PLoS ONE: High Throughput Forespørgsel somatiske mutationer i High Grade serøs Kræft i Ovary

Abstrakt

Baggrund

epitelovariecancer er den mest dødbringende af alle gynækologiske maligniteter, og høj kvalitet serøs ovariecancer (HGSC) er den mest almindelige undertype af ovariecancer. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme hyppigheden og typer af punkt somatiske mutationer i HGSC ved hjælp af en mutation afsløring protokol kaldet OncoMap der beskæftiger massespektrometrisk-baserede genotypebestemmelse teknologi.

Metode /vigtigste resultater

center for Cancer Genome Discovery (CCGD) Program på Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) har tilpasset en high-throughput genotypning platform til at bestemme mutationen status af et stort panel af kendte cancer gener. Mutationen påvisning protokol, betegnet OncoMap er udvidet til at detektere mere end 1000 mutationer i 112 onkogener i formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) vævsprøver. Vi udførte OncoMap på et sæt af 203 FFPE avancerede iscenesat HGSC prøver. Vi isoleret genomisk DNA fra disse prøver, og efter et batteri af kvalitetssikring tests, løb hver af disse prøver på OncoMap v3 platform. 56% (113/203) tumorprøver nærede kandidat mutationer. Sixty-fem prøver havde enkelte mutationer (32%), mens de resterende prøver havde ≥2 mutationer (24%). 196 kandidat mutation opkald blev foretaget i 50 gener. De mest almindelige somatiske onkogen mutationer blev fundet i

EGFR

,

KRAS, PDGRFα, KIT, og PIK3CA

. Andre mutationer fundet i yderligere gener blev fundet ved lavere frekvenser ( 3%).

Konklusioner /Signifikans

Sequenom analyse under anvendelse OncoMap på DNA ekstraheret fra FFPE ovariecancer prøver er mulig og fører til påvisning af potentielt druggable mutationer. Screening HGSC for somatiske mutationer i onkogener kan føre til yderligere terapier for denne patientgruppe

Henvisning:. Matulonis UA, Hirsch M, Palescandolo E, Kim E, Liu J, van Hummelen P, et al. (2011) High Throughput Afhøring af somatiske mutationer i High Grade serøs kræft i æggestokkene. PLoS ONE 6 (9): e24433. doi: 10,1371 /journal.pone.0024433

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA

Modtaget: August 2, 2011; Accepteret: August 9, 2011; Udgivet: 8 September, 2011

Copyright: © 2011 Matulonis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var fra følgende kilder: Kræft i æggestokkene Specialized Program for Forskning Excellence (P50CA105009), Madeline Franchi kræft i æggestokkene Fund, og Kvindernes Executive Rådet for Dana-Farber Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Drs. Hahn og Drapkin både tjener som konsulenter for og har modtaget forskningsmidler fra Novartis Pharmaceuticals. Dette ændrede ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. De andre forfattere har nogen interessekonflikter at rapportere.

Introduktion

epitelovariecancer er den mest dødbringende af alle de gynækologiske maligniteter, og er behov for nye behandlinger for både nydiagnosticerede patienter samt som patienter med tilbagevendende kræft [1]. Inden epitelial ovariecancer, HGSC er den mest almindelige undertype og er forbundet med indledende kemoterapi reaktionsevne, når først diagnosticeret. Men de fleste kræftformer gentage sig og bliver mere og mere kemoterapi resistente. Succesen med konventionel kemoterapi til behandling af kræft i æggestokkene har nået et plateau, og nye midler til molekylært og genetisk karakterisering af kræft i æggestokkene for at “personliggøre” og forbedre behandlingen er nødvendig [2], [3].

Aktivering punktmutationer i proto-onkogener er blevet observeret i mange humane cancere, og sådanne mutationer kan give ‘onkogen afhængighed «af de relevante cancerceller [4]. Denne onkogen afhængighed giver grundlag for at målrette aktiverede onkogener i behandling som eksemplificeret af succesen med imatinib og erlotinib i kræftsygdomme, som havnen

BCL-ABL

EGFR

ændringer hhv. Rigelige beviser indikerer nu, at disse gain-of-funktion mutationer ikke forekommer tilfældigt i onkogener, men i stedet, mutationer påvirker et relativt lille antal codon tegner sig for det overvældende flertal af aktivering begivenheder i kræft. For eksempel enlige baseændringer ved codon 12, 13 og 61 i

KRAS

mutationer omfatter størstedelen af ​​aktiverende onkogene mutationer [5]. Tilsvarende

BRAF

mutationer påvirker codon 600 udgør 90% af melanom

BRAF

mutationer; genetiske ændringer i yderligere 10-12 codon tegner sig for de fleste af de resterende cancer-associerede

BRAF

mutationer identificeret til dato [6], [7].

