PLoS ONE: prækliniske evaluering af 4-Methylthiobutyl isothiocyanat på leverkræft og kræft Stamceller med forskellige p53 status

Abstrakt

isothiocyanater fra planter af ordre

korsblomst-ordenen

betragtes lovende cancer kemoterapeutiske fytokemikalier. Men deres selektive cytotoksicitet på leverkræft er næppe udforsket. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, vi systematisk studeret kemoterapeutisk styrken af ​​4-methylthiobutyl isothiocyanat (MTBITC). Selektiv toksicitet blev undersøgt ved at sammenligne dens virkning på leveren kræftceller og deres kemoterapi subpopulationer til normale primære hepatocytter og lever væv skiver. Derudover er der i en første vurdering blev

in vivo

tolerabiliteten af ​​MTBITC undersøgt i mus. Vækst anholdelse ved G2 /M og apoptose induktion var tydelig i alle

in vitro

kræftmodeller behandlet med MTBITC, herunder populationer med kræft initierende egenskaber. Dette blev fundet uafhængigt af TP53; men celledød blev forsinket i p53 kompromitteret celler i sammenligning med wt-p53-celler, som var sandsynligvis på grund af differentiel BH3 kun genregulering i. e. Noxa og dens antagonist A1. I normale hepatocytter, ingen apoptose eller nekrose kunne påvises efter gentagen administration af op til 50 uM MTBITC. Hos mus, anvendt oralt MTBITC var veltolereret over 18 dages behandling i op til 50 mg /kg /dag, den højeste testede dosis. Afslutningsvis kunne vi viser her, at den dræbende effekt af MTBITC har en klar selektivitet for kræftceller i normale leverceller og dets cytotoksicitet gælder selv for kemoterapi kræft initierende celler. Vores undersøgelse kunne tjene til en bedre forståelse af de kemoterapeutiske egenskaber isothiocyanater på humane lever-afledte cancerceller

Henvisning:. Lamy E, Hertrampf A, Herz C, Schüler J, Erlacher M, Bertele D, et al . (2013) Prækliniske Bedømmelse af 4-Methylthiobutyl isothiocyanat på leverkræft og kræft Stamceller med forskellige p53 status. PLoS ONE 8 (8): e70846. doi: 10,1371 /journal.pone.0070846

Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, England

Modtaget: May 7, 2013; Accepteret: 23 jun 2013; Udgivet: 2 August, 2013

Copyright: © 2013 Lamy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. EL er finansieret af en akademisk bevilling fra den Europæiske Socialfond Fond og Ministeriet for Videnskab, Forskning og Arts Baden-Württemberg, Tyskland. A. B. blev støttet til denne undersøgelse af en bevilling fra Alexander von Humboldt Foundation Fellowship for erfarne forskere. artiklen forarbejdning gebyr Den blev finansieret af den tyske Research Foundation (DFG) og Albert Ludwig University, Freiburg i Funding Programme Open Access-publicering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Torsten Giesemann og Julia Schueler er lønmodtagere i Oncotest GmbH. Denne beskæftigelse ændrer ikke deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er den hyppigste kræftform i fordøjelsessystemet i Sydøstasien og Afrika syd for Sahara; en øget forekomst bliver også bemærket i den industrialiserede verden [1]. Prognosen for patienter med større eller multifokal HCC er fattige, med 5 års overlevelse er mindre end 5% [2]. Dette skyldes primært ikke-modtagelighed over for kemoterapi og strålebehandling ved behandling af HCC og nedsat TP53 funktion er blevet identificeret som vigtig faktor for denne [3]. TP53 er en nøglespiller i vækst anholdelse og apoptose [4] og en af ​​de mest almindeligt muterede tumorsuppressorgener i HCC [5]. Derudover har det koncept, at stærkt behandlingsresistente cancer stamceller (tumor-initierende celler, TIC) spiller en central rolle i patogenesen af ​​HCC sidst optagne meget opmærksomhed. TIC er i stand til selvfornyende, differentiering, og opretholdelse af tumorvækst og heterogenitet. Fælles anticancerbehandlinger såsom stråling og kemoterapi ikke udrydde de fleste meget modstandsdygtig TIC [6]. Således søger efter alternative terapi strategier, som effektivt påvirker disse delpopulationer, og derved overvinde tumor modstand og ikke stole på intakt p53 for cancercelledrab er af allerstørste betydning [7].

