PLoS ONE: FoxM1 er forbundet med dårlig prognose for ikke-småcellet lungekræft Patienter gennem fremme Tumor Metastase

Abstrakt

Baggrund

FoxM1 er blevet rapporteret at være vigtig i initiering og progression af forskellige tumorer. Men om FoxM1 har nogen indikation for prognosen i ikke-småcellet lungekræft patienter fortsat uklart.

Metode /vigtigste resultater

I denne undersøgelse FoxM1 udtryk i tumorceller blev undersøgt først ved immunhistokemi i 175 NSCLC prøver, hvis resultat viste, at FoxM1 overekspression var signifikant associeret med positiv rygning status (P = 0,001), dårligere vævsdifferentiering (P = 0,0052), højere TNM stadie (P 0,0001), lymfeknudemetastase (P 0,0001), avanceret tumor stadie (P 0,0001), og dårligere prognose (P 0,0001). Multivariable analyse viste, at FoxM1 udtryk øget risiko for død (hazard ratio, 1,899; 95% CI, 1,016-3,551). Desuden ved forskellige

in vitro

og

in vivo

eksperimenter, viste vi, at målrettet knockdown af FoxM1 udtryk kunne hæmme de vandrende og invasive evner NSCLC celler, mens tvungen udtryk for FoxM1 kunne forøgede invasion og migration af NSCLC celler. Endelig fandt vi, at en af ​​de cellulære mekanismer, som FoxM1 fremmer tumor metastase er gennem fremkalde epitelial-mesenkymale overgang (EMT) program.

Konklusioner

Disse resultater antydede, at FoxM1 overekspression i tumorvæv er signifikant associeret med dårlig prognose for NSCLC patienter ved at fremme tumor metastase

Henvisning:. Xu N, Jia D, Chen W, Wang H, Liu F, Ge H, et al. (2013) FoxM1 er associeret med dårlig prognose for ikke-småcellet lungekræft Patienter gennem Fremme tumormetastaser. PLoS ONE 8 (3): e59412. doi: 10,1371 /journal.pone.0059412

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: August 18, 2012; Accepteret: 14 Feb 2013; Udgivet: 25 marts 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Shanghai Leading akademisk disciplin Project, projektnummer B115 og China National “985” projektet (fase III). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er forblevet den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan i flere år. Den dårlige prognose af lungecancer primært som følge af små symptomer på tidlig fase og når diagnosticeret, tumorceller har altid metastaseret til andre organer [1]. Epithelial-mesenchymal overgang (EMT) er betydelig i tumorcellemetastase og karakteriseret ved opløsningen af ​​intercellulære junctions gennem internalisering og nedregulering af forskellige proteiner til stede i tight junctions, såsom zonula occludens (ZO) -1, og adherensovergange, såsom E-cadherin [2], [3].

Forkhead box M1 (FoxM1), et medlem af Fox familien af ​​transkriptionelle faktorer, har vist sig at være afgørende for cellecyklusprogression og er en vigtig celle-cyklus regulator styrer overgangen fra G1 til S-fasen samt indrejse og færdiggørelse af mitose [4],. Det er blevet rapporteret at være overudtrykt i en række tumorer, herunder lunge-, lever- og brystcancer [8], [9], [10], [11], [12], [13], og spillede en væsentlig rolle i udviklingen og progressionen i forskellige maligniteter [11], [14], [15], [16]. For nylig blev FoxM1 rapporteret til at køre hepatisk fibrose og metastase i HCC [17], og det er veldokumenteret, at pindsvinet-signalvejen blev aktiveret i NSCLCs, og flere molekyler involveret i denne vej, herunder PTCH1, SMO, GLI1, blev observeret at korrelere med multiple prognostiske parametre for NSCLCs. Især blev disse molekyler også observeret at korrelere med forøget ekspression af FoxM1 [18]. Men hvorvidt FoxM1 kunne udøve en direkte effekt på prognosen for NSCLCs patienter stadig, at blive belyst. Yang og kolleger for nylig rapporteret, at FoxM1 overekspression er korreleret med ringe overlevelse af patienter, der anvender immunohistokemi analyser af 69 tilfælde af pladecellecarcinom prøver [19]. Men den prognostiske rolle FoxM1 ekspression i andre typer af NSCLCs ikke er blevet bestemt,. Liu et al. fandt, at udtrykket status FoxM1 i NSCLC er en uafhængig prognostisk faktor og negativt korreleret med prognose., men deres undersøgelse fandt ingen sammenhæng mellem FoxM1 ekspression og andre afgørende kliniske parametre [20]. I mellemtiden, alle undersøgelser ovenstående ikke vise de potentielle underliggende mekanismer. I vores tidligere undersøgelse, har vi vist, at FoxM1 forfremmet

