PLoS ONE: MIR-124 radiosensibiliserer Menneskelig Kolorektal Cancer Cells ved at målrette PRRX1

Abstrakt

En af udfordringerne i behandlingen af ​​patienter med tyktarmskræft er, at disse tumorer viser resistens over for stråling. MikroRNA’er (miRNA) er involveret i vigtige biologiske aktiviteter, herunder kemoresistens og radioresistance. Adskillige undersøgelser har vist, at miRNA spiller en vigtig rolle i sensibiliserende cellulært respons for ioniserende stråling (IR). I denne undersøgelse fandt vi, at miR-124 var signifikant nedreguleret i både CRC-afledte cellelinjer og kliniske CRC prøver sammenlignet med tilstødende ikke-tumor kolorektale væv, MIR-124 kunne bevidstgøre menneskelige kolorektal cancer celler til IR

i vitro

in vivo

. Vi identificerede PRRX1, en ny EMT inducer og stemness regulator som en ny direkte mål for miR-124 ved hjælp af mål forudsigelse algoritmer og luciferaseanalyse. PRRX1 knockdown kunne sensibilisere CRC celler IR sammenlignes med virkningerne forårsaget af MIR-124. Overekspression af PRRX1 i stabilt overeksprimeres-miR-124-cellelinjer kunne redde virkningerne af radiosensitivitet enhancement anlagt af miR-124. På baggrund af disse observationer i betragtning, vi illustreret, at miR-124 kunne øge radiosensitivitet af CRC celler ved at blokere ekspression af PRRX1, som angivet miR-124 kunne fungere som en stor terapeutisk mål for CRC patienter

Henvisning.: Zhang Y, Zheng L, Huang J, Gao F, Lin X, han L, et al. (2014) MIR-124 radiosensibiliserer Menneskelig Kolorektal Cancer Cells ved at målrette PRRX1. PLoS ONE 9 (4): e93917. doi: 10,1371 /journal.pone.0093917

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Januar 3, 2014 Accepteret: 11. marts 2014 Udgivet: April 4, 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Scientific Foundation of China (Grant nr 81.272.507). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald [1]. CRC tilfælde behandles ved et kirurgisk resektion, da det er den eneste helbredende teknik, der er tilgængelige indtil dato. Ikke desto mindre er kolorektal cancer forbundet med høj dødelighed som ca. 30% af patienterne er diagnosticeret, når denne kræften har nået et fremskredent stadium. Disse patienter huser en lokalt fremskreden inoperabel, ikke-metastatisk sygdom, der betegnes som “lokalt avanceret colorectal cancer.” Disse patienter fik chemoradiation terapi. Alligevel grund af den iboende evne af colorektal cancer at blive kemoresistent og radioresistente (RR), har kombineret modalitet terapi ikke universelt forbedre resultaterne. Det er vanskeligt at behandle patienter med lokalt fremskreden kolorektal cancer, fordi disse cancerceller viser resistens over for strålebehandling. Dette er en af ​​de mest udfordrende problemer i behandlingen af ​​colorektal cancer. Derfor er vi nødt til at belyse de molekylære mekanismer der ligger til grund stråling følsomhed eller resistens, da det i sidste ende ville hjælpe os med at forbedre terapeutiske resultater.

Tidligere undersøgelser har bekræftet en sammenhæng mellem radioresistance og ekspression af gener, der inducerer DNA-skader checkpoint respons og stigning DNA-reparation kapacitet [2] – [4]. Selv om sådanne opdagelser har forbedret forståelsen af ​​molekylære mekanismer, der påvirker cellulær radiosensitivitet, er de detaljerede mekanismer, hvormed denne proces reguleres ikke kendt indtil dato.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små (