isothiocyanater (ITC) fra planter af for

korsblomst-ordenen

i øjeblikket af stor interesse på grund af deres potentielle anvendelse i forebyggelse og behandling af kræft. Talrige undersøgelser viser, at naturligt forekommende ITC og deres syntetiske analoger retard eller hæmme tumorcellevækst, både

in vitro

og

in vivo

[8], [9]. Mere vigtigt blev det vist for nylig, at ITC kan undertrykke aldehyddehydrogenase (ALDH) -positiv TIC af brystet [10] og prostata [11]. Men effekten af ​​ITC mod TIC af andre organer, herunder lever, er endnu ikke fastlagt. Generelt information om cytotoksiske og cytostatiske potentiale ITC på tumorceller i leveren er knappe [12] – [14]. Det er en forudsætning, at potentielle terapeutiske midler udviser lav toksicitet til normal tumor omkringliggende væv, men kun meget begrænsede oplysninger foreligger om virkningerne af ITC på sundt væv. Her beskriver vi den antineoplastiske aktivitet af 4-methylthiobutyl isothiocyanat (MTBITC, erucin) og dens selektive drab af tumorceller og TIC gennem en p53-uafhængig mekanisme. MTBITC er fremstillet af enzymatisk hydrolyse af glucoerucin, isoleret fra raket plantearter (

Eruca sativa Mill

. Og

Diplotaxis tenuifolia L

.). Endvidere er det afledt

in vivo

ved metabolisk reduktion af isothiocyanat sulforaphane, som er karakteristisk for broccoli (

Brassica oleracea

L.). For vores studier, brugte vi et sæt

in vitro

modeller består af HCC cellelinjer, kemoterapi TIC, primære normale hepatocytter og præcisions-cut lever væv skiver (PCLS) stammer fra patienter til at studere kræft selektiv cytotoksicitet MTBITC . Vores resultater blev derefter yderligere underbygget af mekanistiske undersøgelser om forskellen TP53-aktivering på MTBITC behandling. Baseret på vores

in vitro

resultater vi endelig undersøgt tolerabiliteten af ​​MTBITC i en musemodel.

Materialer og metoder

Etisk Statement

Normale hepatocytter var opnået fra patienter efter deres skriftligt informeret samtykke fra Dept. of Surgery, Freiburg University Medical center, Tyskland. Denne del blev godkendt af den etiske komité ved universitetet i Freiburg (Ethik-Kommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg /Etik provision af Albert-Ludwigs-Universität Freiburg). For væv udskæring eksperimenter, human lever og lever tumor resectates blev opnået fra patienter efter deres skriftligt informeret samtykke fra Dept. of General, Visceral Transplant Surgery, University Hospital, Tübingen, Tyskland. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den lokale etiske komité (Ethik-Kommission an Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Etik provision af det medicinske fakultet på Eberhard-Karls-Universitet og University Clinic Hospital Tuebingen). blev udført Dyreforsøg i henhold til retningslinjerne i den tyske Animal Welfare Act (Tierschutzgesetz) og i henhold til tilladelse numre af Regierungspräsidium Freiburg, Tyskland G-10/05 og 35 til 9185,64 /1. Dyresundhed blev undersøgt før randomisering til sikre, at kun dyr uden nogen symptomer på sygdom blev udvalgt til at indtaste testprocedurer. Under forsøgene blev dyrene overvåget to gange dagligt vedrørende generelt tilstand, fødevarer og vandforsyning.

Kemikalier Salg

DMSO, verapamil-hydrochlorid, dexamethason, erysoline, ethanol, propidiumiodid (PI) og neutral rød (NR) er erhvervet fra Sigma Aldrich (Steinheim, Tyskland). Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM), føtalt kalveserum (FCS), trypsin 10 × (25 mg /ml), trypsin-EDTA 10 × (5 mg /ml), Hanks balancerede salt buffer (HBSS uden Ca og Mg) og phosphatbufret saltvand (PBS, uden Ca og Mg) var fra PAA Laboratories GmbH (Coelbe, Tyskland). Penicillin-streptomycin (P /S) opløsning og Hoechst 33342-opløsning (10 mg /ml), RPMI 1640, insulin-transferrin-selen (ITS), Collagenase type IV, og 5,5 ‘, 6,6’-tetrachlor-1 , 1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodid (JC-1) var fra Life Technologies Invitrogen (Darmstadt, Tyskland), WST-1 reagens fra Roche (Mannheim, Tyskland). Accumax blev købt fra eBioscience (Frankfurt, Tyskland), Collagen G fra Schubert Weiss (München, Tyskland), Collagenase CLS II fra Biochrom (Berlin, Tyskland) og EDTA fra Serva Elektroforese (Heidelberg, Tyskland). CaCl

