PLoS ONE: Ekspression af Mir-21 og Mir-143 i livmoderhalsprøver Lige fra Histologisk Normal igennem til Invasiv Livmoderhalskræft

Abstrakt

Baggrund

MicroRNA udtryk er alvorligt forstyrret i carcinogenese, men begrænset dokumentation er tilgængelige validering resultater fra celle-line modeller i humane kliniske kræft prøver. MicroRNA-21 (mir-21) og microRNA-143 (mir-143) er tidligere blevet identificeret som signifikant dereguleret i en række af cancere, herunder cervikal cancer. Vores mål var at undersøge udtrykket mønstre af flere velundersøgte microRNA arter i cervikale prøver og sammenligne resultaterne til celle line prøver.

Metode /vigtigste resultater

Vi målte udtryk for mir- 21 og mir-143 i 142 formalinfikserede, paraffin indstøbt (FFPE) cervikale biopsi væv blokke, indsamlet fra Dantec Onkologisk Klinik, Dakar, Senegal. MicroRNA ekspression analyse blev udført under anvendelse af Taqman-baseret real-time PCR assays. Protein immunhistokemisk farvning blev også udført for at undersøge målprotein-ekspression på 72 prøver. Vi fandt, at mir-21-ekspression øges med forværring klinisk diagnose, men at mir-143 blev ikke korreleret med histologi. Disse observationer var i skarp kontrast til tidligere rapporter, der involverer livmoderhalskræft cellelinjer, hvor mir-143 var konsekvent nedreguleret, men mir-21 stort set upåvirket. Vi identificerede også, for første gang, at cytoplasmatisk udtryk for programmeret celledød Protein 4 PDCD4; en kendt mål for mir-21) var signifikant lavere hos kvinder med invasiv cervikal karcinom (ICC) i forhold til dem med cervikal intraepitelialneoplasi (2-3) eller karcinom

in situ

(CIN2-3 /CIS) , selv om der ikke var nogen signifikant sammenhæng mellem mir-21 og PDCD4 udtryk, trods tidligere undersøgelser identificerer PDCD4 udskrift som en kendt mir-21 mål.

konklusioner

Mens microRNA biomarkører har en række lovende funktioner, er flere undersøgelser af ekspressionsniveauerne i histologisk definerede kliniske prøver forpligtet til at undersøge den kliniske relevans af discovery-baserede undersøgelser. Mir-21 kan være af en vis nytte i prædiktiv screening, eftersom at vi observeret en signifikant sammenhæng mellem mir-21 ekspressionsniveauet og forværring histologisk diagnose af livmoderhalskræft

Henvisning:. Deftereos G, Corrie SR, Feng Q, Morihara J, Stern J, Hawes SE, et al. (2011) Ekspression af Mir-21 og Mir-143 i livmoderhalsprøver Lige fra Histologisk Normal igennem til Invasiv livmoderhalskræft. PLoS ONE 6 (12): e28423. doi: 10,1371 /journal.pone.0028423

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget den 22. april 2011; Accepteret: November 8, 2011; Udgivet: December 14, 2011

Copyright: © 2011 Deftereos et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende finansiering bidrag fra National Institutes of Health /National Cancer Institutes (NIH /NCI) (R01 CA75920 og R01 CA115713, Dr. Kiviat) og den amerikanske Australian Association (Merck Company Foundation Postdoc Fellowship, Dr. Corrie). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

strategier til tidlig detektion af cancer er baseret på identifikation og validering af biomarkører, som er stærkt indikative for sygdommens progression fra normalt eller præcancer væv til tidlig invasiv cancere. MikroRNA’er er en gruppe af nyligt opdagede korte RNA-arter (~21 nt), der er involveret i reguleringen af ​​genekspression i et væv-specifik måde, som mange cellulære veje, herunder proliferation, differentiering og apoptose [1]. Det er blevet vist, at microRNA aberrerende reguleres i invasiv cancer, og kan fungere som tumorsuppressorer eller enhancere i forskellige væv og miljøer [2]. Deres nylige opdagelse har ført til en række undersøgelser med henblik på at opdage nye kræft biomarkører (anmeldt i [3] – [5])., Men få er blevet valideret i kliniske prøver, især dem repræsentant for præ-kræft sygdom

MikroRNA’er er af stigende interesse for kræftdiagnostik på grund af den observation, at en overraskende lille familie af molekyler kan give udsøgte specificitet ved klassificering vævstyper, hvilket afspejler den udviklingsmæssige afstamning og differentiering tilstand. Lu

et al.