~ 22 nukleotider

) ikke-kodende RNA-molekyler, der regulerer posttranskriptionel genekspression. Ved at binde med delvist komplementære sekvenser af messenger RNA (mRNA), miRNA target mRNA-molekyler for nedbrydning og /eller inhibere translation og derved reducere ekspressionen af ​​proteiner [5]. Flere eksperimentelle beviser har foreslået, at flere humane sygdomme, herunder kræft er forårsaget på grund af dereguleringen af ​​miRNA [6]. Nogle miRNA modulerer ekspressionen af ​​kendte onkogener eller tumorsuppressorgener, mens andre fungerer som oncomiRNAs eller tumor-suppressor miRNA [7]. Adskillige miRNA er forbundet med patientens overlevelse. Disse miRNA kan være nyttig til at forudsige og ændring anticancerbehandlinger (herunder kemoterapi, strålebehandling, og immunterapi) [8], [9]. I den seneste tid har vi opdaget, at miRNA spillede en vigtig rolle i den cellulære reaktion på ioniserende stråling [10] – [13].

MIR-124 er en hjerne-beriget miRNA, hvilket er betydeligt nedreguleret i mange humane maligne tumorer, herunder glioblastom, gastrisk karcinom, medulloblastom, hepatocellulært carcinom og CRC [14] – [22]. Nylige undersøgelser har vist, at MIR-124 radiosensibiliserer humane gliomceller ved at målrette CDK4 [23]. Men funktionen af ​​miR-124 på radioresistance er næppe forstået indtil dato.

PRRX1 er et nyligt identificeret EMT (epitel-mesenkymale overgang) inducer og stemness regulator [24], [25], som begge som er tæt knyttet til radioresistence [26]. Derudover blev rigelige PRRX1 ekspression korrelerede med dårlig prognose og metastase i CRC tilfælde. Desuden blev rigelige ekspression af PRRX1 også forbundet med dårlige kliniske resultater [27]. Nylige undersøgelser har også vist, at PRRX1 spillet en central rolle i bugspytkirtlen regenerering og carcinogenese [28]. I denne undersøgelse har vi vist, at MIR-124 forøgede følsomhed over for stråling, både i CRC-celler og humane xenograft tumorer. Desuden PRRX1 er en roman, direkte mål for miR-124, der inducerer bestråling modstand. PRRX1 knockdown kunne sensibilisere celler for ioniserende stråling. Desuden ville overekspressionen af ​​MIR-124 forårsage modulering af EMT og stemness gener ekspression, som begge er nært beslægtede med radioresistence. Restaureringen af ​​PRRX1 kunne redde virkninger forårsaget af miR-124. I denne forskningsundersøgelse har vi illustreret, at MIR-124 sensibiliserede colorektale cancerceller til strålebehandling i nogen grad af nedregulere PRRX1. Disse resultater er blevet afsløret for første gang, og dermed illustrerer hvordan miR-124 spiller en central rolle i at fremkalde celler modstand mod ioniserende stråling.

Materialer og metoder

patientprøver

Kliniske CRC prøver blev opnået fra Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Kina. Patienterne havde gennemgået maksimal kirurgisk resektion efterfulgt af strålebehandling og kemoterapi. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra individerne, som deltog i denne undersøgelse. De vævsprøver blev indsamlet og anvendt efter godkendelse fra den etiske komité i Nanfang Hospital.

cellelinjer og reagenser

Menneskelig CRC cellelinjer, herunder SW480, SW620 og LoVo celler blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HCT-116, LS-174T og HT29 blev købt fra Shanghai Cell Biology, University of Chinese Academy of Sciences. Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), som er suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, CA, USA) i en fugtig våd atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C . ANNEXIN V-FITC /7-AAD KIT blev købt fra Beckman Coulter. En fuld-længde PRRX1 cDNA, helt manglede 3′-UTR blev indkøbt fra GeneCopeia (Rockville, MD, USA) og subklonet i den eukaryote ekspressionsvektor pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, USA). Den præ-miR-124-sekvensen blev forstærket og klonet ind pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP konstruktioner (System Biosciences, Californien, USA). Viruspartiklerne blev høstet 48 timer efter transfektion pCDH-CMV-MIR-124 med pakkende plasmid pRSV /pREV, pCMV /pVSVG, og pMDLG /pRRE i 293T-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, USA). PRRX1 Knockdown og kontrol lentivira blev købt fra GENECHEM (Shanghai, Kina). MIR-124 mimic, blev en ikke-specifik miR kontrol, anti-MIR-124, og en ikke-specifik anti-miR kontrol købt fra Thermo Scientific Dharmacon (USA).