2, Glucose, EGTA, Eddikesyre (renhed 100%), blev Roti®-Phenol /chloroform /Isoamylalkohol og chloroform /Isoamylalkohol erhvervet fra Carl Roth (Karlsruhe, Tyskland), Camptothecin (CPT) fra Tocris (Eching, Tyskland), Caspase 3/7 GLO reagens fra Promega (Mannheim, Tyskland) og Triton X-100 fra Merck (Mannheim, Tyskland). Rompun 2%, og xylazinchloride blev indkøbt fra Bayer (Leverkusen, Tyskland), ketanest 10% og ketaminiumchloride fra Essex Tierarznei (München, Tyskland). 4-methylthiobutyl isothiocyanat (MTBITC, erucin) blev syntetiseret ved Inst. of Organic Chemistry, University of Giessen, Tyskland, som beskrevet før [15]. Valinomycin blev købt fra Fluka, (Buchs, Schweiz). ITC blev opløst i sterilt DMSO.

HCC cellelinier, Isolering og Dyrkning af HCC eksplanteret og Hepatocytter

HCC-cellelinjer.

HepG2 (wt-53) og Hep3B ( null-p53) cellelinier blev opnået fra den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), Braunschweig, Tyskland. Huh-7 celler (mut-p53) oprindeligt oprettet ved Nakabayashi et al. [16] blev venligt stillet til rådighed af H. Blum (University Medical Center Freiburg, Tyskland). Cellerne blev dyrket i lav glucose DMEM suppleret med 15% (HepG2) eller 10% (Huh7, Hep3B) FCS og 1% P /S i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C, indtil 70% konfluens og efterfølgende høstet med trypsin. Cellelinie verifikation blev gjort ved mikroskopisk kontrollere cellernes morfologi og udføre vækstkurve analysen på regelmæssig basis. Kun celler i passage nummer 09:56 blev anvendt. Den cellekultur blev desuden testet negativ for forurening med mycoplasma.

HCC eksplantaterne.

Menneskelig levertumor indpodninger (LIXF, leverkræft xenotransplantat Freiburg), der oprindeligt blev oprettet ved Oncotest GmbH, Tyskland, blev dyrket subkutant i nøgne mus som beskrevet andetsteds [17]. Eksplantater blev sendt til vores laboratorium umiddelbart efter operationen, undgå køling eller andre manipulationer. Proceduren for udarbejdelse kulturer var i overensstemmelse med Patrawala

et al.

[18].

Primære humane hepatocytter.

Normale hepatocytter blev isoleret inden 2 timer. Vurdering af ikke-tumorform leverparenchym blev udført af en højtstående patolog med ekspertise i leveren patologi. Hepatocytter blev isoleret ved hjælp af to-trins collagenase perfusion teknik ifølge en modificeret protokol fra Guguen-Guillouzo

et al.

[19] og Strom

et al.

[20]. Cellerne blev derefter endelig resuspenderet i RPMI-1640 suppleret med 15% FCS, 2 mM L-glutamin 1% P /S, 1% ITS, 100 nM dexamethason og dyrkes i et CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C for 20 timer.

Murine hepatocytter.

Murine hepatocytter var frisk isoleret med en lignende perfusion teknikken beskrevet for humane hepatocytter og dyrkes i et CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C i 10 timer.

Precision-cut Tissue Slicing (PCLS)

Slicing startede inden for en time af resektion på en vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Tyskland) som beskrevet før [21] Skiver blev inkuberet i iltet Williams E medium indeholdende 25 mM glucose og 50 ug /ml gentamycin (Lonza Bioscience, Verviers, Belgien) i en iltet atmosfære (80% ilt, 5% CO

2).