Udnyttet dette ved hjælp af en microRNA panel af 217 arter at klassificere dårligt differentierede tumorer med høj konkordans mens en sammenlignelig mRNA panel indeholder ~16,000 arter mislykkedes [6]. Yderligere undersøgelser har vist potentiale for microRNA at skelne mellem kræft undertyper hvor histologisk diagnose er komplekse eller umuligt at diagnosticere tumorer af ukendt oprindelse og diagnosticere kræft disposition [4].

Undersøgelser brugen af ​​microRNA som biomarkører til detektering tidlig kræft har identificeret overraskende blod og væv stabilitet i modsætning til mRNA [7], [8], og udvikling af meget følsomme og specifikke qPCR procedurer er opmuntrende. Men i alle tilfælde til dato blev prøver ekstraheret fra patienter, som allerede havde udviklet cancer [4], så anvendeligheden af ​​microRNA som en markør for cancer progression fra præcancerøse igennem til tidlig invasiv kræft fortsat ukendt. Undersøgelse af microRNA ekspression i prøver, der spænder over hele spektret af histologisk definerede prøvetyper, fra normal til invasiv cancer, klart kræves til korrekt bestemme nytten af ​​microRNA ekspressionsniveauerne som kræft biomarkører.

Livmoderhalskræft er en sygdom for som lagdeling af histologiske typer fra normal igennem til invasiv karcinom er godt præget og understøttes af molekylære teknikker baseret på HPV-genotypebestemmelse. Men i betragtning af den enorme succes for livmoderhalskræft screeningsprogrammer, kun 35-65% CIN-3 /SNG, 12-20% CIN-2 og 5% CIN-1 sager forventes at gå videre til mere alvorlige former for dysplasi eller invasive cancer – hvilket antyder, at markører med en højere prædiktiv værdi for progression ville være meget ønskeligt [9], [10]. Vi identificerede derfor livmoderhalskræft som en ideel prøvesag for at følge ændringer i specifikke microRNA udtryk niveauer fra normal gennem præcancerøse og kræft væv. Tidligere undersøgelser har identificeret en række afvigende regulerede microRNA’er i livmoderhalskræft cellelinjer, med Mirs-127, 9, 203, 199a, 218, 21, 143, 205, 214.126, 15b, 16, 146a og 155 blandt de mest almindelige [3 ], [11] – [17]. Men kun én af disse undersøgelser omfattede forstadier livmoderhalsprøver (CIN1-3), hvor høj biologisk variation blev konstateret i microRNA ekspressionsniveauerne, især i normale prøver (omend med lave stikprøvestørrelser) [16].