in vitro

metastatisk evne småcellet lungecancer [21]. I den aktuelle undersøgelse, vi sigter mod at bestemme de prognostiske roller FoxM1 overekspression i NSCLCs og yderligere undersøge den mekanisme, hvormed FoxM1 kan bidrage til metastaser af NSCLCs.

Resultater

Patient Karakteristika og relationer mellem FoxM1 Expression og Clinicopathologic kendetegn

de clinicopathologic karakteristika for de patienter er opsummeret i tabel S1. De overordnede opfølgende varigheder varierede fra 1 til 84 måneder (median, 42 måneder). For at undersøge om den øgede ekspression af FoxM1 blev forbundet med forskellige prognostiske faktorer blev patienterne inddeles i to grupper med hensyn til immunhistokemisk farvning for FoxM1 (figur 1A, a-d): negativ /svag ekspression og stærkt udtryk. Som vist i tabel S2, de patienter med lymfeknudemetastaser (figur 1A, e) havde en signifikant højere ekspression af FoxM1, sammenlignet med patienter uden lymfeknudemetastaser (figur 1A, f) (P 0,0001). I mellemtiden blev stærkere FoxM1 udtryk korreleret med positiv rygning status (P = 0,001), dårligere differentiering (P = 0,0209), avanceret tumor stadie (P 0,0001) og højere stadier TNM (P 0,0001), mens der blev observeret nogen væsentlig forskel i patienternes alder, køn og histologi på tidspunktet for diagnosen mellem høje og lave niveauer af FoxM1

(a) Repræsentative resultater af FoxM1 farvning i NSCLC tumorvæv analyseret ved immunhistokemi (en negativ b., svag; c, moderat d, intens, henholdsvis). Repræsentative resultater af FoxM1 ekspressionsniveauer mellem lymfeknude positive (e) og lymfeknude negativ (f) (a-f, venstre, forstørrelse: x 100; højre, Forstørrelse: × 400). (B) Samlet overlevelse analyser for alle patienter (a), patienter med stadium I /II (b), og patienter med stadium III /IV (c) i henhold til resultaterne af immunhistokemi analyse. Af log-rank testen blev anvendt til at teste de to overlevelse distributioner. P 0,05 blev anset for at have statistisk signifikans

FoxM1 Expression positivt korreleret med Tumor Progression og ringe overlevelse af ikke-småcellet lungekræft Patienter

Først blev brugt samlet overlevelse analyse. at undersøge sammenhængen mellem FoxM1 udtryk og prognose. Prognosen for patienter med en stærk tumor udtryk for FoxM1 var markant dårligere end for patienter med negativ eller svag tumor FoxM1 udtryk (P 0,0001) (Figure1B, a). I yderligere analyser blev FoxM1 udtryk forbundet med dårligere overlevelse for patienter med stadium I /II kræft (P = 0.049) (figur 1B, b) og for patienter med stadium III /IV kræft (P = 0,095) (figur 1B, c) , selv om resultatet af fase III /IV nåede ikke betydning. En univariat analyse viste, at tumor stadie (P 0,0001), lymfeknude status (P 0,0001), TNM stadie (P 0,0001) og FoxM1 udtryk (P 0,0001), hver forudsagde en betydeligt dårligere prognose i NSCLC-patienter (tabel 1 ). Den kliniske prognose blev imidlertid ikke forbundet med alder, køn, rygning status, histologi og differentiering.