Bestemmelse af Drug Effekt i cancerceller

for eksperimenterne, kræftceller var seedet, suppleret med dyrkningsmedium og inkuberes i 48 timer ved 37 ° C. Efterfølgende blev subsammenflydende cellerne eksponeret for ITC i 24 timer til 96 timer. For eksponering 24 timer, dyrkningsmediet, blev der indeholdt ITC udskiftet hver 24 timer

Påvisning af cytotoksicitet

Neutral rød fastholdelse assay

Den neutrale røde fastholdelse assay.. bestemmer akkumulering af neutralt rødt farvestof i lysosomer af levedygtige, ubeskadigede celler, som blev anvendt som en anden parameter til påvisning af cytostase /cytotoksicitet. Følgende forbindelse eksponering blev cellerne inkuberet i 3 timer med NR farvestof (50 ug /ml) opløst i den tilsvarende dyrkningsmedium. Celler blev derefter vasket forsigtigt med forvarmet PBS og 150 pi fiksering medium (EtOH: AcCOOH: deioniseret vand, 50%: 1%: 49%) blev tilsat efterfulgt af forsigtig rystning i 20 min. Absorbansen blev registreret ved 540 nm ved hjælp af en Tecan mikropladelæser.

Påvisning af apoptose og vækst Arrest

Caspase 3/7 spaltningsbestemmelse.

Induktion af apoptose i cellelinjer og primære celler blev bestemt ved hjælp af Caspase3 /7-Glo assay (Promega, Tyskland) ifølge producentens instruktioner.

apoptose i levervæv skiver blev bestemt ved inkubation med 50 pM

N

acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aminomethylcoumarin (Ac-DEVD-AMC; Biomol, Hamburg, Tyskland) i assaybuffer (50 mM HEPES, pH 7,4, 1% sucrose, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT). Substratet spaltning blev målt kinetisk ved spektrofluorimetri. Caspase 3/7 aktivitet blev bestemt som hældningen af ​​de resulterende lineære regressioner og udtrykt i arbitrære fluorescensenheder minuttet.

Vurdering af mitokondriemembranen potentiale (MMP).

Til påvisning af ændringer i MMP på enkelt celle niveau, den lipofile kation JC-1 blev anvendt som beskrevet andetsteds [14].

SubG1 DNA-indhold og cellecyklusfordeling.

til påvisning af cellecyklusfordeling PI-farvning af DNA efter fiksering blev anvendt, som beskrevet andetsteds [14].

Påvisning af nekrose

propidiumiodid (PI) -optagelse assay.

Bestemmelsen er baseret på kvantificering af PI farvede nekrotiske celler. Derfor, efter forbindelse eksponering, PI (2 ug /ml) blev tilsat til hver brønd af en 96-brønds mikrotiterplade i 5 minutter ved stuetemperatur under kontinuerlig omrystning. Derefter blev pladerne centrifugeret ved 189 g (3 min, RT). Mængden af ​​intracellulær PI fluorescens blev målt ved hjælp af en Tecan mikropladelæser på Ex:.. 525 nm /Em595 nm

LDH frigivelse assay for vævssnit

Den procentdel af laktat dehydrogenase (LDH) frigivelse i supernatanten som surrogat for membranintegritet blev bestemt under anvendelse af LDH Mono-P assay (Analyticon, Lichtenfels, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Mængden af ​​LDH frigives i supernatanten blev bestemt, og normaliseret til proteinindholdet i de enkelte skiver, som blev bestemt ved en Pierce BCA assay (Thermo Scientific, Dreieich, Tyskland).

Isolering og analyse af Side Befolkning (SP ) celler

SP og ikke-SP-celler blev analyseret og isoleret fra Huh7 celler som beskrevet før [22]. Kort fortalt blev Huh7 celler trypsinbehandlet, talt og en million celler /ml resuspenderet i DMEM w /o phenolrødt indeholdende 2% FCS og 10 mM HEPES. Cellerne blev farvet med 20 pg /ml Hoechst 33342 alene eller sammen med verapamil (50 uM) ved 37 ° C i 90 minutter. Derefter blev cellerne vasket en gang med iskold HBSS indeholdende 2% FCS og 10 mM HEPES. Analyse og sortering af SP og ikke-SP-celler blev udført under anvendelse MoFlo (DakoCytomation). Bagefter blev cellerne vasket med HBSS, talt og podet i dyrkningsskåle i yderligere 24 timer. Celler blev derefter eksponeret for MTBITC og efterfølgende anvendt til analyse.