i dette studie undersøgte vi udtrykket profiler af to microRNA (mir-21 og MIR-143) og deres tidligere validerede target proteiner i kliniske prøver fra kvinder med HPV-infektion uden læsioner, med histologisk diagnosticeret forstadier til kræft, eller med invasiv cancer ( ICC), såvel som normale kontroller uden HPV-infektion. Sekvenserne blev valgt baseret på tidligere resultater fra andre grupper, der identificerer betydelig deregulering på tværs af en række livmoderhalskræft cellelinjer og nogle begrænsede friske frosne prøver [12]. Vores primære mål var at bestemme, om der var signifikante korrelationer mellem microRNA ekspression og histologisk type, som kunne tyde på en potentiel rolle for microRNA som en tidlig markør af onkogent potentiale af præ-læsional HPV-infektion og /eller for progression af præcancer til kræft. For det andet, vi sammenlignet microRNA ekspression i kliniske prøver og kræft cellelinjer at afgøre, om cellelinjer bør fortsat anvendes som grundlag for klinisk afprøvning. Vi identificerede en signifikant sammenhæng mellem mir-21-ekspression og histologisk diagnose, men ingen sammenhæng med mir-143. Vi undersøgte også udtryk for kendte mir-21 target proteiner (PDCD4, PTEN (fosfatase og tensin homolog), TPM1 (tropomyosin 1)) ved immunhistokemi analyse og identificeret en signifikant sammenhæng mellem cytoplasmatisk PDCD4 udtryk og histologisk diagnose. Vi identificerede uoverensstemmelser mellem de kliniske prøver og livmoderhalskræft cellelinjer, hvilket tyder på, at kliniske prøver skal undersøges for validering efter opdagelsen af ​​kandidat biomarkører i cellelinje opdagelse-fokuserede undersøgelser.

Resultater

MicroRNA ekspression i cervikal cancer cellelinjer

Vi undersøgte ekspressionen af ​​mir-21 og mir-143 i cervikale cancercellelinier med hensyn til (Normal (HRHPV-) for at bekræfte tidligere iagttagelser. Figur 1 viser, at for alle tre cancercellelinier testet (SiHa, CaSki, HeLa), var der ingen væsentlig forskel mellem mir-21 ekspression og af normale prøver. imidlertid mir-143 ekspression af alle tre cancercellelinier blev væsentligt reduceret i forhold til kliniske prøver vi har imidlertid ikke tilknyttet statistisk analyse til disse sammenligninger på grund af de forskellige fejl fordelinger mellem kliniske prøver og cellelinjer, og fordi vi kun ville have

n

= 3 i tilfælde af cellelinierne til sammenligning.

Mir-143 var signifikant nedreguleret i alle tre livmoderhalskræft cellelinjer efter aftale med tidligere undersøgelser. Imidlertid mir-21 var ikke signifikant forskellig fra de normale prøver, selv om der i tidligere undersøgelser mir-21 er blevet observeret at være signifikant opreguleret i de samme cellelinier.

MicroRNA ekspression i klinisk prøver

i modsætning til cellelinje data, observerede vi en signifikant sammenhæng mellem mir-21-ekspression og histologiske type i kliniske prøver, men ingen sammenhæng for mir-143 (figur 2 og tabel 1). Kvinder med ICC viste signifikant øget mir-21-ekspressionsniveauer i forhold til kvinder med CIS /CIN2-3, CIN1, normal (HRHPV +) og normal (HRHPV-) (ANOVA,

s

0,0001). Desuden kvinder med CIS /CIN2-3 havde marginalt forøget mir-21-ekspressionsniveauer sammenlignet med kvinder med CIN1 (

p

u

= 0,14 og

p

en

= 0,24 ) og normal (HRHPV +) (

p

u

= 0,07 og

p

en

= 0,14). Vi fandt ingen sammenhæng mellem alder eller HRHPV status og histologiske type (data ikke vist). En afskæring af 5,06 bedste fornem ICC /Normal (HPV) populationer (bestemt fra ROC-kurve) og var 91% følsomme og 87% specifik. Figur 2 viser, hvordan det cutoff faired for de andre to histologiske grupper. Kun 5% af prøverne fra kvinder, der er Normal (HPV +), 7% af CIN 1, og 24% af CIN 2-3 /SNG prøver havde MIR-21 værdier større end 5,06. Interessant, 13% af prøver fra kvinder med Normal (HPV) histologi viste mir-21 ekspressionsniveauet større end 5,06.