For at identificere disse onkogene mutationer i arkivering væv, har vi tilpasset en high-throughput genotyping platform for at bestemme mutationen status af et stort panel af kendte kræft onkogener [8], [9]. Konkret har vi udviklet en mutation afsløring protokol, betegnes OncoMap, som beskæftiger massespektrometrisk-baserede genotypebestemmelse teknologi (Sequenom) for at identificere onkogene mutationer. Den aktuelle version af denne protokol er i stand til at opdage mere end 1000 mutationer i 112 almindeligt muterede gener i både friske frosne og paraffinindstøbte vævsprøver. Denne rapport beskriver vores vellykket anvendelse af OncoMap til en kohorte af patienter med fremskreden HGSC for at identificere onkogene mutationer.

Resultater

I den indledende OncoMap analyse, 56% (113/203) tumor prøver nærede kandidat onkogene mutationer. Sixty-fem prøver havde enkelte mutationer (32%), mens resten havde ≥2 mutationer (24%). I alt blev 196 kandidat mutation opkald foretaget i 50 gener.

De hyppigst muterede onkogener var

EGFR Hotel (9,4%),

KRAS Hotel (4,5%),

PDGFRα Hotel (4,5%),

KIT

(3,0%), og

PIK3CA Hotel (3%); andre, der var mindre almindeligt muterede inkluderet:

BRAF

(1%),

CUBN Hotel (0,5%),

og de nationale tilsynsmyndigheder

(2,5%). Vi identificerede også mutationer i mange andre gener ved lavere frekvenser, herunder:

ABL1 Hotel (2,5%),

STK11

(2,5%),

EPHA1 Hotel (2%),

RET

(1,5%),

SMARCB1 Hotel (1,5%),

ATM Hotel (1%),

FLT3

(1%),

MLL3 Hotel (1%),

MYC Hotel (1%),

NF2

(1%),

NOTCH1

(1%),

NTRK1

(1%),

PIK3R1 Hotel (1%),

ROBO2

(1%),

APC Hotel (0,5%),

FES

(0,5%),

FYN

(0,5%),

GATA1

(0,5%),

NF1 Hotel (0,5%),

NTRK3

(0,5 %),

PALB2

(0,5%),

PKHD1 Hotel (0,5%),

PTEN Hotel (0,5%),

RUNX1

(0,5%) ,

SMO

(0,5%),

SPTAN1 Hotel (0,5%), og

TSHr Hotel (0,5%).

Den mest almindelige somatiske mutation identificeret involverede tumorsuppressorgenet

TP53

, som blev påvist i 24,8% af prøverne. Da OncoMap forespørger kun en delmængde af

TP53

mutationer og registrerer ikke sletning begivenheder, den observerede hyppighed af

TP53

ændringer enig med seneste arbejde fra The Cancer Genome Atlas Project (TCGA) [10] der har bekræftet den konstatering, at

TP53

mutationer er den mest almindelige somatiske mutation i HGSC kræftformer. Desuden har vi identificeret mutationer i andre tumorsuppressorgener herunder

RB1 ​​Hotel (3%) og

VHL

(3,5%).

Somatiske mutationer blev derefter godkendt af HME, og de efterfølgende blev valideret:

EGFR

,

HRAS

,

KRAS

,

NTM

,

PIK3CA

,

BRAF

,

RB1 ​​

,

TP53

,

ATM

,

CUBN

, og

FLNB

. Tabel S1 viser de validerede mutationer findes i vores kohorte af HGSC.

Diskussion

Vores gruppe har vist, at der kan påvises somatiske onkogen mutationer i HGSC bruger en Sequenom baseret assay kaldet OncoMap som bruger DNA afledt fra FFPE væv. Selvom HGSC er kendetegnet ved genkopital ændringer [11], lavfrekvente mutationer i en række onkogene gener blev fundet i 56% af cancere i vores 203 prøve kohorte, og mange af disse mutationer er potentielt druggable anvende nye biologiske lægemidler. De fleste mutationer blev fundet i lav frekvens, og mest specifikke mutationer blev fundet i færre end 5% af prøverne. Validering ved hjælp HME blev udført på gener af interesse, og flere vigtige gener viste sig at være muteret; alle mutationer blev ikke valideret på grund af omkostningerne og niveau. I klinisk praksis, forventer vi, at alle mutationer identificeret ved OncoMap profilering vil blive valideret i CLIA-godkendte laboratorier.