Påvisning af Aldehydedehydrogenase

Ekspression af enzymet Aldehydedehydrogenase (ALDH) blev analyseret under anvendelse af ALDEFLUOR Kit fra StemCell Technologies (Grenoble, Frankrig) ifølge til producentens protokol. Som positiv kontrol, den ALDH inhibitor DEAB, som blev leveret i sættet, blev anvendt.

Cell Migration (scratch) Indhold

ridse assay blev udført som beskrevet andetsteds [23]. Lette mikroskopiske billeder erhvervet for hver prøve blev analyseret kvantitativt ved hjælp af computing software billede J (https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html). For hvert billede, blev afstandene mellem den ene side af bunden og den anden målt. Ved at sammenligne billederne fra tid 0 til det sidste tidspunkt (72 timer) afstanden af ​​hvert scratch lukning blev opnået, og den halve tid til gab lukning beregnet.

Cell Synkronisering af Serum afsavn og DMSO

i cellesynkronisering ved G0 /G1 blev mediet fjernet fra HepG2-celler og erstattes af medium uden FCS i 96 timer. Efter den tid blev cellerne enten eksponeret for DMSO eller MTBITC i yderligere 24 timer i medium indeholdende forskellige FCS-koncentrationer. Cellerne blev derefter høstet og analyseret for deres DNA indhold distribution.

I et andet sæt forsøg blev 2% DMSO tilsat til dyrkningsmediet for vedhængende voksende HepG2-celler i 72 timer. Derefter blev cellerne forsynet med frisk dyrkningsmedium indeholdende enten DMSO eller MTBITC i 24 timer, derefter høstet og analyseret for deres DNA-indhold distribution.

In vivo

tolerabiliteten af ​​MTBITC

Crl: NU-Foxn1mice (nøgne mus) blev købt fra Charles River, Erkrath, Tyskland og opnåede i microisolators i barriere betingelser. Behandling blev udført ved daglig oral sondeernæring med vehikel eller MTBITC suspenderet i køretøjet i 18 dage.

Gene Expression Analyse af p53 ved hjælp af kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev isoleret med RNeasy mini Isolation kit fra Qiagen (Hilden, Tyskland) efterfulgt af et oprensningstrin ved hjælp af RNase-fri DNase kit fra Qiagen (Hilden, Tyskland). I alt 2 ug af RNA fra hver prøve blev anvendt til cDNA-produktion under anvendelse af første streng cDNA syntesekit fra Fermentas (St. Leon-Rot, Tyskland). CDNA-prøver blev derefter fortyndet 1:02 til 01:05 og amplificeret med LightCycler FastStart DNA Master

PLUS SYBR Green I Kit fra Roche (Mannheim, Tyskland). p53 cDNA blev amplificeret under anvendelse af sense 5′-CCTTCCCAGAAAACCTACCA-3 ‘, og antisense 5′-TCATAG GGCACCACCACACT-3′ oligonukleotider, som frembringer en 371 bp fragment. Henvisningen genet beta-mikroglobulin cDNA blev amplificeret under anvendelse af sense 5’-AGGCTATCC AGCGTACTCCA-3 ‘og antisense 5′-ACGGCAGGCATACTCATCTT-3’ oligonukleotider, som frembringer en 248 bp fragment. Alle primerpar cross intron /exon grænser og dermed behøver PCR-produkter ikke repræsenterer genomisk DNA-kontaminering. PCR-betingelserne var: først 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 10 s, 59 ° C i 10 s og 72 ° C i 30 s. Amplifikationsprodukterne blev kvantificeret med softwaren LightCycler 2,0 fra Roche, Mannheim, Tyskland, ved at fremstille en standardkurve under anvendelse af kendte fortyndinger af standard cDNA. At normalisere p53 mRNA-ekspression for prøve-til-prøve forskelle i RNA input, RNA kvalitet, og revers transkriptase effektivitet blev referenceværdien genet beta-mikroglobulin amplificeret parallelt. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Gene Expression Analysis anvendelse af en signaleringsvej Array

RNA-isolering fra 10

6 celler pr prøve blev udført med RT

2 qPCR -Grade RNA Isolation Kit (SABioscience, Frederick, Maryland, USA). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af RT

2 PCR Array First Strand Synthesis Kit (SABioscience, Frederick, Maryland, USA). Kvantitativ real-time PCR af den menneskelige p53 signalvejen RT

2 Profiler ™ Array (katalognr .: PAH’er-027, SABioscience, Frederick, Maryland, USA) blev udført ved hjælp af en MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Munchen, Tyskland). For dataanalyse den webbaserede RT

2 Profiler ™ PCR Array Dataanalyse blev brugt. Data blev analyseret af »2

-ΔΔCt metode ‘ved hjælp af software, der leveres af producenten. For hvert gen, blev fold-change beregnes som forskellen i genekspression mellem to grupper. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit af 3 uafhængige eksperimenter.