I modsætning til de celle-line data præsenteret i figur 1, observerede vi en signifikant sammenhæng mellem øget mir-21 udtrykket et forværrede histologisk diagnose, dog ingen væsentlige foreninger for mir-143. Der var en signifikant forskel mellem alle histologiske grupper (ANOVA,

s

-værdi 0,0001) og desuden kvinder med CIS /CIN2-3 havde marginalt højere mir-21-ekspressionsniveauer i forhold til dem er klassificeret som Normal /HRHPV + (

p

u

= 0,0375

p

en

= 0,0563).

PDCD4, PTEN og TPM1 udtryk

for at undersøge virkningen af ​​mir-21 deregulering på vævsspecifik målprotein ekspression i kliniske prøver, målte vi protein ekspressionsniveauer af PDCD4 og PTEN ved immunohistokemi (IHC) i 72 af de testede for mir-21 ekspression prøver . TPM1 udtryk blev evalueret på en delmængde af prøver, men niveauet af TPM1 udtryk i cervikal epitel viste sig at være under tærsklen for detektion ved immunhistokemi. Vi observerede en signifikant sammenhæng mellem cytoplasmatisk PDCD4 (cPDCD4) ekspression og prøve histologi (tabel 2, figur 3 og figur 4). Prøver fra kvinder med ICC havde signifikant lavere cPDCD4 udtryk i forhold til dem med CIN2-3 /CIS (pu = 0,0005 eller pa = 0,003) og marginalt lavere udtryk i forhold til (HRHPV +) (

p

u

= 0,03 eller

p

en

= 0,11). Kvinder i det normale (HRHPV-) gruppe havde signifikant lavere cPDCD4 udtryk i forhold til CIS /CIN2-3 (

p

u

= 0,005 eller

p

en

= 0,02) . Der syntes også at være et marginalt fald i nukleare PDCD4 (nPDCD4) hos kvinder med ICC i forhold til dem med CIN2-3 /CIS. Der var ingen signifikant korrelation mellem PDCD4 ekspression (nukleare eller cytoplasmatisk) og mir-21-ekspression i disse prøver, men vi observeret en generel gruppering af ICC med høj mir-21, men ikke PDCD4, og CIN-2,3 /CIS med højere PDCD4 men ikke-hævet mir-21 (figur 4). Der var også nogen sammenhæng mellem PTEN proteinekspression og prøve histologi eller microRNA ekspression. Vi overvejede analyse IHC af både frekvensen af ​​den maksimale intensitet score og frekvensen af ​​den fremherskende intensitet score. Men vi observerede lignende resultater i forhold til den sammensatte score analyse og bestemt der er ingen fordel for at bruge frekvensen af ​​intensitet scores over de sammensatte scoringer.

Her observerede vi en signifikant sammenhæng mellem cytoplasmatisk PDCD4 udtryk og prøve histologi.

diskussion

Mens microRNA udtryk profilering har vist sig at være meget specifik for kræft maskinskrivning, tumor diagnose og identifikation tumorer af ukendt oprindelse, er det ikke endnu klart, om microRNA kan udføre som markører for sygdomsprogression – et afgørende krav til identifikation af disse tilstande, som kræver behandling. Ideelt set ville sådanne markører for progression viser systematiske ændringer i udtryk i præcancerøse væv, der korrelerer med sygdomsprogression til invasiv cancer. Klart, det kræver adgang til et stort antal kliniske prøver, som dækker området fra histologisk definerede vævstyper involveret i sygdomsprogression. I dette studie undersøgte vi ekspressionsniveauerne af to centrale MikroRNA’er identificeret i litteraturen (og deres validerede protein mål) i livmoderhalsen væv stratificeret ved histologisk diagnose for at bestemme deres anvendelighed som biomarkører for tidlig diagnose af kræft. Vi fandt, at mir-21 ekspression blev øget væsentligt kun i ICC med hensyn til andre kliniske prøver, og at mir-143-ekspression korrelerede ikke med histologi overhovedet. Cervikal cancer cellelinje resulterer, mens overens med tidligere undersøgelser af de samme cellelinier, syntes at give diskordante microRNA ekspression resulterer i sammenligning med kliniske prøver. Interessant, PDCD4 proteinekspression steg i forstadier til kræft faldt derefter markant i ICC, eventuelt som en effekt af mir-21-induceret nedregulering. Disse resultater understreger behovet for yderligere undersøgelser, der fokuserer på væv profilering frem for cellelinjer, hvor der kan vurderes ekspressionsniveauer af kandidat miRNA biomarkører i præ-kræft sygdom, hvor deres anvendelighed i kræftdiagnostik vil vise sig mest gavnlige. Vi identificerede centrale uoverensstemmelser i microRNA udtryk profiler i vores kliniske prøver i forhold til livmoderhalskræft cellelinjer. De seneste undersøgelser viser betydelige forskelle i microRNA udtryk baseret på celle dyrkningsbetingelser tyder på, at cellelinje eksperimenter ikke kan være særligt oplysende når du søger efter klinisk relevante microRNA [12]. Cheng

