PLoS ONE: En ny Imaging Platform til visualisering biologiske virkninger af ikke-invasiv Radiofrekvens Electric-Field Cancer Hyperthermi

Abstrakt

Heri præsenterer vi en ny imaging platform til at studere de biologiske virkninger af ikke-invasiv radiofrekvens (RF) elektrisk felt kræft hypertermi. Dette system giver mulighed for

realtid in vivo

intravital mikroskopi (IVM) billeddannelse af radiofrekvens-induceret biologiske ændringer, såsom ændringer i fartøjets struktur og narkotika perfusion. Vores resultater viser, at IVM systemet kan håndtere udsættelse for high-power elektriske felter uden nævneværdig beskadigelse af hardware eller billeddannende artefakter. Desuden korte varigheder af energibesparende ( 200 W) radiofrekvens eksponering øget transport og perfusion af fluorescerende sporstoffer ind i tumorer ved temperaturer under 41 ° C. Fartøjets deformationer og blodkoagulation sås for tumor temperaturer omkring 44 ° C. Disse resultater fremhæver brugen af ​​vores integrerede IVM-RF imaging platform som et kraftfuldt nyt redskab til at visualisere den dynamik og samspil mellem radiofrekvens energi og biologiske væv, organer, og tumorer

Henvisning:. Corr SJ, Shamsudeen S, Vergara LA, Ho JC-S, Ware MJ, Keshishian V, et al. (2015) En ny Imaging Platform til visualisering biologiske effekter af ikke-invasiv Radiofrekvens Electric-Field Cancer hypertermi. PLoS ONE 10 (8): e0136382. doi: 10,1371 /journal.pone.0136382

Redaktør: Arrate Muñoz-Barrutia, Universidad Carlos III de Madrid; Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañon, SPANIEN

Modtaget: Juni 3, 2014, Accepteret: August 3, 2015; Udgivet: 26 August, 2015

Copyright: © 2015 Corr et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af NIH Physical Science i Oncology Program (U54CA143837), NIH MD Anderson Cancer center Support Tilskud (CA016672), The Welch Foundation (C-0627, 616 LJW), en ubegrænset forskningsbevilling fra Kanzius 617 Research Foundation (SAC, Erie, PA), og National center for Fremme Translationelle Sciences i National Institutes of Health under Award Numbers TL1TR000369 og UL1TR000371. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Interaktioner af højfrekvente radiobølger (13.56 MHz) med væv og nanomaterialer i biologiske væv i øjeblikket ved at blive undersøgt som en terapeutisk platform for ikke-invasiv cancer hypertermi terapi. De unikke dielektriske egenskaber cancervæv favorisere radiofrekvens (RF) energi absorption og omdannelse til varme og antages fremskyndes yderligere ved brug af RF-energiabsorberende nanomaterialer såsom guld nanopartikler og single-walled carbon nanorør. Forbedret tumor opvarmning skyldes større dielektriske tab inden tumorvæv sammenlignet med normale væv [1], og har fundet anvendelser i klinisk [2] hypertermi. Meget arbejde er blevet fokuseret på at måle og fortolke temperaturfordelingen [3] og dielektriske egenskaber af forskellige sunde og kræft dyrevæv tværs radio- og mikro-bølge frekvenser [4-6]. Sammenlignet med andre nano-baserede fototermisk hypertermi nærmer RF terapi har den fordel større væv indtrængningsdybder (~ 5-30 cm), hvilket skyldes de relativt lange RF bølgelængder (~ 22 m ved 13,56 MHz), når der sammenlignes med undergrunden millimeter penetration dybder af infrarøde (IR) og nær-infrarødt (NIR) lys.

I et forsøg på at øge forskellen-opvarmning satser og RF-induceret kræft cytotoksicitet, flere undersøgelser har vist, varme- egenskaber [7- 12]; biologisk toxicitet [13-20]; elektriske interaktioner [11, 21-24]; og mulighederne for nanomateriale interaktioner med RF-energi, og deres anvendelse som en potentiel medicinsk hypertermi adjuvans. På trods af den fortsatte udvikling af de forskellige roller, som nanomaterialer spille i lokal varmeudvikling og cytotoksicitet, både inden for forenklede vandige opløsninger og biologiske materialer, er meget arbejde er nået til at forstå den grundlæggende videnskab bag RF interaktioner med biologisk væv med potentiale for synergi at eksistere med klinisk godkendte kemoterapeutiske midler, såsom Abraxane, cetuximab, og gemcitabin [25]. De refererede anmeldelse artikler af Collins

et al

. og Liu

et al

. tilbyder en omfattende og præcist overblik over feltet [26, 27].

