC cellelinier viste varierende grader af følsomhed, når behandlet med stigende koncentrationer af L-OHP spænder over 2.5μM til 100 uM (fig 1B). IC

50 værdier for L-OHP varierede fra 3,0 til 31.1μM, med en median på 8,0 uM, hvilket viser en ti ganges område af sensitivitet. De mest følsomme cellelinjer var HT29, LS411N, og SW837, mens den mindst følsomme var Colo320DM, NCI H716, og Colo201. Ingen statistisk signifikans (p = 0,462; Mann Whitney U-test) blev observeret ved sammenligning L-OHP IC

50 værdier mellem dMMR cellelinjer og pMMR cellelinjer, hvilket er i overensstemmelse med en tilsvarende undersøgelse fra Fink et al. . [36]

Der var ingen sammenhæng mellem p53 status og L-OHP IC

50-værdier (p = 0,187; Mann Whitney U-test), i modsætning til en tidligere rapport [37]. Men en nylig undersøgelse foretaget i 51 avancerede CRC patienter konkluderede, at

TP53

mutationsstatus var ikke associeret med fordel fra første-line oxaliplatin-baserede behandling [38].

Seven CRC-cellelinjer var følsomme og otte CRC cellelinjer var ufølsomme for behandling med forskellige koncentrationer (2,5 nM og 80 nm) af BEZ235 i 96 timer (fig 1C). IC

50 værdier for BEZ235 varierede fra 13,4 til 80 nm, med de følsomme cellelinjer, der har en median følsom koncentration af 23.6nM. De mest følsomme cellelinjer var HT29, Colo201, og NCI H716, mens NCI H508, T84, SW48, SW480, Colo320DM, HCT116, HCT116 p53 – /-, og LoVo var ufølsom ved en koncentration på 80 nm. Ingen statistisk signifikant forskel blev observeret (p = 0,346; Mann-Whitney U test) mellem IC

50 værdier for BEZ235 behandling og

PIK3CA

mutante og vildtype grupper. Alle

PI3KCA

mutant cellelinjer havde enten en

BRAF

eller en

KRAS

co-mutation. Ingen COSMIC data var tilgængelige for

mTOR

mutationer i disse cellelinjer (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Serra et al. fastslået, at BEZ235 anholdt proliferation i alle 21 cancer cellelinjer, der anvendes i deres undersøgelse, uafhængig af PI3K pathway mutation status [39], og at cellelinjer med et

BRAF

eller

KRAS

mutation eller

EGFR

forstærkning var lidt mindre følsomme over for BEZ235 sammenlignet med de andre cellelinjer [39].

af de 15 CRC-cellelinjer, otte cellelinjer besad

KRAS

exon 2 mutationer . DLD-1, HCT116, HCT116 p53 – /- og LoVo cellelinjer havde en 5574 G A substitution i overensstemmelse med en G13D missense mutation; SK-CO-1 og SW480 cellelinjer havde en 5571 G T substitution i overensstemmelse med en G12V missense mutation; SW837 havde en 5570 G T substitution i overensstemmelse med en G12C mutation; og T84 havde en 5574 G A substitution i overensstemmelse med en G13D-mutation. Dette er i overensstemmelse med publicerede sekventering data og data i COSMIC database (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Der var ingen statistisk signifikante forskelle i respons til 5-FU, L-OHP, og BEZ235 med hensyn til

KRAS

mutationsstatus (p = 0,98, p = 0,60 og p = 0,17, henholdsvis).

Unsupervised hierarkisk klyngedannelse for IC

50 værdier for 5-FU, L-OHP og BEZ235 hjælp Pearsons korrelationer med komplet kobling viste, at cellelinjerne ikke klynge ifølge ethvert bestemt mutation. Der var variation i respons på de tre forskellige behandlinger (fig 1D).

kromosomområder ofte fået og mistet i colorektal cancer cellelinjer

Panelet af cellelinier blev næste evalueret af aCGH til identificere fælles kromosomale regioner af gevinst og tab. Fireogtyve regioner blev ofte opnået i mindst 7/15 CRC cellelinier. Hyppige gevinster blev observeret ved 2p, 3q, 5p, 7p, 7q, 8Q, 12p, 13q, 14q, og 17q (fig 2) (tabel 1). På den anden side, blev i alt 14 regioner tabt i mindst 7/15 CRC cellelinier (tabel 2). Hyppige tab blev observeret ved 2q, 3p, 5q, 8P, 9P, 14q, 18q, og 20p (fig 2). Disse regioner gevinst og tab lignede dem tidligere rapporteret [32, 40-44]. Vejviser

Hierarkisk gruppering af de segmenterede kopi nummer data ved hjælp af euklidiske afstand gennemsnitlige kobling resulterede i to store klynger: en klynge indeholdt NCI H716, mens den anden klynge indeholdt de andre 14 cellelinjer (Fig 3). En af de sub-klynger indeholdt HT29, SW48, LS411N, LoVo, HCT116 og HCT116p53 – /-. HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, og LoVo er næsten diploid og kendt for at have mutationer i MMR gener

MLH1

MSH2

[45, 46]. Det andet nær-diploid cellelinje, DLD-1, også grupperet separat. Denne cellelinie er MMR mangelfuld i MSH6 [47].

Differential genekspression med hensyn til narkotika følsomhed

Gener udtrykkes differentielt i forhold til 5-FU følsomhed er anført i S3 Table og afbildet i en varme kort i fig 4A. Funktionel anmærkning hjælp DAVID [24] viste, at disse gener var hovedsageligt involveret i cellecyklus (

TAF2

,

CHFR

,

CCND2

,

OSGIN2

,

TERF1

,

TBRG4

), fokal vedhæftning (

ABCB1

,

SH3KBP1

,

EBAG9

), apoptose (

SHRKBP1

,

EBAG9

,

TERF1

,

TBRG4

), og regulering af transskription (

LASS2

,

LMCD1

,

MAF1

,

TAF2

,

THAP11

,

CHURC1

,

MED14

,

PIAS3

,

PURB

,

TERF1

,

ZNF239

,

ZNF7

). Vigtige Kegg veje er forbundet med 5-FU virkningsmekanisme og efterfølgende beriget i listen stammer fra denne undersøgelse omfattede purin metabolisme (

NT5C2

,

POLR2J2

), pyrimidin metabolisme (

NT5C2

,

POLR2J2

), lægemiddelmetabolisme (

GSTO2

), ABC transportører (

ABCB1

), og oxidativ fosforylering (

NDUFA9

).

A. En Heatmap skildrer SAM analyse for gener udtrykkes forskelligt mellem 5-FU følsomme og mindre følsomme CRC-cellelinjer; B. En Heatmap afbilder SAM analyse for gener differentielt udtrykt mellem L-OHP følsomme og mindre følsomme CRC cellelinier; C. En Heatmap skildrer SAM analyse for gener udtrykkes forskelligt mellem BEZ235 følsomme og mindre følsomme CRC-cellelinjer.

Gener udtrykkes differentielt med hensyn til L-OHP følsomhed var involveret med DNA binding (

GLI2

,

GLI4

,

SETDB2

,

NFXL1

,

POLE4

,

PURA

,

TSNAX <