et al.

2005 [18] viste signifikant stigning i HeLa cellevækst og proliferation som respons på inhibering af mir-21, hvorimod Yao

et al

2009 [14] viste signifikant fald i cellevækst og proliferation for samme behandling. Wang

et al

2008 [12] viste desuden, at skiftende dyrkningsbetingelser fra en monokultur til en suspension tømmerflåde kultur førte til et helt andet sæt af betydeligt deregulerede microRNA. Tilsvarende uoverensstemmende resultater er set i andre undersøgelser undersøger relevansen af ​​cellekultur modeller i forhold til

in vivo

væv kugleformede kulturer [19], [20]. Desuden har andre gen /protein ekspressionsforskelle nylig blevet identificeret, herunder tilstedeværelsen af ​​WNT5A ekspression i gastriske cancere (ikke udtrykkes i cellelinjer) [21] og forskelle i DNA-methylering [22] og genekspression [23] signaturer mellem colorektale carcinomer og tyktarmskræft cellelinjer. Det er klart, et centralt problem med cellelinje tilgang er, at potentielle biomarkører er identificeret i celler udødeliggjort fra invasive kræftformer – det er ofte helt ukendt, hvis der kan påvises disse biomarkører i præ-kræft sygdom, som kræver analyse af kliniske prøver. En yderligere komplikation i den aktuelle undersøgelse kan være den racemæssige baggrund (vestafrikansk) i forhold til cancer cellelinjer, som er Kaukasiske – dog lidt information er kendt om sådan variation

Øget mir-21-ekspression er blevet identificeret i. et stort antal tumortyper [24] – [29], og i denne undersøgelse har vist signifikant association med udviklingen af ​​histologisk definerede ICC. Desuden er vores resultater viser, at mir-21 kan have en vis anvendelighed ved forudsigelse af progressionen af ​​forstadier til kræft i ICC, som kvinder med høj mir-21 værdier kan forventes at komme videre. Imidlertid er yderligere undersøgelser med større stikprøvestørrelser og patient opfølgning forpligtet til at undersøge dette aspekt, da der er klart utilstrækkelige data for korrekt afprøvning af denne hypotese ved at opdele i uddannelse og test sæt. Endvidere medens mir-21 ekspressionsniveauer af kvinder med normal patologi med og uden HRHPV infektion er ikke statistisk forskellige, viste HRHPV- gruppen omtrent dobbelt så mange prøver over den optimale afskæring sammenlignet med HRHPV + gruppen. Betydningen af ​​dette resultat er igen vanskeligt at kvantificere på grund af de relativt lave prøvestørrelser involveret, men det kan indikere, at et panel af biomarkører kan være nødvendig for at reducere falske positiver.