Et middel til direkte at visualisere samspillet mellem biologiske væv og RF elektriske felter, så indsigt i de grundlæggende processer og grundlæggende videnskab bag denne terapi, har været savnet. Som i endnu har der ikke været designet til at opfange disse dynamiske begivenheder, især på grund af vanskeligheden med at integrere en kraftig elektrisk felt generator i forskellige billeddannende modaliteter. Heri præsenterer vi en integrativ system, der kombinerer RF-eksponering med høj opløsning intravital mikroskopi (IVM) (RF-IVM) for at tillade

realtid in vivo

fluorescerende billeddannelse af RF-inducerede biologiske effekter. IVM anvendelse konfokal og eller multifotonexcitation teknologi, er en kraftfuld teknik til billeddannelse levende dyr ved høj opløsning med evnen til at nå væv dybder på flere hundrede mikrometer. Med denne teknik, undersøgere kan evaluere væv og cellulære reaktioner over tid og i tredimensionalt rum i levende væv under naturlige fysiologiske betingelser [28]. De data, der præsenteres i denne undersøgelse viser, at (i) en high-power RF-generator (200 W, ~ 15 kV /m) med succes kan være retro-monteret i et Nikon A1R IVM system uden hardware skader eller billedbehandling artefakter; og (ii) den integrerede IVM-RF system tillader billeddannelse af milde hypertermi-induceret dynamiske hændelser ( 41 ° C), såsom øget tumor perfusion af systemisk administrerede fluorescerende sporstoffer (albumin og FITC-dextran) samt fartøj deformation og koagulering observeret over temperaturområdet 44-49 ° C. På baggrund af disse resultater, forventer vi, at IVM-RF-system vil gøre det muligt for os at billedet RF-induceret biologiske begivenheder, såsom ændringer i vaskulær permeabilitet, ændringer i væv integritet, indflydelse på nanopartikel og narkotika ophobning, vævspenetration og cellulære begivenheder migration.

Materialer og metoder Salg

bærbar-RF-system

et fotografi af den bærbare-RF-system (p-RF) -system sammen med en skematisk fremstilling af p-RF forsøgsopstilling er illustreret i fig 1A og 1B. Fuld dimensioner kan findes i S1 Fig Enheden er drevet af en 200 W fast frekvens (13,56 MHz) vandkølet strømforsyning (Seren, RX01 /LX01 Series, Industrial Power Systems, Inc.), som er forbundet via en høj -current bæreevne 50 Ω koaksialkabler. Prøven skal udsættes for RF er placeret mellem de fremsendende og modtagende hoveder (TX og RX, henholdsvis). Stigninger i temperatur registreres ved hjælp af enten en 1 mm ydre diameter fiberoptisk Teflon belagt termiske sonder (Photon Kontrol, Canada), med en temperatur nøjagtighed på ± 0,5 ° C, eller en infrarød (IR) kamera (FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc., Boston, MA), med en temperatur nøjagtighed på ± 2 ° C (640 × 512 opløsning InSb detektor med en mid-bølgelængde IR spektralområde af 3,0-5,0 um). Termisk sonde data taget med et specialbygget LabVIEW Virtual Instrument (National Instruments, Austin, TX). Den genererede RF elektrisk-felt blev karakteriseret ved anvendelse af en teflonbelagt elektrisk felt probe (TherMed, LLC, Erie, PA) fastgjort til en justerbar x, y, z etape (Thorlabs, Inc.) til justerbar positionering, som vist i fig 1C og 1D. Fuldstændige oplysninger om el-feltmålinger kan findes i S2 Fig Som det kan ses i figur 1D, er “aktiv” område RF elektrisk felt eksponering centreret ~ 6 cm rundt om midtpunktet af TX hovedet og udvider ~ 1 -2 cm over x-aksen, hvilket medfører en opvarmning profil, der gradvis reduceres ved prøven er placeret længere væk fra TX hoved.