RNA-isolering, revers transkription, og kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, USA). For MIR-124, revers transkription og QRT-PCR reaktioner blev udført under anvendelse af et qSYBR-grøn-holdigt PCR-kittet (GenePharma, Shanghai, Kina). U6 snRNA blev anvendt som en endogen kontrol. Forstadiet form af MIR-124 blev amplificeret. Til påvisning PRRX1 mRNA, blev cDNA syntetiseret ud fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse af revers transkription reaktion kit ifølge producentens instruktioner (Promega, USA). Menneskelig GAPDH blev opformeret parallelt som en intern kontrol. De primere blev opført i Supplerende tabel S1. Alle disse prøver blev normaliseret til interne kontroller og fold ændringer blev beregnet gennem relativ kvantificering (2-ΔΔCt).

Western blot analyse

Lige mængder af protein blev løst ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) -membran (Millipore, USA). Membranerne blev blokeret i 5% fedtfri skummetmælk /TBST [20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl og 0,1% Tween-20] ved stuetemperatur i 1 time. Derefter blev de detekteret med primære antistoffer ved 4 ° C natten over. Derefter blev de duppet i 1 time ved stuetemperatur ved hjælp af et passende sekundært antistof. Derefter blev forøget kemiluminescens påvisningsreagenser anvendes (Amersham Pharmacia Biotech, USA). De primære antistof PRRX1was købt hos Abcam (UK). Caspase-3 blev Bcl-2, andγ-H2AX indkøbt fra Epitomics (UK). E-cadherin, ZO-1, vimentin, N-cadherin blev indkøbt fra Becton, Dickinson and Company (USA). GAPDH blev erhvervet fra BOSTER (Kina).

Luciferase Assay

fuld længde PRRX1 3′-UTR blev amplificeret ved PCR og klonet nedstrøms for ildflue-luciferase-genet i pGL3-vektoren (Promega , USA). Vektoren blev betegnet vildtype (wt) 3′-UTR. Den GeneTailor mutagenese System (Invitrogen, USA) blev anvendt til at udføre stedorienteret mutagenese af MIR-124-bindingsstedet i PRRX1 3′-UTR: den resulterende blev opkaldt mutant (mt) 3′-UTR. Disse celler blev transficeret med reporterplasmider og anbringes i 96-brønds plader. Efter inkubering af cellerne i 48 timer blev cellerne høstet og analyseret under anvendelse af dual-luciferase reporter assaysystem (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Luciferaseaktiviteter blev normaliseret ved β-galactosidaseaktivitet. Hvert eksperiment blev udført tre gange.

klongenicitetsassayet og flowcytometri

Et forudbestemt antal celler blev podet i 6-brønds dyrkningsplader. Derefter blev de inkuberet i 24 timer som hjalp i at slå sig ned disse celler. Cellerne blev behandlet med en række IR doser (0, 2, 4, 6 og 8 Gy, Nasatron (Cs-137) strålerøret). Efter inkubering af disse celler ved 37 ° C i 14 dage, blev de vasket to gange med PBS og farvet med krystalviolet-opløsning. Antallet af kolonier indeholdende ≥ 50 celler blev talt under et mikroskop under anvendelse af følgende formel: Plate klon dannelse effektivitet = (antal kolonier /antal celler inokuleret) × 100%. Overlevelse fraktioner (SF) blev beregnet ved normalisering til klædningen effektiviteten af ​​passende kontrolgrupper. Vi anvendte GraphPad Prism (GraphPad Software, LaJolla, CA, USA) til at passe celleoverlevelse kurve i overensstemmelse med en standard lineær-kvadratisk (LQ) model. Derefter opnåede vi værdierne af overlevelse brøkdel af en række IR doser. Der er flere vigtige parametre i denne model som SF2 (overlevende fraktion ved 2 Gy), α (en parameter af DNA-brud forårsaget af et chok) og β (en parameter af DNA-brud forårsaget af to stød).