En række undersøgelser har identificeret mir -143 så markant underexpressed i kræft, herunder bryst- og livmoderhalskræft [12], [17], [30]. Mens vi også observeret betydelig underekspression i livmoderhalskræft cellelinjer med hensyn til normale (HRHPV-) prøver, har vi ikke finde nogen statistisk signifikante associationer med hensyn til kliniske prøver fra kvinder på tværs af et bredt spektrum af neoplastisk sygdom. Tidligere studier undersøger microRNA ekspression i cervikale prøver viser igen modstridende resultater. Lee

et al

2008 [11] ikke omfatte enten mir-21 eller mir-143 i deres indledende forsøg screening og som sådan ikke identificere disse arter som indblandet i udviklingen af ​​kræft; dette understreger en klar udfordring i at identificere potentielle biomarkører, i tilfælde, hvor førende kandidater ignoreres. Men Wang

et al

2008 [12] foreslog, at reduktionen af ​​mir-143 var påkrævet for tumor udvikling mens Lui

et al

2007 [17] viste blandede resultater for mir-143, primært på grund af det lave niveau af ekspression påvist i enten normale eller cancerøse prøver. Uoverensstemmelser kan skyldes det relativt lave niveau mir-143-ekspression i cervikale væv, som kan kræve en mere præcis ekstraktionsmetode (

f.eks

laser mikrodissektion) for tumor udvinding – ingen af ​​de undersøgelser, der er anført her anvendte sådanne metoder.

Tidligere undersøgelser viste, at PDCD4, PTEN og TPM1 er alle udskrifter rettet af mir-21 i forskellige væv [14], [17], [24], [26], [31], [32] og at PTEN progressivt underexpressed fra normalt væv igennem til livmoderhalskræft [33] – [35]. En nylig undersøgelse har også rapporteret reduceret PDCD4 udtryk i livmoderhalskræft cellelinjer [14], som er i overensstemmelse med vores resultater i de kliniske prøver undersøgt i dette studie. Faktisk seneste undersøgelser har vist ikke kun en direkte forbindelse mellem PDCD4 udtryk og tumor progression (Wei

et al

, 2009 [36]), men også den centrale rolle, PDCD4 og mir-21 i apoptotisk inflammatorisk respons (Sheedy

et al

, 2009 [37]). Desuden seneste celle modelstudier støtter foreslå en rolle for tab af PDCD4 udtryk i øget følsomhed i cellerne for stoffer, der forårsager DNA-skader (Singh

et al

, 2009 [38]), som alle ville forventes at giver gunstige betingelser for tumorvækst. Mus, der udtrykker høje niveauer af PDCD4 er også mere modstandsdygtige over for tumorvækst i sammenligning med normale kontroller. Vi hypotese, at cPDCD4 ekspression (og i mindre grad, nPDCD4 ekspression) er forøget i præcancerøse prøver som følge af øget apoptose, efterfulgt af et brat fald i ekspression for ICC prøver, hvor apoptotiske mekanismer undergravet. Lignende tendenser er blevet observeret for andre tumorsuppressorgener i forhold til onkogenese og apoptose [39], [40]. Interessant, vi ikke identificere nogen sammenhæng mellem PTEN udtryk og histologisk diagnose; tab af ekspression er blevet bemærket tidligere, og vi har observeret lavere ekspression i en brystkræft undersøgelse under anvendelse af de samme metoder (data ikke vist).

I denne undersøgelse har vi fundet, at ekspressionsniveauet af mir-21 er signifikant korreleret med histologisk diagnose af ICC. En kendt mål for mir-21, blev PDCD4 også nedreguleret, men blev ikke signifikant korreleret med mir-21-ekspression. Ekspression af mir-143 blev ikke korreleret med histologisk diagnose af kliniske prøver, men det var betydeligt nedreguleret i cervikale cancercellelinier. Disse resultater er vigtige i forsøget på at måle nytten af ​​miRNA biomarkører for diagnostiske anvendelser, et centralt element, som er til at måle ekspressionsniveauerne i præcancerøse væv samt normale og invasive kræftformer. Det er klart, skal det fremtidige arbejde fokusere på klinisk relevante prøver, hvor prædiktive markører udtrykt i præ-kræft væv kan identificeres til yderligere validering.