Desuden blev en Cox proportionel risiko anvendte model til at estimere effekten af ​​FoxM1 udtryk på overlevelse. Den rå hazard ratio (HR) for FoxM1 stærkt udtryk i forhold til FoxM1 negative eller svage udtryk var 1,899 (95% CI, 1,016-3,551, P 0,05), som viste, at en stærk FoxM1 status øget risiko for lungekræft dødsfald med næsten to gange så negativ eller svage FoxM1 status. Med multivariabel analyse, FoxM1 ekspression, lymfeknudemetastase og alder var signifikant forbundet med overlevelse (tabel 2). Disse resultater tyder på, at FoxM1 synes at være en uafhængig og væsentlig prædiktor for dårligere overlevelse.

Målrettet Knockdown af FoxM1 Expression Hæmmet

in vitro

metastatisk Potentialer af NSCLC Celler

de ovennævnte resultater viste, at høj FoxM1 ekspression blev associeret med dårlig prognose af NSCLC-patienter, men de underliggende mekanismer er fortsat uklare. I vores tidligere undersøgelse har vi vist, at FoxM1 kunne mediere proliferationen af ​​SCLC-cellelinier, som kan være forbundet med den avancerede tumor stadium [21]. Men roller FoxM1 udtryk i NSCLC celle migration og invasion er stort set ukendt. Således, for at finde ud af, om FoxM1 medierer prognose i lungekræft ved at fremme metastase, vi anvendte Lenti-virus transduktion til at banke ned FoxM1 udtryk på vandrende og invasive evne H1299 og PC-9-celler (figur 2A og B). Resultaterne antydede, at afbrydelsen af ​​FoxM1 udtryk i væsentlig grad kan hæmme vandrende og invasive evner NSCLC celler ved trans-brønd migration assay (figur 2C og D). Endvidere har vi også fundet, at i forskellige to cellelinier, kunne knockdown af FoxM1 ekspression signifikant at hæmme proliferation hastighed, 48 og 72 timer (figur S1A), og overekspression af FoxM1 fremmet tumor proliferation efter 72 timer i nøgne mus (fig S1B), som alle var i overensstemmelse med vores tidligere resultater.

(A, B) påvisning af lentivirus-medieret knockdown af FoxM1 i PC-9 og H1299 celler ved WB og q-PCR, hhv. (C, D) Et repræsentativt resultat af de transeuropæiske godt migration analyser for virkningerne af FoxM1 på

in vitro

vandrende og invasive evner PC-9 og H1299 celler. Resultaterne er vist som gennemsnit ± SD, *

s

. 0,05

Tvungen ekspression af FoxM1 Øget

in vitro

i vivo

Metastatisk evner NSCLC Celler

for yderligere at bevise rolle i NSCLC metastase, vi stabilt overudtrykt FoxM1 udtryk i PC-9 og H292 cellelinier (figur 3A og B). For det første ved brug af Trans-godt-analyser, viste vi, at overekspression af FoxM1 væsentlig grad kan øge vandrende og invasive potentiale NSCLC-celler (figur 3C og D). For yderligere at bekræfte rolle FoxM1 i metastase af ikke-småcellet lungekræft, udviklede vi en musemodel ved haleveneinjektion af PC-9 FoxM1 overekspression (PC-9-FoxM1) og kontrol (PC-9-vektor) celler . Fem uger efter celleinokulering blev musene aflivet for at opnå lungerne (figur 4A), og overvåges ved fluorescens billeddannelse, hvis resultater viste, at PC-9-FoxM1 celler udviste meget stærkere fluorescenssignaler i lungerne end det kontrolceller ( Figur 4B). Endvidere histologisk undersøgelse viste, at antallet af metastatiske knuder i lungerne hos FoxM1 overekspression var væsentligt højere end i kontrolgruppen (figur 4C og D). Tilsammen disse resultater understøtter den hypotese, at FoxM1 spiller en vigtig rolle i tumor metastase af NSCLC.