for at detektere celle apoptose, blev cellerne høstet og farvet under anvendelse af 7-AAD og Annexin-V-FITC. Den flowcytometri data blev analyseret ved hjælp af BD FACS Diva software V6.1.3 (BD ​​Biosciences).

Animal Studies

athymiske nøgne mus (Guangdong Experimental Animal Center) blev anvendt til tumor implantation. Disse mus var omkring 4 til 6 uger gamle. Alle forsøgene dyr strengt forordningerne for administration Anliggender Vedrørende forsøgsdyr den kinesiske nationale retningslinje for dyreforsøg, der er udstedt i 1988. I denne undersøgelse blev alle procedurer, der involverer dyr og deres pleje godkendt og udført af Southern Medical University Institutional Animal Care og brug Udvalg. Cellerne blev høstet ved trypsinisering og vasket to gange med kold serum-frit medium. Derefter blev disse celler resuspenderet i 200 pi serum-frit medium. For xenotransplantattumorer assay 5 × 10

6 SW480-celler blev subkutant injiceret i ryggen af ​​nøgne mus. Efter tumorer blev påvist, blev tumorstørrelsen målt med en skydelære hver tredje dag. At evaluere tumor radioresistance

in vivo

, tumorerne blev bestrålet med en enkelt dosis på 10 Gy IR 11 dage efter injektion. Tumorvolumen blev beregnet under anvendelse af formlen (a x b2) × 0,5, hvor a og b er de lange og korte dimensioner, henholdsvis. Mus blev aflivet 35 dage efter injektion. Derefter blev tumorerne fjernet. Hver gruppe indeholdt 5 mus. Disse høstede tumorer blev afbildet umiddelbart efter aflivning.

Statistisk analyse

Alle værdier er udtrykt i middelværdier ± standardafvigelse. Resultaterne blev analyseret ved anvendelse af ANOVA eller en to-halet Students t-test.

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

MIR-124 Ofte nedreguleret i CRC cellelinjer og væv

Et panel af humane CRC cellelinjer blev kvantitativt analyseret for at bestemme ekspressionsniveauet af mIR-124. Sammenlignet med den normale tyktarmsslimhinde puljet fra tre raske individer, ekspressionsniveauet af MIR-124 var lavere i de seks undersøgte CRC cellelinier. (Figur 1A)

(A) miR-124 blev udtrykt på et betydeligt lavere niveau i seks CRC-cellelinjer i sammenligning med normal colon mucosa puljet fra tre raske individer. Tallet er repræsentativt for tre forsøg med lignende resultater **

P

. 0,01, *

P

0,05. (B) Ekspressionen af ​​MIR-124 i CRC væv og de matchede normale væv blev påvist ved QRT-PCR og normaliseret til den for U6. Data er præsenteret som individuelle prøver (N = 24) med den linje, der angiver den gennemsnitlige niveau.

Desuden undersøgte vi ekspressionsniveauet af miR-124 i CRC prøver og de matchede normale væv. I overensstemmelse med oplysningerne fra CRC-cellelinjer, det gennemsnitlige ekspressionsniveauet af miR-124 var signifikant lavere i CRC specimenscampared til tilstødende normale væv (figur 1B)