(a) Portable RF-system består af den transmitterende enhed (TX) og modtagende hoved (RX), der genererer en høj effekt elektrisk felt over prøven (f.eks mus). Systemet drives af en variabel effekt fast RF-forstærker (0-200 W, 13,56 MHz), som køles under drift af en vandkøler. Varmeproduktion overvåges ved hjælp af en infrarød (IR) kamera eller dirigere indsættelse af fiberoptiske prober. (B) Circuit repræsentation af den bærbare RF-system. (C) Opsætning til udvinding el-felt intensiteter. En elektrisk-felt sonde (EFP) placeres på bestemte punkter langs x- og z-aksen i mellem TX og RX hoveder og måler spændingen ved hvert punkt for 20 W RF-effekt. (D) Det elektriske felt er afledt af spændingsdata og afbildes som en intensitet kontur plot.

p-RF-system i sig selv er relativt lille (længde ~ 60 cm) i forhold til vores større RF modeller [1, 7, 14]. Svarende til vores tidligere RF-generatorer, design leverer en stærk vekslende (13,56 MHz) elektrisk felt på tværs af TX og RX hoveder [29] ved hjælp af en kaskade LC netværk. Men i modsætning til vores tidligere systemer, dette system ikke kapacitivt koblet og ikke modellere en ideel parallel-plade kondensator konfiguration, hvor det elektriske felt ville være omtrent ensartet over TX-og RX hoveder. I stedet dette system transmitterer et elektrisk felt, som gradvist aftager over TX-RX hoveder og dermed klassificeret som en “end-fyret transmission konfiguration”.

IVM-RF-system

Et billede af p-RF-system eftermonteres i en Nikon A1R

+ IVM er vist i fig 2A. Nikon A1R

+ er en laser konfokalt udstyret med to scanning mekanismer, et konventionelt galvanometer drevet system, og en resonant scanner. Den A1R

+ er udstyret med 4 solid state lasere (405, 488, 561 og 640 nm) og 4 fluorescens detektorer, herunder to Gaasp PMT’er. Den A1R

+ er også udstyret med en stor platform motoriseret scene (Prior Scientific ZDeck) og en samling af afstand målsætninger lang arbejdstid spænder fra lav forstørrelse, stort synsfelt (4x 0.2NA og 10x 0,4 NA), op til høj opløsning, nedsænkning i vand (16x 0,8 NA og 25x 1.2NA) linser. System drift og anskaffelse billede styres af Nikon NIS Elements software (v 4.0). Når RF instrumentet blev monteret på IVM, vores indledende evaluering af det integrerede system gradvist involveret øge p-RF-effekt (uden prøve), mens overvågning af spænding, der induceres over IVM chassis ved at tilslutte et oscilloskop sonde til elektrode jorden stifter placeret bag objektivlinsen på IVM systemet. På alle effektniveauer, herunder den højeste effekt på 200 W RF, den spænding, der induceres på chassiset var mindre end 500 mV, hvilket anses for ubetydelig, og blev ikke forudsiges at interferere med hardware. Denne test procedure blev udført for at sikre RF-energi blev ikke direkte kobling til IVM mikroskop, der ville mest sandsynlige årsag irreversibel elektronisk og strukturel skade på IVM-systemet. Mindre interferenser medfølgende software fejl i form af tilfældigt åbnet browservinduer og tekst optrædener-vi kaldt denne effekt ‘ghost writer’ og opdagede oprindelsen af ​​denne virkning at skyldes RF-felter kobling til computerens tastatur. Indpakning tastaturkablet omkring en ferritkerne balun at reducere RF-interferens løst dette problem. Vi observerede også interferens med motoriseret etape, der blev løst ved at isolere joystick controller boksen med alufolie.

(A) RF-system integreret i intravital mikroskop (IVM) for real-time imaging under RF eksponering . (B) Mouse manipulation til afbildning-en incision for at eksponere og forsigtigt manipulere 4T1 tumor for IVM billeddannelse. (C) 4T1 tumor under IVM belysning med en x4 objektiv.