(A, B) Påvisning af lentivirus-medieret overekspression af FoxM1 i PC-9 og H292 celler ved WB og q-PCR hhv. (C, D) Et repræsentativt resultat af de transeuropæiske godt migration analyser for virkningerne af FoxM1 på

in vitro

vandrende og invasive evner PC-9 og H292 celler. Resultaterne er vist som gennemsnit ± SD, *

s

. 0,05

(A, B) Visuel inspektion og fluorescens billeddannelse analyse af lunge metastatiske knuder i to grupper ( PC-9-vektor og PC-9-FoxM1) i musemodeller ved haleveneinjektion af tumorceller hhv. (C) Virkningerne af

FoxM1

på

in vivo

metastatiske evner PC-9 celler i xenograftmodeller af nøgne mus (n = 6), som bestemt ved undersøgelse af mus lunger til mikroskopisk knuder. Repræsentative resultater af histologisk undersøgelse af muselunger for metastatiske knuder (venstre). Antallet af lung metastatiske noudels i to grupper af musemodeller (højre). Resultaterne er vist som gennemsnit ± SD, *

s

. 0,05

FoxM1 induceret epitel-mesenkymale overgang af NSCLC Celler og tumorvæv Prøver

Vi yderligere observeret celler med høj FoxM1 udtryk, der viste sig at have fænotypiske forandringer minder om EMT. Som vist i figur 5A, blev observeret tydelige morfologiske forskelle mellem H292-FoxM1 cellelinie og dets parentale H292-vektor cellelinje i cellekultur. Betragtninger H292 celler er polygonalt og vokse i klynger, H292-FoxM1 celler er aflange og spindel-formet, og vokse i en spredning mønster til sammenløb. For yderligere at udforske de mekanismer, der er forbundet med den øgede metastaser potentiale, vi testede nogle vigtige faktorer i forbindelse med EMT, der fremmer metastaser i carcinomer. Vi fandt, at H292-FoxM1 celler udtrykte lavere mRNA og protein niveauer af E-cadherin og ZO-1, mens opnåede højere mRNA og protein niveauer af mesenchymale markører, som vimentin og N-cadherin (figur 5B og C). Slug er en transskription repressor, som er potent inducer af EMT. Vi har observeret øget Slug udtryk i FoxM1-overekspression celler (Figur 5D). Vores observationer tyder på, at FoxM1 inducerer metastase gennem EMT

(A) Repræsentative fase-kontrast billeder af H292-vektor og H292-FoxM1 celler. (Forstørrelse: 200 ×). (B) kvantitativ real-time PCR-analyse af den relative ekspression af EMT markører som angivet. GADPH blev anvendt som indlæsning kontrol. Data er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse, *

s

. 0,05. (C) Den relative ekspression af EMT-markører, som angivet, blev bestemt ved immunblotting (venstre), og hvis resultater blev yderligere kvantificeret (højre). β-actin tjente som en loading kontrol. (D) Den relative udtryk for Slug som indikeret blev bestemt ved immunoblotting (til venstre), og hvis resultater blev yderligere kvantificeret (til højre). β-actin tjente som en belastning kontrol.

For yderligere at demonstrere forholdet mellem FoxM1 udtryk og EMT markører blev immunhistokemi farvning udført for E-cadherin, vimentin og Slug i tumorer prøver. I humane lungecancer-prøver, øget vimentin og slug ekspression og nedsat E-cadherin-ekspression blev fundet i grupperne med høj FoxM1 ekspression, mens faldet vimentin og Slug ekspression og forøget E-cadherin-ekspression i grupperne med lav FoxM1 ekspression (figur 6A) . Desuden har vi etableret subkutane solide tumorer modeller. Efter 4 ugers injektion af PC-9-FoxM1 og PC-9-vektor-celler, blev faste tumorer høstet, indlejret i paraffarin og farvet for EMT markører. Som vist i figur 6B, sammenlignet med tumorer afledt fra PC-9-vektor-celler, tumorer afledt af PC-9-FoxM1 celler afslørede forøget ekspression af vimentin og Slug og nedsat ekspression af E-cadherin (figur 6B). Vores observationer i morfologiske og molekylære ændringer tyder på, at FoxM1 overekspression inducerer en EMT-lignende fænotype gennem opregulering af Slug i NSCLC celler.