MIR-124 sensibiliserer Kolorektal Cancer Cells til strålebehandling

kolonioverlevelse assayet betragtes som en kanonisk standard til bestemmelse radiosensitivitet [29]. Så vi forsøgt at udforske virkningerne af MIR-124 på kolonien overlevelsen af ​​CRC-celler i nærvær af ioniserende stråling. Klongenicitetsassayet Resultaterne bekræftede, at overekspressionen af ​​MIR-124 var meget mere følsomme over for IR end deres modparter (2A og supplerende tabel S2). Det er en veldokumenteret kendsgerning, at kapaciteten af ​​anti-apoptose af cancerceller er tæt forbundet med radioresistance. Endvidere har vi målt IR-induceret apoptose i CRC-celler, som blev transfekteret med MIR-124 efterligner eller miR kontrol. Vi fandt, at når kombination med IR, overekspression af miR-124 væsentligt forbedret den apoptose af celler i CRC celler end i kontrollerne (Fig.2B). Derudover observerede vi, at MIR-124 behandling alene kan falde Bcl-2, og virkningen var meget stærkere når de kombineres med strålebehandling. På den anden side, caspase-3 og phosphorylering af histon H2AX (γ-H2AX) [30], en indikator for den cellulære respons på DNA beskadigelse øges, når cellerne blev enten behandlet med MIR-124 alene eller underkastes en kombineret behandling af miR -124 og strålebehandling (2C). Tilsammen disse observationer illustrerede en synergistisk effekt mellem miR-124 restaurering og IR.

(A) LoVo og SW480 celler stabilt over-ekspressionen af ​​miR-124 blev behandlet med 0, 2, 4, 6, eller 8Gy IR. Overlevelse fraktioner blev beregnet som beskrevet i figur 2A. Resultaterne er præsenteret som middel SD af værdier opnået i 3 uafhængige eksperimenter. Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupperne blev beregnet under anvendelse af Students t-tests. * P 0,05. (B) Apoptose assay viser induktion af apoptose efter MIR-124 overekspression, navnlig kombination med stråling i MIR-124-overeksprimeres cellelinier LOVO og SW480. * P 0,05. (C) repræsentant western blot for virkningen af ​​MIR-124 over-ekspression eller /og stråling (4Gy) på ekspressionen af ​​apoptose og DNA-skade relaterede gener (caspase-3, Bcl-2 andγ-H2AX).

PRRX1 Er et direkte mål for miR-124

Vi udførte en bioinformatik analyse ved hjælp Targetscan og Pictar og forudsagde, at miR-124 kan målrette PRRX1 3’UTR region. Faktisk var der perfekt base parring mellem frø sekvens af modent miR-124 og 3’UTR af PRRX1 mRNA, og disse frø sekvenser blev bevaret på tværs af arter (Fig.3A). For at bestemme hvorvidt 3’UTR af PRRX1 mRNA er et funktionelt mål for MIR-214 i CRC-celler, blev målsekvensen af ​​PRRX1 3’UTR (wt 3’UTR) eller mutantsekvensen (mt 3’UTR) klonet ind i en luciferase reporter vektor (Fig.3E). Derefter blev HEK293-celler transficeret med wt eller mt 3’UTR vektor og MIR-124 efterligner. Resultaterne viste en signifikant reduktion af luciferaseaktivitet sammenlignet med miRNA kontrol (Fig.3E, bane 2 og 3; P 0,05). Aktiviteten af ​​mt 3’UTR vektor blev ikke påvirket af samtidig transfektion med miR-124 (Fig.3E, bane 7 og 8) .Hvad er mere, cotransfektion med anti-miR124 og vægt 3’UTR vektor i HEK293 celler førte til en forøgelse af luciferaseaktivitet (Fig.3E, banerne 4 og 5; P 0,05). PRRX1 ekspression blev påvist ved QRT-PCR og western blot efter modulation ekspressionen af ​​MIR-124 (3B, 3C, 3D). Tilsammen alle disse resultater kraftigt indikerer, at PRRX1 er et mål for miR-124 i CRC celler.