Dyremodeller

Nude mus (4-6 uger gamle) blev indhentet fra Charles River Laboratories, Inc. ( Wilmington, MA). Breast tumorer blev etableret ved hjælp af fluorescerende 4T1 td-Tomat BioWare Ultra Red muse mamma kræftceller købt hos Caliper Life Sciences (Hopkinton, MA). Mus blev behandlet og afbildes når tumorerne nåede en størrelse ~ 8 til 10 mm i diameter. Ved opsigelse af imaging session, blev dyrene aflivet via CO

2 eksponering efterfulgt af cervikal dislokation. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Houston Methodist Research Institute og i henhold til NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

RF-IVM dyr manipulationer

Mus bærende 4T1 tumorer blev eksponeret ved en lille midtlinjeincision hvorved fascia mellem huden og musklen blev afbrudt med en vatpind. En omvendt hudlap var forhøjet ved hjælp rullet bomuldsgaze. Billeder af musene manipuleres for RF-IVM er vist i figur 2B og 2C. Mus blev bedøvet ved anvendelse af 2-3% isofluran (Aerrane; Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA) administreres gennem et isofluran fordamper-system (E-Z Systems, Palmer, PA, USA). Mus blev holdt på en opvarmning pad under kirurgiske forberedelse og billedbehandling eksperimenter for at opretholde kroppens kernetemperatur. I løbet af billedoptagelser tumoren blev kontinuerligt fugtet med saltvand, og temperaturen blev overvåget ved anvendelse teflonbelagt fiberoptiske prober og /eller en IR-kamera. Til billeddannelse med nedsænkning i vand linser, blev et dækglas forsigtigt anbragt oven på den fugtede imaging område med en manuel mikromanipulator (Kite, WPI). Time-lapse optagelser blev fanget på udvalgte synsfelter på frame rates på 10-30 fps.

Fluorescerende sporstoffer

De fluorescerende sporstoffer, der anvendes i denne forsøgene var Albumin-Alexa Fluor 647 (MW ~ 66 kDa) og fluoresceinisothiocyanat-dextran (FITC-dextran, MW ~ 70 kDa). Begge blev opnået fra Life Technologies, Grand Island, NY. Mus blev givet 50 pi retro-orbital injektioner af enten Alexa 647 eller FITC-dextran (eller begge) ved koncentrationer på 10 mg /kg (suspenderet i phosphatbufret saltvand, PBS). Musene blev derefter underkastet RF eksponering med eller uden samtidig IVM billeddannelse. Fluorescerende sporstoffer blev anvendt i denne undersøgelse, som kontrast tumor blodkar og til at undersøge ekstravasation, som følge af øget vaskulær permeabilitet, og udbredelsen af ​​de sporstoffer ind i tumorer. Cancerceller blev identificeret ved deres ekspression af tdTomato-fluorescerende protein. FITC-dextran, Td-Tomat og Albumin-647 fluorescens signaler blev opdaget sekventielt ved hjælp af laser excitation linjer på 488, 561 og 640 nm, mens emission er optaget med smal band pass filtre (30-50 nm båndbredde) på 520, 600 og længere end 640 nm. Tre kanal billeder blev taget til fange en 512×512 frame størrelser med pinhole diametre sat til en Airy enhed (AU) opgjort til 561 nm.

Immunfluorescerende imaging

Den komplette makro-perfusion og optagelse af fluorescerende sporstoffer i hele tumoren i RF og ikke-RF-behandlede mus blev analyseret

ex vivo

hjælp immunofluorescens billeddannelse. Tumor blodkar blev visualiseret under anvendelse af antistoffer for CD31 at vurdere vævsgennemtrængning af ekstravaseret albumin eller FITC-dextran. Frosne tumor snit blev fikseret med 4% paraformaldehyd, blokeret med 5% normalt hesteserum og 1% normalt gedeserum i PBS, og immunofluorescently farvet under anvendelse af antistoffer mod CD31 (BD Biosciences, San Jose, CA). Snit blev derefter inkuberet med gede-anti-rotte IgG Alexa Fluor 488-antistof (Jackson ImmunoResearch, West Groove, PA) [30]. Billederne blev taget med vores Nikon A1R

+ konfokal mikroskop og analyseret ved hjælp af Nikon NIS-Elements AR software (v3.2). Forholdet mellem pixel i hele billedet, der har højere fluorescensintensitet end tærsklen (baggrund) blev vist som positive område fraktion [31, 32]. Dataene blev vist som den gennemsnitlige ± SD fra repræsentative dele af mere end 5 billeder af tumorer.