(A) Den relative ekspression af E-cadherin, vimentin og Slug som angivet blev bestemt ved immunohistokemisk farvning i humane tumorprøver med høj (ovenfor) og lav (under) FoxM1 ekspression. (B) Den relative ekspression af E-cadherin, vimentin og Slug som angivet, blev bestemt ved immunohistokemisk farvning i nøgne mus tumorer afledt af PC-9-vektor celler (ovenfor) og PC-9-FoxM1 celler (nedenfor).

diskussion

i denne undersøgelse har vi vurderet ekspressionsniveauerne af FoxM1 bruger IHC farvning i en kohorte af 175 kinesiske NSCLC patienter og første gang vist, at forhøjet udtryk for FoxM1 var korreleret med flere klinisk-patologisk faktorer og forudsagde en ugunstig prognose i NSCLC patienter, herunder SCC og AC. Desuden fandt vi, at deregulering af FoxM1 udtryk var signifikant forbundet med højere metastatisk evner gennem overtalelse EMT.

I betragtning af den rolle FoxM1 i tumorcellevækst, har nogle undersøgelser vurderet muligheden for FoxM1 udtryk som en biomarkør at forudsige det kliniske resultat af NSCLC-patienter. Yang et al fandt, at FoxM1 relateret til kliniske faktorer og spiller afgørende rolle i prognosen i 69 patienter med SCC, ikke inklusive AC. og Liu et al viser, at FoxM1 kunne være en uafhængig faktor for prognosen i 68 NSCLC patienter, herunder 37 AC og 19 SCC, men forholdet mellem FoxM1 udtryk og andre clinicoparameters blev testet med nogen sammenhæng. Disse paradoksale resultater kan på grund af deres forskellige studiepopulation, lille stikprøve og varieret kliniske data kvalitet. I vores undersøgelse fandt vi, at FoxM1 ekspression i tumorprøve var positivt forbundet med flere klinisk-patologiske parametre, såsom TNM stadie, tumor stadium og lymfeknudemetastase. Desuden blev højere FoxM1 ekspression korrelerede med en dårlig prognose af NSCLC-patienter. Disse resultater viste, at FoxM1 var relateret med NSCLC progression og prognose. Men underliggende mekanismer skal undersøges nærmere,.

Metastase involverer en række komplekse trin [22], herunder reduceret friktion, øget motilitet, cellevedhæftning, opløsning matrix, og migration [23]. Under tumorprogression, kræftceller undergår dramatiske ændringer i cytoskeletorganisation at vedtage invasiv fænotype og i sidste ende metastaserer til andre organer. EMT er en vigtig proces i tumormetastase [24], [25], [26], som er forbundet med reduceret celleoverfladeekspression af E-cadherin, øgede N-cadherin [27], [28] og ændret ekspression af flere cyto -skeletal proteiner, der spiller en væsentlig rolle for den vandrende aktivitet af tumorcellerne [29].

Vores data viste, at inhibering af FoxM1 kunne undertrykke den metastatiske evne, mens opreguleret ekspression niveau af FoxM1 i lungekræft celler forbedret de vandrende og invasive egenskaber in vitro og in vivo. Niveauer af E-cadherin, ZO-1 var forhøjet og vimentin, N-cadherin reduceres med højere FoxM1 ekspression. Også FoxM1 reguleret Slug ekspression, som er den inducer af EMT. Disse resultater antydede, at FoxM1 var forbundet med prognosen ved at fremme metastase af tumorceller gennem induktion EMT. Hyun JP et al. også vist, at i HCC, kunne FoxM1 aktivere Akt-Snail1 vej og inddrage i EMT overgang [17]. Desuden er der nogle andre undersøgelser viste, at MMP’er er dukket op som centrale faktorer i både lokale vækst og fjernmetastaser i tumorer [30], [31], og FoxM1 kunne også regulere MMP’er at fremme OSCLC metastaser. Tilsammen kan FoxM1 spille flere væsentlige funktioner i tumorceller. Dens komplette rolle i sti om metastaser worths yderligere undersøgelse.