Protein Analyse ved immunblotting

Proteinkoncentration blev bestemt som beskrevet af Bradford [24]. For immunoblotting blev 20 ug protein blandet med klar gjort SDS-holdige prøvebuffer, suppleret med 0,5% β-mercaptoethanol. Elektroforese blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Laemmli [25]. Gelen blev derefter overført til en nitrocellulosemembran ved tanken blotting. De uspecifikke bindingssteder blev blokeret med 5% fedtfattig mælk i TBS /T og inkuberet med primære og efterfølgende peberrodsperoxidase (HRP) -mærket sekundært antistof i 1 time eller natten over. Efter antistof inkubering blev proteinerne af interesse detekteres ved kemiluminescens teknik. Et digitalt billede af western blot blev fanget af et CCD-kamera. Størrelse tilnærmelser blev taget ved at sammenligne de farvede bånd til den for et protein standard indlæst under elektroforese. Fremgangsmåden blev gentaget for det strukturelle protein β-actin.

Silencing af p53 ved RNAi

HepG2-celler blev høstet ved trypsination og 2,5 × 10

5-celler blev udsat for omvendt transfektion med Transpass R1 (nr .: M2551S) fra NEB (Frankfurt a. M., Tyskland). For transfektion blev 10 pi TransPass R1 blandet med 240 pi DMEM og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur før tilsætning af siRNA oligomerer (p53 ShortCut siRNA Mix, nr .: N2011S, NEB, Frankfurt a M., Tyskland;. Kontrollere siRNA kat. . ingen sc-37007, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, USA; fluorescein konjugeret kontrol siRNA, nr .: N2100S, NEB, Frankfurt a M., Tyskland) til en slutkoncentration på 25 nM, efterfulgt af en anden inkubationstrin ved stuetemperatur. i 15 minutter blev derefter overført 250 pi transfektion kompleks til hver brønd og HepG2 celler indeholdende DMEM + 15% FCS w /o antibiotika efterfølgende blev inkuberet med komplekset i 24 timer under standard cellekultur betingelser. Cellerne blev derefter vasket to gange med PBS og suppleret med frisk DMEM indeholdende 15% FCS for en anden 24 timer før eksponering for teststoffet i 24 timer.

RT-MLPA og qPCR

RT MLPA blev anvendt til at analysere mRNA-ekspression af Bcl-2-familiemedlemmer. RNA fra HepG2 og Hep3B celler blev isoleret som beskrevet ovenfor. RT-MLPA (MRC Holland, kit RM002, R011-C1) blev udført ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev specifikke mRNA’er omvendt transkriberet til cDNA og bindes af to oligonukleotider følgelig ligerede af en varmestabil ligase. Hver probe giver anledning til et amplifikationsprodukt af unikke længde adskilt ved kapillær sequencer (Genescan). Analyse blev udført med GeneMapper (Applied Biosystems). Summen af ​​alle peak data blev sat til 100% at normalisere for udsving mellem forskellige prøver, og enkelte toppe blev beregnet i forhold til 100%. Analyse af mRNA regulering af Bd-2 og BMF ikke var teknisk muligt.

Dataanalyse

Resultaterne blev beregnet ved hjælp af Graphpad Prism 5.0 software (La Jolla, CA). Den mediane vækstinhiberende koncentration (IC50) blev beregnet efter normalisering af svaret og logaritmisk transformation med følgende ligning: Y = 100 /(1 + 10