Algoritmer til kvantificering fluorescerende sporstof perfusion

For at kvantificere den fluorescerende sporstof ophobning i tumoren og ekstravasation fra blodkar, brugte vi en simpel algoritme baseret på global tærskel segmentering og binære maskering teknikker, der anvendes til de billeder, der er erhvervet i levende dyr. Ved tærsklingsrutine TD-Tomato fluorescens komponent, vi først skabe et binært billede, som anvendes til at generere en maske for tumoren. Spile og eroderer operationer anvendes til at fjerne huller og glatte kanter denne maske. En lignende fremgangsmåde anvendes til at skabe en vaskulaturen maske baseret på åbent intensitetsværdier af FITC-dextran eller albumin-647-signaler. De to masker er derefter kombineret for at finde det ekstravaskulære komponent i tumorområdet og denne resulterende maske anvendes til at kvantificere mængden af ​​sporstof farvestof, som har migreret ind i tumoren.

Resultater og Diskussion

tumor temperatur modulation

Første test af RF-IVM system omfattede eksponering af en 4T1 tumor-bærende mus for RF-energi, uden billedbehandling, for at bekræfte tumor opvarmning. Fig 3A viser forsøgsopstillingen. Musen blev placeret på et specielt designet Teflon scenen dækket med en tynd film af kobber tape til elektrisk jorde dyret: forebyggelse overflade elektrisk ladning ophobning, som kan forårsage termisk skade. Dyret indlæst stadium blev anbragt mellem TX-og RX lederne af p-RF-system. Tre fiberoptiske termiske prober blev direkte indsat i musen i forskellige positioner omgiver tumoren og ved unikke afstande fra TX hovedet. Probe # 1 (tættest på TX hoved) blev indsat under huden, men over tumormassen; probe # 2 blev indsat under huden i mellem det område, hvor tumoren projiceres fra hoveddelen af ​​musen; og probe # 3 blev indsat over den udsatte intraperitoneal hulrum. I betragtning af at væv placeret nær sonde # 1 sandsynligvis ville opvarme den største grund af dets nærhed til TX hovedet, vi brugt dette som en reference i at tænde og slukke for RF-system ved forskellige temperaturer punkter: 45 ° C, 43 ° C og 41 ° C. Vævstemperaturen blev nedkølet til omkring -30 ° C (på grund af aircondition operationsstuen) mellem hver radiobølger. Det samlede behov for at generere disse opvarmning profiler magt var 90 W. Som vist i fig 3B, tumor temperatur oprindeligt steg fra 30 ° C til 45 ° C i ~ 250 s, idet ~ 375 s at køle ned til 30 ° C. På dette tidspunkt blev RF slået tilbage, og tumoren blev opvarmet til 43 ° C før den blev slukket igen. Dette blev gentaget til en endelig tumor temperatur på 41 ° C. Temperaturdata fra sonder # 1- # 3 viste en reduktion i opvarmning af væv som følge af faldet fra i elektrisk feltintensitet fra TX hoved. Hvis det elektriske felt skulle være konstant over TX-og RX hoveder, som den nærmer tilstand et ideelt parallel plade kondensator model, så eventuelle udsving og variationer i temperatur vil sandsynligvis tilskrives forskelle i permittivitet og ledningsevne mellem vævene , organer og tumorer i mus, som vil blive drøftet.