Sammenfattende vores resultater tyder på, at FoxM1 opregulering kan have effekt på NSCLC prognose og progression. Vi viste, at FoxM1 overekspression var relateret til reduceret samlet overlevelse og hurtig tumor progression i NSCLC patienter. Desuden kunne overekspression af FoxM1 øge vandrende og invasive evner NSCLC celler. Disse resultater tyder på, at FoxM1 udtryk er kritisk for invasiv af maligne NSCLC celler, og denne virkning var mindst, dels gennem epithelial- mechenmychal overgang. Derfor er vores observation gør FoxM1 et attraktivt mål for lungekræft terapi, og kunne bruges som en biomarkør til forudsigelse prognose.

Materialer og metoder

Etik Statement

Menneskelige deltagere involveret i denne forskning, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Medicinsk etik og menneskelige Clinical Trial udvalg på Zhongshan Sygehus, Fudan University har godkendt denne undersøgelse samt godkendelsesproceduren (Permit nummer: 2011-221). Alle dyr protokoller blev godkendt af Etisk Udvalg om dyreforsøg fra University of Fudan Animal Care udvalg, Shanghai, Kina (Permit Nummer: SYXK: 2008-0039). blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Patienter og tumorprøver

I alt 232 histologisk bekræftede NSCLC patienter blev konsekutivt rekrutteret fra januar 2005 og februar 2008 for behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) på Zhongshan Sygehus, Fudan University. Fire patienter blev ekskluderet, hvis de tidligere har fået strålebehandling og /eller kemoterapi. Bryst X-ray og computertomografi blev gennemført for alle patienter før operation. Der er 142 patienter gennemgik helbredende kirurgisk resektion. Kemoterapi med en cisplatin-baseret ordning blev anvendt til de fleste patienter med høj stadie (herunder IIIB og IV) eller med høj risiko for tilbagefald og metastaser i henhold til den vejledende behandling for NSCLC på den kirurgiske tid. Til denne undersøgelse blev 53 patienter ekskluderet fra analyse, herunder 38 patienter med dårlig kvalitet og /eller mængden af ​​vævsprøver, 11 patienter med ufuldstændige kliniske data og 4 patienter døde af andre årsager oprindeligt blev udelukket fra vores analyse. Endelig blev i alt 175 patienter inkluderet i denne undersøgelse (tabel S1). I alt 122 mænd og 53 kvinder blev inkluderet, inklusive 97 rygere og 78 ikke-rygere, med aldre spænder fra 30 til 77 år, hvoraf 89 var mindre end 55 år. Der var 76 trin I, 23 fase II, 51 fase III og 25 etape IV sygdomme, herunder 91 patienter uden nodal metastase og 84patients med lymfeknude metastaser. Der var 36 patienter med tumor af etape 1, 75 med trin 2, 25 med stadie 3 og 39 med trin 4 og 118 patienter med adenocarcinom (AC), mens 57 med planocellulært karcinom (SCC). Med hensyn til differentiering, der var 93 patienter med godt og moderat differentiering og 82 med dårligt differentiering. I alt 74 patienter var i live ved slutningen af ​​opfølgningen, 101 patienter døde af lungekræft, og patienterne døde af andre årsager eller tabte til opfølgning blev udelukket fra undersøgelsen.

klinisk-patologisk information til hver patient, herunder køn, alder, rygning status, tumor stadie, nodal status, TNM stadie, histologisk klasse og samlet overlevelse, blev opnået med tilbagevirkende kraft fra kliniske journaler og patologiske rapporter. Overlevelse tid blev defineret som varigheden fra tidspunktet for diagnosen til dødsdagen eller slutningen af ​​opfølgningen. Den TNM status blev bestemt ifølge den 7. udgave staging system til NSCLC [32].