Materialer og metoder

Valg af microRNA

undersøgt i dette studie Mirs blev valgt baseret på tidligere observationer i litteraturen (tabel 3). Vi præciseres, at hver microRNA også bør have en eksperimentelt verificeret mRNA mål eller sæt af målgener og mindst en af ​​de forudsagte mål skulle rapporteres som er involveret i onkogenese og progression i cervikale eller andre neoplasmer (baseret på sekvenserne i miRBase database [ ,,,0],41] – [43]). MIR-21 er rapporteret at være overudtrykt i en række kræftformer [29], [44] og henvender udskrifter af

PTEN

[24],

TPM1

[26] og

PDCD4

[14], [31], [32] gener, mens miR-143 er underexpressed i mange kræftformer og mål

ERK5

udskrifter [17], [29], [30]. Både mir-21 overekspression og mir-143 underekspression er blevet observeret i livmoderhalskræft cellelinjer og kliniske prøver [12], [17].

Prøver

Kliniske prøver blev indsamlet fra den Dantec Onkologisk Klinik, Dakar, Senegal fra studier af livmoderhalskræft [45]; alle procedurer undersøgelse blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelserne for University of Washington (Seattle, WA) og University of Dakar (Dakar, Senegal) og informeret skriftligt samtykke blev leveret af undersøgelsens deltagere. Histologiske diagnoser blev produceret på University of Washington, Patologisk Institut, Harborview Medical Center, Seattle, WA af en patolog (NBK). Prøver indsamlet omfattede 142 cervikale biopsier bevaret som FFPE væv blokke. HPV-genotypebestemmelse blev udført som tidligere beskrevet [46], med High-Risk HPV (HRHPV) undertyper HPV16 /18/26/31/33/35/39/45/51/52/53/56/58/59/66 /67/68/73/82 som defineret af Munoz

et. al.

2006 [47]. Kliniske prøver blev grupperet efter histologisk diagnose, med grupper defineret ved behandlingsregimer pr gældende retningslinjer [48]. Normal (HRHPV-) identificerede de kvinder med en normal histologi og et negativt testresultat for HRHPV (

n

= 23). Normal (HRHPV +) angivet de kvinder med en normal histologi og en positiv test for HRHPV (

n

= 21). Mildt dysplastiske CIN1 læsioner (

n

= 15) typisk spontant relatere og kvinder med disse læsioner er som regel følges med gentagelse celleprøve. Kvinder med forstadier CIN2-3 /SNG læsioner (

n

= 51) vil alle blive nævnt for behandling for at forhindre udvikling af invasiv sygdom ICC (

n

= 23). Disse grupperinger tilladt os at afgøre, om de microRNA biomarkører undersøgte kunne identificere forskellige stadier af neoplastisk sygdom, som kræver forskellige kliniske behandling. Gennemsnitsalderen for de 133 forsøgspersoner fra hvem kliniske prøver blev brugt var 44 der spænder fra 29 til 72 år. Alle fire histologiske grupper var frekvens matchet på alder med henblik på at opnå lignende aldersfordeling og midler, som lå mellem 43 og 45 år. Cellelinjer og dyrkningsmedier blev købt fra ATCC og Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA).

microRNA qPCR ekspressionsanalyse

Udvinding af microRNA fra blokke blev udført ved hjælp RECOVERALL Total Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner. Den eneste ændring var, at for cellelinie udvinding blev deparaffination trin udeladt på råd fra Applied Biosystems personale. Revers transkription (RT) reaktioner og kvantitative polymerasekædereaktioner (qPCR) blev udført under anvendelse af MicroRNA TaqMan Reverse Transcription Kit og TaqMan miRNA tests (Applied Biosystems) for mir-21, mir-143 og RNU6B kontrol shRNA. RT og qPCR for RNU6B kontrol shRNA analyse blev udført side om side med de mir-21 og mir-143 reaktioner for hver prøve. En standardkurve blev genereret ved at ekstrahere total RNA fra VK2-celler og udførelse af RT-reaktioner på 10-gange fortyndinger, efterfølgende herunder hver seriel fortynding i hver qPCR løb, gennem hele undersøgelsen.