(A) Termisk fiberoptisk probe placering. Sonder # 1-3 er placeret (i) under huden, men over tumoren; (Ii) under huden i mellem tumoren og hovedlegemet; og (iii) under huden ved siden af ​​den intraperitoneale kavitet. (B), der udvindes termiske sonde data. Den optagede temperatur af proberne blev moduleret ved at tænde og slukke for RF-system (+ RF og-RF). Systemet blev slået fra, når tumoren temperatur (probe # 1) nåede 45 ° C, 43 ° C, og 41 ° C, henholdsvis og blev tændt når alle prober havde værdier i området ~ 29-31 ° C. (C) IR-kamera måles samtidig overfladetemperaturen af ​​de punkter, hvor de termiske prober blev placeret.

Det elektriske felt intensitet omkring tumoren samt tumorerne ‘dielektriske egenskaber er måske de to mest vigtige fysiske parametre, der styrer de opvarmningshastigheder enkelte tumorer. Dielektrisk i dette tilfælde er, hvor meget elektrisk energi et materiale vil absorbere og konvertere for varme, og er frekvensafhængig. En nylig publikation påviste anti-tumor effekt som følge af ikke-invasiv RF [1]. I deres undersøgelse, Raoof

et al

. udsat mus med ortotopisk-implanterede menneskelig hepatocellulær og pancreas xenotransplantater til ugentlige RF engagementer. Deres resultater indikerede, at RF-alone var nok til at forårsage en anti-tumor effekt i hepatocellulære carcinomer og kunne forklares udelukkende på princippet af tumorerne ‘dielektriske egenskaber er større end normalt, sundt væv. Evnen af ​​et materiale til at opbevare og sprede elektrisk energi som varme kan beskrives ved den virkelige (

ε ‘

) og imaginære (

ε “

) dele af den komplekse permittivitet funktion (ε * ). Dette forhold er givet ved ligning 1: (1), hvor

ω

er den radiale frekvens (

2Trf

). Den virkelige løbetid ligning 1 giver oplysninger om, hvor meget elektrisk energi kan lagres i et materiale, mens den imaginære udtryk angiver, hvor meget af denne energi omdannes til varme.

I en rent ideal kliniske situation, den imaginære værdier for tumorvæv vil være væsentligt højere end for normale, sunde væv, hvorved tumoren ville varme hurtigt op til temperaturer, der inducerer enten hypertermi (der fører til naturlige programmeret celledød mekanismer) eller fuldstændig ablation og nekrose. De dielektriske egenskaber af både cancerøse og normale væv blev målt ved Raoof

et al

. (Ved anvendelse af en permittivitet analysator), og viste sig at være større for tumorer end normale celler. Forholdet mellem et materiales permittivitet og dens virkning på varmeproduktionen når de udsættes for en tidsvarierende elektrisk felt er givet ved følgende ligning: (2) hvor

ε

0

er den vakuumpermittivitet,

ε “

er den imaginære del af den komplekse permittivitet,

E

er det elektriske felt intensitet i prøven,

ρ

er massefylden, og

c

s

den specifikke varmekapacitet. I denne grundlæggende styrende ligning, er alle relevante fysiske variable indeholdt der beskriver, hvordan en prøve vil reagere på udsættelse for et elektrisk felt. Denne ligning, især den stærke afhængighed af elektrisk feltintensitet, kan bidrage yderligere forklare faldet i varmeproduktionen:. De temperaturfølere er placeret længere væk fra TX hovedet med elektrisk feltstyrke gradvist faldende