(A) De forventede bindende sekvenser for miR-124 i det menneskelige PRRX1 3’UTR. Seed sekvenser er fremhævet og understreget. (B), (C) og (D) PRRX1 ekspression blev bestemt i kolorektale cancerceller stabilt overudtrykt-MIR-124 og celler transficeret med MIR-124 inhibitorer, eller antimiR-con af real-time PCR og Western blot-analyse. ANOVA og Student t test blev anvendt til bestemmelse af den statistiske signifikans af forskellene mellem grupper. * P 0,05. (E) luciferaseaktivitet assays under anvendelse af en luciferase reporter med vildtype eller mutante humane PRRX1 3’UTRs blev udført efter co-transfektion af MIR-124 efterligner eller inhibitorer i HEK293-celler. Og mt 3’UTR har en markant stigning i forhold til vægt 3’UTR.The søjlediagram viste middelværdien ± SD i tre uafhængige transfektionsforsøg. * P. 0,05

PRRX1 Knockdown giver radiosensitivitet i CRC cellelinier

Stald cellelinjer med shRNA -PRRX1 blev etableret. Den PRRX1 proteinekspression i disse celler blev verificeret ved Western blot-analyse af cellelysaterne med specifikke antistoffer (fig. 4A). Kolonioverlevelse assay blev udført efterfølgende. Det blev konstateret, at de PRRX1-lyddæmpet, overlevende fraktioner af cellulære kolonier faldt meget mere markant sammenlignet med kontrolgruppen, når de blev bestrålet i forskellige IR doser (fig. 4B og supplerende Tabel S3). Apoptose assay viste, at PRRX1 lyddæmpning kombineret med stråling resulterede i langt mere apoptose end i tilfælde, hvor kun en enkelt behandling blev anvendt (Fig.4C), hvilket indikerer en synergistisk effekt. Western blot-assay viste, at når de kombineres med stråling, PRRX1 silencing forårsagede en signifikant nedregulering af Bcl-2-niveau, men en opregulering af caspase-3-ekspression andγ-H2AX (fig. 4D).

(A ) Western blot analyseret PRRX1 indblanding effektivitet i LOVO og SW480 celler (B) den kvantificering af antallet dannet af CRC-celler, der blev stabilt inficeret med tom vektor lentivirus (kontrol shRNA) og PRRX1-shRNA lentivira (PRRX1 shRNA) eller uden lentiviral infektion ( ubehandlet). (C) Den Annexin-V-assay af apoptose for PRRX1 knockdown celler sammenlignet med kontrolcellerne * p. 0,05. (E) repræsentant western blot for virkningen af ​​PRRX1 knockdown eller /og stråling (4Gy) på udtrykkene for apoptose gener (caspase-3, Bcl-2 andγ-H2AX).

Tvungen ekspression af PRRX1 Gendanner virkningerne af miR-124 på radiosensitivitet

for at belyse, om effekten af ​​miR-124 på radiosensitivitet blev formidlet af undertrykkelse af PRRX1 blev pcDNA3,1-PRRX1 transficeret i miR-124-overudtrykte celler. PRRX1 ekspression blev verificeret ved Western blot (Fig.5A). Resultaterne viste, at PRRX1could redde virkningerne af MIR-124. Klongenicitetsassayet og celle apoptose foreslog, at ektopisk udtryk for PRRX1 væsentligt reduceret miR-124-induceret radiosensitivitet (Fig.5B og supplerende TableS4, Figure.5C). Western blot-analyse også indiceret PRRX1 kan genoprette ekspressionen af ​​caspase-3 og Bcl-2, som blev udløst af MIR-124 (Fig.5D). Disse observationer indikerede, at MIR-124 sensibiliserede celler IR ved nedregulering af ekspressionen af ​​PRRX1.