Immunhistokemi

PDCD4 kanin polyklonale antistof og TPM1 monoklonalt muse-antistof blev købt hos Abcam (Abcam Inc., Cambridge MA, ab51495, ab17784 henholdsvis) blev PTEN monoklonalt museantistof købt fra Dako (Dako Corporation; Carpinteria, CA, klon 6H2.1) Fire- micron sektioner af formalin-fikseret paraffinindlejret væv blev skåret og placeret på Superfrost Plus objektglas. Vævssnittene blev deparaffineret og rehydreret gennem en række graduerede alkoholer. Antigen genfinding blev udført med Tris /EDTA, pH 9,0 puffer i en bordplade autoklav. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% H

2O

2. Primære antistoffer blev varieret for at bestemme den optimale antistofkoncentration resulterer i den mest intense farvning med ingen baggrund. Antistoffer for PDCD4 blev fortyndet 1:2000 og PTEN antistof blev fortyndet til 1:500 og anvendes på hver slide. TPM1 antistof blev fortyndet til 1:100.The objektglas blev vasket i ImmPRESS (Vector Laboratories, Burlingame, CA), blev derefter et anti-muse (for PTEN og TPM1) og et anti-kanin (til PDCD4) IgG polymeriserede reporterenzym anvendt til hvert væv. Farveudvikling blev opnået ved inkubering i diaminobenzidin (Dako). Objektglassene blev modfarvet i hematoxylin (Dako), dehydreret gennem graduerede alkoholer, ryddet i xylen, og dækglas med permanente montering medier. En negativ vævskontrol blev kørt på hvert væv, hvor antistof diluentbuffer blev erstattet af det primære antistof. Desuden blev positive kontrol væv vides at udtrykke det pågældende antigen køres sammen med hver batch af objektglas. PDCD4 og PTEN farvning blev evalueret semikvantitativt ved hjælp af H-score scoringsmetode [49]. Denne metode til kvantificering tager hensyn til farvning intensitet og procentdelen af ​​celler farvning på et bestemt intensitet. Farvningsintensitet blev scoret som 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning), 2 (moderat farvning), 3 (intens farvning). Hver intensitet score blev multipliceret med procentdelen af ​​celler, farvning på dette niveau. De resulterende værdier blev summeret til dannelse af en sammensat score i området fra 0 til 300. PDCD4 og PTEN ekspression blev evalueret i både nukleare og cytoplasmiske rum.

statistiske metoder Salg

Taqman qPCR reaktioner blev udført i tredobbelt redundans og Ct-værdierne konverteres til et forhold med hensyn til RNU6B kontrol. Ikke-cancer kontrol var frekvens alder-matchede til tilfælde med invasiv cancer. Værdier af begge microRNA var log

10-transformeret for at normalisere fordelingen af ​​disse målinger for alle statistiske analyser. ANOVA blev anvendt til at sammenligne alle histologiske grupper i forhold til de kontinuerlige faktorer af interesse. P-værdier er rapporteret som ukorrigeret (

p

u

) og justeret for multipel sammenligning ved hjælp af falske opdagelse satser (

p

en

). Receiver Operating Characteristic (ROC) kurver blev anvendt til at vurdere forudsigeligheden af ​​cervikal sygdomsprogression. Optimale cutoffs blev bestemt til bedst skelne Normal (HPV) kvinder fra kvinder med ICC. En to-sidet 0,05 testniveau bestemmes statistisk signifikans for alle analyser. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS-version 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Tak

Forfatterne vil gerne anerkende Pap Toure, Papa Salif Sow, og Amadou Dembele for deres kliniske arbejde, rekruttering og ledelse af forsøgspersonerne, og indsamling af prøver i Senegal. Desuden vil vi gerne takke Donna Kenney og Limin Hu for deres tekniske bistand til opbevaring, forberedelse og sektionering eksemplar blokke.