Således OncoMap som bruger Sequenom teknologi er i stand til billigt screene for multiple mutationer ved hjælp af DNA ekstraheret fra FFPE prøver cancere, såsom HGSC der har flere mutationer til stede i lav frekvens. Andre fordele ved OncoMap omfatter evnen til hurtigt at udvide “hotspot” mutation biblioteket som yderligere mutationer opdages og nye hidtil ukendte biologiske midler er testet med succes. Begrænsninger ved OncoMap indbefatter at kun “hotspot” mutationer er placeret, og at validering af mutationer er nødvendig; andre mutationer ikke indgår i OncoMap panelet vil blive savnet. Selvom hele exome eller hele genomet sekventering er nu muligt i forskningslaboratorier, den rutinemæssige brug af disse teknologier i paraffin indlejrede prøver er ikke mulig. Således OncoMap giver en hurtig, rimelig pris metode til at identificere onkogene mutationer i humane cancer prøver.

De kliniske implikationer af somatiske mutationer i HGSC er ukendte og skal undersøges nærmere. Somatiske mutationer i cancere kan føre til konstitutiv aktivering af signalveje, der normalt aktiveres af aktiverede vækstfaktorreceptorer, og disse mutationer kan føre til samlet genomisk ustabilitet [12]. Ændringer i genkopital og genekspression har begge vist sig at være vigtig i ovariecancer, mens mutationer er blevet anset for at være mindre vigtig [11].

Adskillige muterede onkogener af interesse blev fundet i vores kohorte af HGSC prøver testet og analyseret med OncoMap.

EGFR

fandtes at havnen mutationer i tæt på 10% af tilfældene, og EGFR-hæmmere såsom erlotinib kunne testes i denne delmængde af kræft. I lungekræft, er disse inhibitorer anvendes til behandling af cancere, som skjuler exon 20 varianter, codon 719 varianter og L858R substitutioner som supplement til andre typer af

EGFR

mutationer [13], [14]. Vi identificerede HGSC med en codon 719 variant, som blev godkendt af HME. Således test af EGFR-hæmmere synes berettiget, når der registreres EGFR mutationer. EGFR inhibitorer er blevet testet i ovariecancer med responsrater på 10% eller derunder [15] – [17]; men ingen af ​​disse undersøgelser prospektivt testet ovariecancer for EGFR-mutationer, en praksis, der nu rutinemæssigt gjort for ikke-småcellet lungekræft, som har resulteret i molekylært målrettet anvendelse af EGFR-hæmmere.

EGFR

mutationer og udtryk blev testet for med tilbagevirkende kraft i Schilder et al, og en delvis respons blev observeret i en patient, som havde en EGFR-mutation [17].

Vores sats af

PIK3CA

mutationer af 3% findes i HGSC paralleller som fundet af Sanger center [18]. Andre grupper har rapporteret lave både

AKT

og

PIK3CA

mutationer, men højere frekvens af genamplifikation for

PIK3CA

[19]. Hæmmere af PI3kinase pathway øjeblikket undersøgt i kræft i æggestokkene, og aktiviteten af ​​disse midler er blevet rapporteret i ovariecancer [20], [21]. For eksempel, MK2206, en AKT-inhibitor, blev testet i et fase 1 studie med patienter med fremskredne solide tumorer. Alle 3 ovariecancer patienter, som indgik i denne undersøgelse viste en nedgang i deres CA125-niveauer, hvilket tyder antitumoraktivitet af MK-2206 i ovariecancer. GDC0941, en PI3kinase inhibitor, har også vist aktivitet i kræft i æggestokkene specielt i situationer med

PIK3CA

forstærkning. Med udviklingen af ​​yderligere hæmmere af PI3kinase vej og på grund af anti-cancer aktivitet af disse midler i kræft i æggestokkene, vil identifikation af afvigelser af denne vej blive stadig vigtigere i HGSC.

Andre validerede gener af interesse findes i vores undersøgelse omfatter

BRAF

,

KRAS

,

HRAS

, og

NTM

, og alle disse gener har tilgængelige biologiske midler, der kunne målrette virkningerne af disse onkogene mutationer.