(A) PRRX1 ekspression blev påvist ved western blot efter transfektion pcDNA3.1-PRRX1 til MIR-124-overudtrykte celler. (B) Celler blev efterfulgt af behandling som beskrevet i figur 2A. Overlevelse fraktioner blev beregnet for hver gruppe. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse af værdier opnået i 3 uafhængige eksperimenter. ANOVA eller Student t-tests blev anvendt til at bestemme den statistiske signifikans af forskellene mellem grupper. Statistisk signifikans (*

P

0,05) er indiceret vs LV-con og miR-124 gruppe. (C) repræsentant western blot for virkningen af ​​PRRX1 genopretning eller /og stråling (4Gy) på udtrykkene for apoptose gener (caspase-3, Bcl-2 andγ-H2AX).

ektopisk PRRX1 vender udtryk for EMT og stemness-relaterede gener i stabilt miR-124-overeksprimeres cellelinjer

i de seneste forskningsundersøgelser, blev det konstateret, at PRRX1 inducerer EMT og fremmer stemness fænotype i CRC-cellelinjer [27]. I de seneste forskningsundersøgelser, er det blevet rapporteret, at EMT er associeret med cancer stamceller. Endvidere tabet af E-cadherin og den efterfølgende EMT fremmes radioresistance i humane tumorceller [31] – [33]. Nylige undersøgelser har knyttet CSC fænotype til tumorceller undergår EMT, som illustrerer det komplekse forhold mellem EMT og CSCS [34] – [40]. Vi spekulerer på, om miR-124 medfører denne effekt ved at nedregulere PRRX1.Thereafter vi transficeret pcDNA3,1-PRRX1 i miR-124-overeksprimeres CRC cellelinjer SW480 og LOVO. Western blot analyse viste, at PRRX1 kunne ændre ekspressionen af ​​EMT og stemness gener forårsaget af overekspression af MIR-124 (fig.6).

Western blot analyserede EMT-relaterede gener som E-cadherin, ZO -1, vimentin og N-caherin og stemness gener såsom ABCG2, SOX2 og Oct4 i miR-124-transfekteret celler og miR-124-PRRX1 co-transficerede celler sammenlignet med kontrolgruppen. Data antydede overekspression af MIR-124 kunne nedregulere vimentin, N-cadherin, ABCG2, SOX2 og Oct4 ekspression og opregulere E-cadherin, ZO-1 ekspression, mens overekspression af PRRX1 kunne redde denne effekt.

In vivo tumor xenograft radiosensitivitet Assay

for at bestemme om miR-124 sensibiliserer tumorer til IR

in vivo

, vi bestrålede tumor område lige én gang ved hjælp af en dosis af 10 Gy 11 dage efter injektion. Trods der fik samme dosis af stråling (d11,10Gy) (Fig.7A, 7B), størrelsen af ​​xenotransplantater afledt af MIR-124-overudtrykte celler var meget mindre end dem, der hidrører fra kontrolbehandlede celler. Disse resultater viste, at miR-124 forårsagede en

in vivo

sensibilisering af tumorer for stråling.

(A) Over-ekspressionen af ​​miR-124 sensibiliserede SW480 tumorxenoplantater IR in vivo. Tumor størrelser blev målt med skydelære og bestråling blev leveret til tumorer område, den ellevte (IR: 10Gy, d11). (B) De volumen kurver xenografter genereret af LV-con, LV-miR-124, LV-con + Radiation, LV-miR-124 + Radiation. (

s

0,05).

Diskussion

I CRC klinisk ledelse, en erhvervet og iboende radioresistance er en udfordrende hindring. Vi er nødt til at foretage flere forskningsundersøgelser til at løse denne udfordrende problem. Købet af radioresistance er en kompliceret proces, der involverer overekspression af DNA reparation proteiner [41], [42], afvigende aktivering af flere signalveje [43] – [45], angiogenese [46], [47], cancer stamceller [48], og autofagi [49], [50]. Adskillige tidligere undersøgelser forskning har vist, at miRNA var tæt relateret til tumor radiosensitivitet. Dette skyldes, miRNA har evnen til at øge eller mindske radiosensitivitet af tumorer [8], [23], [51] – [54]. Eftersom miRNA har evnen til at regulere flere onkogene processer som respons på terapi, må vi undersøge den rolle, miRNA i strålingsmodstand. Resistens over for IR har bidraget til behandling udfordringer i patienter led af CRC. Således forstå de molekylære mekanismer, der ligger stråling følsomhed og modstand er fortsat en vigtig udøvelse.