Immunohischemistry Assay

Et antistof mod FoxM1 (Sigma Aldrich Inc., MO, USA) og en standard immunhistokemisk teknik blev anvendt til påvisning FoxM1 ekspression som beskrevet tidligere [19], [20]. FoxM1 blev observeret i cytoplasmatisk eller cytoplasmatisk og nuklear af cellerne. Farvning blev vurderet i fem kraftige felter på 200 × forstørrelse. Farvningen score blev kategoriseret i fire grupper som negativ = 0, svag = 1, moderat = 2 og intens = 3 [20]. Procentdelen område farves positive blev kategoriseret i fire grupper: mindre end 25% tumorceller positive = 0; 25% til 50% tumorceller positive = 1; 50% til 75% tumorceller positive = 2; mere end 75% tumorceller positive = 3. Mærkning score blev bestemt ved at gange intensitet score med den procentsats område farvede positiv, hvilket scores som 0, 1, 2, 3, 4, 6 og 9.Faellesskabet farvning point er kategoriseret i to grupper så svag /negativ farvning (score 4) og stærk farvning (score ≥4). Denne grænse blev bestemt ved visuelt at bestemme en klar positiv plet understøttes af histogrammer af rækken af ​​scoringer [20], [33], [34]. Den højeste score mærkning blandt de tre vævssnit blev indtastet for statistiske analyser. De patologer, der udførte den immunhistokemiske vurdering af FoxM1 blev blindet for patienternes histopatologiske og opfølgende data.

Epidemiologiske og kliniske Dataindsamling

Patienternes demografiske parametre og rygevaner blev opnået igennem i -person interview på tidspunktet for første besøg, opfølgning i klinikker eller medicinsk diagram revision. En person, der røget mere end 100 cigaretter i historien blev defineret som en stadig ryger, ellers som en aldrig ryger [35]. Opfølgning oplysninger om patientens død og overlevelse blev opdateret ved 3-måneders intervaller gennem onsite interview, direkte kald, eller medicinsk diagram revision. Den seneste opfølgning i denne undersøgelse blev udført på maj 2012.

cellelinier, Cell Culture og kemoterapeutiske reagenser

Den menneskelige lunge adenocarcinom cellelinie PC-9 og human lungecancer-cellelinje NCI-H292, NCI-H1299 blev alle opnået fra Cellular Institute of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) [36]. Disse celler blev dyrket ved 37 ° C under en 5% CO2 atmosfære i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone Inc., UT, USA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellerne blev regelmæssigt som fri for Mycoplasma forurening certificeret.

shRNA Eksperimenter

Lenti-virus shRNA vektor blev konstrueret som tidligere beskrevet [37]. Kort fortalt blev FoxM1 og negativ kontrol shRNA subklonet ind i MluI /Clal-stederne af en pLVTHM vektor (Addgene) med følgende oligonukleotider henholdsvis: 5′-CGCGTCGGCCGGAACATGACCATC AATTCAAGAGATTGATGGTCATGTTCCGGCTTTTTTCCAT-3’and 5′-CGATGGAAAAAAGCCGGAACATGACCATCAATCTCTTGAATTGATGGTCATGTTCCGGCCGA-3’for FoxM1, og 5′ -CGCGTCGGT AGCGACTAAACACATCAATTCAAGAGATTGATGTGTTTAGTCGCTACTTTTTTCCAT-3’and 5′-CGATGGAAAAAAGTAGCGACTAAAC ACATCAATCTCTTGAATTGATGTGTTTAGTCGCTACCGA-3’for den negative kontrol. Lenti-virus generation og infektion af H1299 og PC-9-celler blev udført som beskrevet ovenfor.

Transduktion af tumorceller

Plasmid (EX-Z5438-LV135) og Lenti-Pac ™ HIV Expression Emballage Kit blev købt fra Gene Copoeia Inc. (Gene Copoeia Inc., Guangzhou, Kina) Transduktioner af H292 og PC-9 celler blev udført i henhold til vejledningen leveret af fremstiller. Stabile transfektanter blev yderligere bekræftet ved RT-PCR og immunoblotting på grundlag af deres FoxM1 ekspression.