TP53

mutationer findes almindeligt i ovariecancer [22], og vores data støtter og paralleller denne data

Dette arbejde bekræfter de nyligt offentliggjorte TCGA oplysninger [10].; fremtidige undersøgelser vil være nødvendigt at korrelere tilstedeværelsen af ​​disse mutationer med biologisk aktivitet og prognose af kræft, og om disse mutationer forudsige anti-cancer aktivitet af målrettede biologiske lægemidler. Desuden vil korrelere somatiske mutationer med andre objektive vurderinger af den genetiske fyldes op af cancere, såsom genekspression profilering og genkopital være afgørende at forstå en mere komplet genetisk billede af HGSC.

Materialer og metoder

Patienter og patienternes prøver

Patologi optegnelser blev revideret mellem 1999 og 2004 fra afdelingen for Gynecologic Patologi på Brigham and Women ‘s Hospital i Boston MA, og International Federation of Gynækologi og obstetrik (FIGO) fase III eller IV HGSC ovariecancer sager blev udvalgt. Dana-Farber /Harvard Cancer Center Institutional Review Board (IRB) meddelt godkendelse til at indsamle FFPE prøver. Fordi alle af prøverne blev de-identificeret, IRB givet os en dispensation til at indsamle prøver uden patientens samtykke.

FFPE prøver blev gennemgået af en gynækologisk onkologi patolog (MH), som revideret patologi rapporter samt FFPE væv blokke og udvalgt de områder i højeste procentdel af kræft, der i sidste ende blev kernehus til DNA-ekstraktion. Patienter med kendt BRCA germline mutationer blev udelukket i dette sæt, og er ved at blive undersøgt i et andet datasæt. I alt 203 prøver blev udvalgt.

DNA ekstraktion og kvantificering

Genomisk DNA blev ekstraheret fra de udkernede FFPE vævsprøver fra patienter med QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. Kort beskrevet blev kerner deparaffiniseret i xylen og yderligere lyseret i denaturerende lysebuffer indeholdende proteinase K. Vævet Lysatet blev inkuberet ved 90 ° C for at vende formalin tværbinding. Brug af QiaCube blev lysatet påført på DNA-bindende søjle, og søjlen blev vasket serielt, og derefter elueres i 30 ul destilleret vand. Genomisk DNA blev kvantificeret ved anvendelse Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen) ifølge producentens protokol. 250 ng genomisk DNA blev anvendt til analysen.

OncoMap v3.0 blev udført på alle prøver, og generne og antal testede i denne version af OncoMap udgave mutationer er anført i tabel 1. Indledningsvis, primere blev udformet som muliggør mutationspåvisning. Tumorafledte genomisk DNA blev underkastet hele genomet amplifikation. Dernæst blev multiplex PCR udført på tumor genomisk DNA til at forstærke regioner huser loci af interesse, eller ‘forespørgsel’ nukleotider. Efter denaturering blev PCR-produkter inkuberes med oligonukleotider som annealer i umiddelbar nærhed af forespørgslen nukleotid, og et primerforlængelsesprodukt Reaktionen blev udført i nærvær af kædeterminerende di-deoxynukleotider, der genererer allelspecifikke DNA-produkter. Primerforlængelsesprodukter blev spottet på en specielt designet chip og analyseret ved MALDI-TOF-massespektrometri til bestemmelse af mutation status. Da allel (eller mutation) kald udelukkende afhænger af massen af ​​den resulterende primerforlængelsesprodukt, har Sequenom assayet ikke kræver dyrt fluorescens primer mærkning og har en meget lav fejlprocent. Omkostningerne ved udelukkende kører OncoMap mutationel assay er ca $ 200 per prøve uafhængig af antallet af prøver køres.

Når mutationer blev identificeret, blev validering udført på en udvalgt delmængde af mutationer ved hjælp af multi-basen HME extension kemi som beskrevet tidligere [8], [9]. Primere og prober blev designet ved hjælp Sequenom MassARRAY Assay Design 3.0 software, anvender standard multi-basen forlængelse parametre, men med følgende ændringer: maksimale input multiplex niveau justeres til 6; maksimal pass iteration basen justeret til 200.

Støtte oplysninger

tabel S1.

validerede Mutationer af HME. Denne tabel viser de validerede mutationer findes i vores kohorte af HGSC. Validering blev udført af HME

doi:. 10,1371 /journal.pone.0024433.s001

(DOC)

Tak

Forfatterne vil gerne anerkende Robert T. Jones, Christina K. Go, og Christine A. Roden for deres arbejde med de tekniske aspekter af at køre OncoMap på disse prøver.