I denne studere, overfladetemperaturen af ​​de steder, hvor de termiske prober er placeret blev også taget med en IR-kamera, som vist i fig 3C. Som det kan ses, er der betydelige ligheder og forskelle i forhold til de termiske probe data. IR-data indikerer et fald i finale vævstemperatur forhold til sonden # 1 måling af ~ 5 ° C, og et fald i temperatur på ~ 3 ° C i probe # 2. Temperaturerne er ens for sonde # 3. For yderligere at teste forskelle og fejl margin mellem termiske probe data IR kamera og blev alle tre sonder nedsænket i 1,3 ml PBS indeholdt i en kvarts kuvette og udsat for RF-felter. data Temperaturen er vist i Fig 4. Der er en tæt match mellem termiske probe data den indspillede IR kamera og med en fejlmargen mellem 0,2-0,5 ° C. Denne lighed var forventet, da kvarts kuvette er næsten optisk transparent tværs IR bølgelængdeområdet 3,0-5,0 um. På grund af de tætte ligheder mellem termiske probe data IR kamera og forskellene i mus opvarmning af vist i figur 3 er mest sandsynligt på grund af uoverensstemmelse mellem sonden placering og IR markøren. For eksempel positionen af ​​sonden # 1 er faktisk dybere under huden på musen end probe # 3 (såvel som at være tættere på tumor) så vil sandsynligvis vise større varmeproduktion på grund af opvarmningen af ​​tumoren i sammenligning med den overflade IR kamera målinger. Også overflademålinger generelt sandsynligvis være lavere end inter-væv temperaturer som følge af den kølende virkning fra stuetemperatur miljø. Endelig optiske tab og absorption af formeringsmateriale IR energi gennem huden vil sandsynligvis reducere intensiteten af ​​IR fotoner på overfladen af ​​musen, som bliver detekteret ved hjælp af IR-kamera.

(A) Tre termisk prober var steder i en kvartskuvette fyldt med phosphatpufret saltvand (PBS) og eksponeret for 200 W fra RF. IR-kamera fangede overfladetemperaturen af ​​markøren punkter placeret ved siden af ​​termiske prober til RF eksponeringstid 0 s-380 s (B og C). (D) Sammenligning af termisk sonde og IR kamera opvarmning data.

Multi-kanals IVM-RF billedbehandling og høj temperatur fartøj nedbrydning

Fig 5 viser real-time multi-kanal IVM-RF billeddannelse på en udsat 4T1 tumor. Tre separate kanaler blev afbildet: FITC (fartøjer med dextran), Texas Red (4T1 transficerede tumor), og Cy5 (røde blodlegemer, RBC’er). Fig 5A viser de fusionerede kanaler, mens de enkelte kanaler er vist i figur 5B-5D. Fig 5E-5H viser ændringer i fartøjets arkitektur for fire forskellige tidspunkter, er illustreret som tiden punkt 1 til 5 i fig 5I (NB: tid punkt nummer 1 svarer til billeddannelse før tilsætningen af ​​RF eksponering). Også vist i fig 5I er grafen for tumor temperatur og RF-effekt som funktion af tid. Tumor temperatur i dette tilfælde blev overvåget under anvendelse af en temperaturprobe anbringes i tumoren. En tid-komprimeret film af disse sammenlagte og enkelte kanaler kan findes i S1 Movie.

(A) overlejring af de uafhængige IVM kanaler (FITC, Texas Red, og Cy5). (B) Tumor fartøjer er fremhævet ved hjælp af FITC-dextran fluorescerende sporstoffer, (C) Fluorescerende emission fra transficerede 4T1 tumor cellelinje, (D) Cy5 emission fra DID-farvet røde blodlegemer. Figur (A) – (D) blev taget ved tid = 78 s. Figur (E) – (H) afbilder FITC-kanalen (fartøjer) på forskellige tidspunkter: 762, 1650, 2382 og 2742 s, henholdsvis. Figur I illustrerer tumor temperatur med hensyn til tid og anvendes RF-effekt. Tallene 1-5 er vist i nederste venstre side af hver figur svarer til de 5 forskellige tidspunkter fremhævet i figur I.

Som det kan ses ud fra disse resultater, tumor skibe begynder at smalle og snøre når tumoren temperatur stiger over 41 ° C. Ved en endelig tumor temperatur på 44 ° C, de intravaskulære celler er helt stillestående og fartøjerne har stoppet funktion. Dette kan også ses i S1 Movie med hensyn til strømmen af ​​røde blodlegemer. Når temperaturen er hævet over 41 ° C strømmen af ​​RBC’er bliver uregelmæssig og der er nogle fartøj segmenter, hvor blodgennemstrømningen er ophørt fuldstændigt. Bemærk, med hensyn til de tidspunkter, hvor RF-effekt blev intermitterende afsluttet for at forhindre overophedning af tumoren. Anvendelsen af ​​en skrå opvarmning profil kan vi skræddersy strømmen fra når den udpegede temperatur er nået, således at en nøjagtig indstillet temperatur kan opretholdes. Dette kan ses fra tidspunkterne 2 og 3, hvor strømmen hurtigt faldt derefter gradvist øget for at muliggøre en mere forsigtig opvarmning profil.