∧ ((LogIC50-X) * HillSlope)). Variansanalyse mellem grupperne blev udført ved envejs ANOVA og betydningen af ​​forskellen mellem kontrol- og behandlingsgrupper blev analyseret ved anvendelse af Dunnett multiple sammenligningstest. Forskellene med p ≤ 0,05 (*) eller p≤0.01 (**), blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

cytotoksicitet ITC i Lever tumorceller sammenlignet med normale hepatocytter

Vi bruges NR tilbageholdelse assay til vurdering af MTBITC cytotoksicitet på cancerceller sammenlignet med normale hepatocytter. Dette assay er blevet rapporteret så høj følsom cytotoksicitet parameter [26]. En koncentrationsafhængig levedygtighed tab, som bestemt ved forringet lysosomale NR fastholdelse kapacitet blev observeret i alle testede kræftceller efter MTBITC behandling i 24 timer (figur 1A). I modsætning hertil i humane hepatocytter blev der ikke relevant levedygtighed tab ses inden 24-72 timer behandlet med 50 uM MTBITC (figur 1b). I murine hepatocytter, MTBITC udløste nogle processer udvide neutral-rød akkumulere kapacitet lysosomer efter 72 timers MTBITC behandling (figur 1b). Baseret på resultater afledt efter 24 timers MTBTIC behandling blev IC50-værdierne beregnet ved 23.18 uM (HepG2), 20,89 pM (Huh7), 31,97 pM (Hep3B), 13.11 uM (LIXF), 72.09 (humane hepatocytter) og 47.81 (murine hepatocytter) .

MTBITC behandling selektivt dæmper celle overlevelse af lever tumorceller (a) i forhold til primære hepatocytter (b). Cellernes levedygtighed blev vurderet ved hjælp af NR fastholdelse analysen efter udsættelse for MTBITC for 24-72 timer. Resultaterne blev udtrykt i forhold til kontrol (0,1% DMSO), streger er middelværdi + SD, (antal uafhængige eksperimenter er anført nedenfor figurerne). Positiv kontrol (+), 0,01% Triton X-100. ** ≤p 0,01 sammenlignet med DMSO

Vækst og apoptose induktion i Human HCC Celler og Normal Hepatocytter /PCLS

For at vurdere arten af ​​levedygtighed værdiforringelse observeret i MTBITC-. understregede HCC celler, vi søgte at fastslå, om dette skyldtes i stå i cellevækst, apoptotiske eller nekrotiske processer (figur 2 og 3). Vi analyserede først cellerne for caspase 3/7 aktivering som specifik apoptose markør. Inden 24 timer, MTBITC inducerede betydelig apoptose ved 25 uM, men kun i p53-vægt (HepG2) celler; ingen stigning kunne ses i p53-mut (Huh7) -celler, p53-nul (Hep3B) celler eller LIXF (figur 2a). Normale hepatocytter forblev upåvirket af behandlingen, som undersøgt i humane eller murine celler ved 24 timer (figur 2C). Vi kunne ikke finde nogen tegn på, at MTBITC inducerede en nekrotisk reaktion i maligne eller normale celler, selv ved 50 uM, som bestemt af PI cellefarvning (figur 2b og d). Betingelser for gentagen eksponering (op til 72 timer), som ville være tilfældet under kemoterapi, ikke yderligere bevidstgøre sunde hepatocytter til apoptose (figur 2c) eller nekrose (figur 2d). De bemærkninger i normale hepatocytter blev yderligere kontrolleres ved hjælp af PCLS. Denne

ex vivo

model giver mulighed dækker kompleksiteten af ​​leveren struktur og mangfoldigheden af ​​metaboliske, homeostatiske, endokrine og biotransformation funktioner. Derfor er det bedre afspejler det høje niveau af biologisk organisering af orglet [27]. Eksponering af PCLS til 25 uM MTBITC steg ikke apoptose (figur 2e) eller nekrose (figur 2f) sats i sundt væv, men snarere undertrykt det, sammenlignet med kontrolceller skiver. I modsætning hertil den positive kontrol, 1 pg /ml actinomycin D kombineret med 100 ng /ml TNF inducerede dybtgående hepatisk apoptose (figur 2e).

indvirkning MTBITC på apoptose (a, c og e) eller nekrose (b, d og f) induktion i maligne og raske celler. Distinct apoptoseinduktion blev vurderet ved anvendelse caspase 3/7 aktivitet efter celle behandling med MTBITC i 12 til 72 timer. Positiv kontrol (+): 10 uM CPT eller staurosporin (a, c), 1 ug /ml actinomycin D /100 ng /ml TNF (ActD /TNF) (e). Nekrose induktion blev kvantificeret ved hjælp af specifikke optagelse af PI i isolerede celler (B og D) eller LDH frigivelse fra PCLS (f). Positiv kontrol (+): 0,2% Triton X-100. Resultater blev udtrykt i forhold til opløsningsmidlet (0,1% DMSO). Søjler er gennemsnit + SD, (antal uafhængige eksperimenter er givet nedenfor til tallene. Eksperimenter udført på PCLS blev udført i tre kopier).