I denne undersøgelse fandt vi, at MIR-124 blev nedreguleret i begge CRC-afledte cellelinier og kliniske CRC prøver sammenlignet med normale væv. For at få et indblik i funktionen af ​​miR-124, vi udførte

in vitro

eksperimenter og humane xenografundersøgelser. Disse undersøgelser har vist, at overekspression af miR-124 kunne radiosensitize CRC celler og miR-124 knockdown induceret celle modstand mod bestråling.

Vi identificerede PRRX1 var et direkte mål for miR-124 ved luciferaseanalyse. For yderligere at vise funktioner PRRX1 cell radiosensitivitet konstruerede vi stabile PRRX1-knockdown cellelinier LoVo og SW480 og fandt, at PRRX1 knockdown induceret celle følsomhed for bestråling på en måde, der ligner den virkning, der fremkaldes ved overekspression af MIR-124. Desuden PRRX1 opregulering reddet virkningerne af MIR-124-overekspression på radiosensitivitet af celler. Disse resultater indikerer, at virkningen af ​​MIR-124 på celle følsomhed for bestråling delvist medieres ved at undertrykke ekspressionen af ​​PRRX1. Som tidligere rapporteret, PRRX1 induceret EMT og forbedret selvforny egenskaber. Vores resultater antyder, at opregulering af MIR-124 forøger ekspressionen af ​​epiteliale markører som E-cadherin og ZO-1 samtidig formindskelse af ekspression af mesenchymale markører, såsom N-cadherin og vimentin. Endvidere opreguleringen af ​​MIR-124 førte til en samtidig nedregulering i ekspressionen af ​​stemness-relaterede gener, nemlig ABCG2, SOX2, og Oct4. Desuden kunne overekspressionen af ​​PRRX1 redde virkningen af ​​MIR-124 på EMT ved følge genetiske ændringer. I den seneste tid er det blevet rapporteret, at EMT blev associeret med cancer stamceller. Desuden celler, der undergår EMT viste større radioresistance i humane tumorceller [26], [31] – [33] Under disse observationer i betragtning, vi udledes, at MIR-124 kunne radiosensitize CRC celler ved at nedregulere PRRX1, som er forbundet med EMT og cancer stamceller. Men brug for alle disse observationer, som skal undersøges nærmere og verificeret gennem mere forskning. Vi undersøgte rollen af ​​MIR-124 i reguleringen radiosensitivitet, hvilket kan påvirke kræft biologi og cancerterapi betydeligt. Baseret på disse observationer, vi hypotese, at nedregulering af PRRX1 vendt EMT og samtidig svækket de selv-fornyelse egenskaber celler, som begge er tæt knyttet til radioresistence.

Som konklusion, vi dokumentere, at miR-124 sensibiliserer CRC celler til strålebehandling ved at hæmme PRRX1. Dette indikerer, at MIR-124 er en attraktiv prognostisk /prædiktiv biomarkør, som kan anvendes til at diagnosticere CRC tilfælde. Desuden har vi udviklet en ny tilgang til sensibiliserende radioresistente kræft ved at målrette miR-124.

Støtte oplysninger

tabel S1. Salg Primere for miR-124 og PRRX1 kvantificering

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0093917.s001

(DOC)

tabel S2.

radiosensitivitet parametre efter overekspression af miR-124

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0093917.s002

(DOC)

tabel S3.

radiosensitivitet parametre efter PRRX1 knockdown

doi:. 10,1371 /journal.pone.0093917.s003

(DOC)

Tabel S4.

radiosensitivitet parametre efter overekspression af PRRX1 i miR-124-overeksprimeres cellelinjer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0093917.s004

(DOC)