En gentagelse af dette eksperiment (men uden RBC-farvning) er vist i fig 6. virkningen af ​​nedbrydning fartøj er mere udtalt i disse billeder. Ved at se på de fire forskellige tidspunkter kan det ses, at nogle lavt niveau af nedbrydning fartøj er indlysende for temperaturer mellem 41,5-41,8 ° C (vi holdt dette temperaturområde for ~ 10 minutter). Efter dette, ved påføring af flere RF-effekt, at stigningen i tumor varmeproduktion (op til ~ 49 ° C) resulterede i alvorlig forringelse og fuldstændig nedlukning af tumorkar. En fuld film af disse virkninger kan ses i S2 Movie. Resultaterne vist i figurerne 5 og 6 resultater illustrerer virkningen af ​​høje temperaturer på fartøjet arkitektur og RBC strømningsdynamik. Selv om det er velkendt, at skader fartøj kan opstå af temperaturer over 41 ° C, er det blevet påvist, at øget permeabilitet fartøj og perfusion af cirkulerende makromolekyler, kemoterapeutika, og der kan forventes lægemidler til temperaturer inden for spektret 39 ° C-41 ° C (der refereres oversigtsartikel af Roussakow tilbyder en omfattende og præcist overblik over feltet [33])

(a) – (D) Virkningen af ​​RF eksponering på skib arkitektur på fire forskellige tidspunkter:. 0 : 22, 6:53, 16:18 og 20:31 minutter. Tumoren temperaturer og RF-effekt på disse tidspunkter er vist i øverste midterste og øverste højre sektioner, henholdsvis. Figur (E) illustrerer ændringen i temperatur og effekt med hensyn til tiden. Vessel nedbrydning kan ses til temperaturer 41 ° C. En fuldstændig opdeling af fartøjet arkitektur kan ses for temperaturer 47 ° C.

RF-induceret fluorescerende sporstof transport og perfusion i 4T1-tumorer

Mus med 4T1-tumorer blev kirurgisk forberedt til RF-IVM som beskrevet i metodeafsnittet. Mus modtog intravenøse injektioner af 50 pi albumin-Alexa-fluor 647 farvestof (10 mg /kg) via retro-orbital injektion og afbildes med og uden RF (som kontrol). For alle eksperimenter RF blev slukket, når tumoren temperaturen nåede 41 ° C (medmindre andet er angivet) som angivet ved IR-kamera. Fig 7A-7D afbilder perfusion af albumin sporstof ud af blodkarrene og i tumoren under en RF behandlingsvarighed på 4,5 minutter. Forbedret tumor perfusion er særligt tydeligt, når man sammenligner Fig 7A og 7B til start og slutpunkter (0 og 4,5 minutter, henholdsvis) til albumin kun (blå) kanal. Den komplette videofiler (redigeret for at fjerne billedet jitter på grund af mus respiration) er i S3 og S4 Film. For en kontrol, blev det samme eksperiment afbildet uden RF eksponering (Fig 7E) i 30 minutter. En forringet perfusion barriere er evident ingen albumin trænge ind i tumoren under billeddannelse session (30 min, fig 7E). Denne forringet perfusion er karakteristisk for tumor som følge af højt tryk, kaotisk vaskulatur, og den resulterende tumor fartøj kompression [34, 35]. Begrænset vaskulær perfusion blev observeret i flere mus under billeddannelse sessioner varighed op til en time.

RF eksponering viser transport af fluorescens bundet albumin tværs af perfusion barrieren til tumor region. Figur (A) og (B) viser den blå billede kanal (albumin) før og efter (4,5 min) RF eksponering. Disse data er vist overlejret med tumoren (rød) kanal i figur (C) og (D). Figur (E) Kontrol mus (ingen RF) blev afbildet i 30 minutter på begge kanaler. Der er ingen transport af albumin i tumoren tværs af perfusion barriere. (F) Time bortfaldt billeder af dataene vist i figur (A) og (B).