tumorcellemigration og invasion assays Salg

Analyser til måling tumorcellemigration blev udført i en modificeret Boyden kammer (Transwell, Corning Costar, MA, USA) indeholdende en gelatine-coatede polycarbonat membranfilter (8 um porestørrelse). Bio-Coat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), som genopretter basal membran, blev anvendt til at vurdere celleinvasion. Graden af ​​tumor celle migration og invasion blev evalueret i henhold til tidligere protokoller [38]. Ikke-migrerede celler blev fjernet fra den øvre side af membranen ved at skrubbe. Celletælling blev udført ved Coomassie blue-farvning, og celler blev visualiseret under et mikroskop (Leica Inc., Solms, Tyskland) efterfølgende.

dyreforsøg Salg

fire- til fem uger gamle BALB /CA nøgne mus (købt fra Shanghai Institute of Material Medicine, Chinese Academy of Science, Shanghai, Kina) blev opretholdt under specifikke patogenfrie (SPF) betingelser. Den anvendte metode er den samme som den, der tidligere er beskrevet for generering brystkræft model [39]. PC-9-FoxM1 celler (2 x 10

6 pr mus) stabilt udtrykker FoxM1 eller vektor blev injiceret i halevenen af ​​nøgne mus (n = 6). Fem uger senere blev musene aflivet, og lungerne blev fjernet. Derefter blev disse lungerne bearbejdes til histologisk undersøgelse og overvåges for potentielle lunge tumormetastaser efter fluorescensafbildning [40]. Metastatiske læsioner blev identificeret ved fluorescens signaler (Night Owl LB 981

In Vivo

Imaging System, Berthold, Tyskland) og analyseret af WinLight32 software. Til histologisk analyse blev lungerne høstet ved obduktion og fikseret i 10% formalin. De fikserede prøver blev derefter indlejret i paraffin, og blev opnået tre ikke-sekventielle serielle snit per dyr. Snittene blev farvet med H Multivariable analyse blev udført med Cox proportionel risiko regressions model til at undersøge den uafhængige prognostiske effekt af FoxM1 på overlevelse ved at justere for forstyrrende faktorer. En P-værdi 0,05 blev anset for at være signifikant i alle analyser. SPSS 17.0 blev brugt til at gøre de statistiske analyser i dette papir.

Støtte Information

Figur S1. Salg Effekter af ændret FoxM1 udtryk på spredning sats

in vitro

in vivo

. (A) spredning på FoxM1 af SPC-A-1 sh-FoxM1 (til venstre) og H1299 sh-FoxM1 (højre) celler. FoxM1 ekspression blev først stabilt bankede-down af Lenti-virusinfektion i SPC-A-1 og H1299-celler. Proliferationshastigheder af celler i grupperne transficeret med shRNAs mod FoxM1 (sh-FoxM1) (rød linje) faldt betydeligt i sammenligning med shRNA-targeting negativ kontrol (sh-NC) (blå linie). Data er udtrykt som middelværdi ± SD. (B) Proliferation rate af tumorer afledt af PC-9-FoxM1cells in vivo. PC-9-vektor og PC-9-FoxM1 celler blev subkutant injiceret i nøgne mus. Tumoren diameter blev målt ved de angivne tidspunkter. Proliferation rate af tumorer afledt af PC-9-FoxM1 celler (blå linje) steg betydeligt i forhold til, at der fra PC-9-vektor-celler (rød linje). Data er udtrykt som middelværdi ± SD

doi:. 10,1371 /journal.pone.0059412.s001

(JPG)

tabel S1. .

Karakteristik af patienter med ikke-småcellet lungekræft

doi: 10,1371 /journal.pone.0059412.s002

(DOCX)

tabel S2.

Klinisk profil og sammenhæng mellem de klinisk-patologiske træk og udtryk af FoxM1

doi:. 10,1371 /journal.pone.0059412.s003

(DOCX)

Tak

Vi takke Dr. Qun Wang (Department of thoracology, Zhongshan Hospital) for at hjælpe os med opfølgningen af ​​patienterne og Dr. Deming Han (Institut for patologi, Zhongshan Hospital) for at hjælpe med at indsamle prøver af ikke-småcellet lungekræft.