G2 /M arrest (a til d) og apoptose (e ) induktion efter behandling af HCC-celler med MTBITC, bestemt ved PI-farvning af DNA og flowcytometrianalyse. blev bestemt Virkningen af ​​MTBITC eller 0,1% DMSO (opløsningsmiddel) efter 24 timer (LIXF) eller 72 timer (HepG2, Huh7, Hep3B). Barer er middelværdi + SD (n = 3).

Vi målte derefter virkningen af ​​MTBITC på cellecyklus. -toppen subG1 blev derved anvendt som apoptose indikator. Efter 24 h udsættelse for MTBITC, en stærk koncentrationsafhængig G2 /M arrest var tydelig i LIXF (figur 3a) og alle HCC-cellelinier testet, men igen uden nogen klare tegn på apoptose i p53-mut eller p53-nul-celler (data ikke vist). Så vores analyse blev udvidet til en periode på MTBITC eksponering 3-dages, som vi allerede havde fastslået, at en langvarig MTBITC behandling ikke øgede skader på raske celler. Som vist i figur 3b-d, G2 /M-blok holdt under ITC behandling og dette var i orden p53-nul-celler p53-mut celler p53-wt celler. Selv inden for 24 timer, har p53-forringet celler ikke undergår celledød, 72 h-behandling med MTBITC udløste apoptose i alle cellelinjer testet (figur 3e).

Effekt af MTBITC om TIC Cells

Derefter undersøgte vi virkningen af ​​MTBITC på kemoresistent SP-celler, isoleret fra Huh7 celler under anvendelse af DNA-bindende farvestof Hoechst 33342 og flowcytometri. I modsætning til HepG2-cellelinien, som indeholdt mindre end 0,3% af SP-celler, den Huh7 cellelinien indeholdt SP-celler i en koncentration på ca. 1,5% og blev derfor anvendt til yderligere eksperimenter (figur 4A). Passende diskrimination SP i Huh7-celler blev udført ved ABC transporter hæmning kontrolforsøg under anvendelse af verapamil (figur 4a), som med held blokeret Hoechst farvestof udstrømning. Karakterisering af de sorterede cellepopulationer viste, at i) evnen af ​​SP-celler til udstrømning Hoechst farvestof er tabt for det meste inden for en uge i cellekultur (figur 4a), som påvist ved reanalyse af sorterede SP-celler. ii) SP celler voksede betydeligt hurtigere end NSP celler under den samme behandling betingelser, som bestemt efter 72 (figur 4b). iii) Migration af SP-celler var højere end for den samlede Huh7 cellepopulation, vurderet af bunden assay (data ikke vist). Migration blev også brugt som en anden parameter til at undersøge det kemoterapeutiske styrken af ​​MTBITC. Som vist i figur 4c, inden for 48 timer, kontrol celler var næsten helt bevæget sig mod åbningen af ​​den nyoprettede gab og lukkede “bunden”. I modsætning hertil etablering af komplet celle-celle kontakt var stadig ikke tydelig efter 72 timer i MTBITC behandlede celler. Bestemmelse af cellemigrering, påviste, at under MTBITC behandling SP-celler nødvendig 44,1 timer til tæt på gab med 50%, kontrolceller 26,2 timer. Ingen narkotika følsomhed forskelle i væksthæmning kunne observeres efter MTBITC behandling mellem SP og NSP-celler (figur 4D). Vores yderligere analyse viste, at MTBITC anholdt non-SP samt SP subfraktioner ved G2 /M og skubbede dem ind programmeret celledød, om end i mindre grad i SP-celler i sammenligning med deres ikke-SP modstykke (figur 4e og f). Derefter undersøgte vi evnen hos MTBITC at reducere mængden af ​​ALDH-positive celler fra HepG2 og Huh7 cellelinier. Som afbildet i figur 4g, MTBITC-behandling resulterede koncentrationsafhængigt i en ophævelse af denne markør;