PLoS ONE: Tast-interaktionen Styrker prostatacancerceller med kollagen I og knoglemarv afledte Stamceller på det indre Cell Level

Abstrakt

Adhæsion af metastaserende prostata carcinomaceller blev kvantificeret for to carcinom model cellelinjer LNCaP (lymfeknude-specifik) og PC3 (knoglemarv-specifik). Ved time-lapse mikroskopi og kraft spektroskopi fandt vi PC3-celler til fortrinsvis at klæbe til knoglemarv-afledte mesenchymal-stamceller (SCP1 cellelinie). Brug af atomic force mikroskopi (AFM) baseret force spektroskopi, den mekaniske mønster af adhæsion til SCP1 celler blev karakteriseret både prostata cancercellelinjer og sammenlignet med et substrat bestående af rent collagen type I. PC3 celler spredes mere energi (27,6 aj) under de tvang de-vedhæftning AFM eksperimenter og viste signifikant mere klæbende og stærkere obligationer i forhold til LNCaP-celler (20,1 AJ). De karakteristiske underskrifter fra udstationeringsprocedurer kraft spor viste, at i modsætning til de LNCaP-celler, PC3-celler synes at udnytte deres filopodia foruden etablere adhæsive bindinger. Tilsammen vores undersøgelse viser klart, at PC3-celler har en overlegen klæbemiddel affinitet til knoglemarvsceller mesenchymstamceller, sammenlignet med LNCaP. Semi-kvantitativ PCR på begge prostata karcinom cellelinjer afslørede ekspressionen af ​​to Col-I bindende integrinreceptorer, α1β1 og α2β1 i PC3 celler, hvilket tyder på deres mulige involvering i specifikke interaktion til substrater. Yderligere forståelse af de nøjagtige mekanismer bag dette fænomen kan føre til optimerede terapeutiske anvendelser rettet mod metastatisk adfærd visse prostatacancerceller retning knoglevæv

Henvisning:. Sariisik E, Docheva D, Padula D, Popov C, Opfer J , Schieker M, et al. (2013) Sondering Samspillet Styrker prostatacancerceller med kollagen I og knoglemarv afledte Stamceller på enkelt celle niveau. PLoS ONE 8 (3): e57706. doi: 10,1371 /journal.pone.0057706

Redaktør: Daniel J. Muller, Schweiziske Føderale Institut for Teknologi Zürich, Schweiz

Modtaget: August 13, 2012; Accepteret: 28 Januar 2013; Udgivet: 5 mar 2013

Copyright: © 2013 Sariisik et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering forudsat af Ministeriet for national uddannelse af Tyrkiet (https://egitek.meb.gov.tr), tysk Excellence Initiative via “Nanosystems Initiative München” (https://www.nano-initiative-munich.de/de/research -områder /) og den tyske forskningsfond (https://www.dfg.de/gefoerderte_projekte/informationssysteme/index.jsp). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en af ​​de mest almindelige maligne lidelser og en førende årsag til kræft dødsfald blandt mænd i Europa. Næsten alle patienter med fremskreden prostatacancer show metastaser i knogler, som ofte er den eneste påviselige site af kræftspredning [1]. Endvidere er prostatacancer i knogler ofte diagnosticeres før detektion af den primære sygdom og når prostatacancerceller inkorporeret i skelettet, kurativ terapi ikke længere er mulig og palliativ behandling bliver den eneste mulighed [2]. Selvom forskere nu er begyndt at forstå mekanismerne i vækst kræft i knogler, er de indledende trin i tumor celle-til-bone interaktioner, der fremmer udvidelsen af ​​metastatisk depositum endnu ikke fuldt forstået. Der er derfor et klart behov for at belyse de faktorer spredning af prostatacancer især til skelettet.

Det er blevet foreslået, at cancermetastase i knogle er resultatet af et komplekst samspil mellem prostatacancerceller med knoglematrixproteiner og med de celletyper, der er bosiddende i knoglevævet, såsom osteoblaster og osteoklaster [3] – [5]. Vi og andre har vist, at prostatacancercellelinie PC3, isoleret fra knoglemarven, har en væsentlig større adhæsion til den store knogle protein collagen type I (Col-I) end prostata-adenocarcinom LNCaP der afledes af en ikke- knogle metastatisk websted [6], [7]. Disse resultater tyder på, at affinitet til Col-I kan være en af ​​de molekylære faktorer, der bidrager til udviklingen af ​​nogle prostata kræftceller i knoglen.

Med hensyn til de cellulære faktorer, bortset fra osteoblaster og osteoklaster, en anden spændende deltager, der er for nylig blevet rapporteret er den celle populationen bosiddende i knoglemarven, betegnes mesenkymale stamceller (MSC). MSC’er er de tidlige forfædre osteoblaster og de kan udvides yderligere og differentieret til specialiserede mesenkymale celler såsom adipocytter, chondrocytter eller osteoblaster in vitro [8]. Kryds et al., 2007, har foreslået, at MSC kan spille en vigtig rolle i at støtte prostatakræft vækst og overlevelse i knoglen [9].

Fra den indledende etablering til den senere udvidelse i knoglen, prostata cancerceller kræver invasiv kapacitet. Nabha et al., 2008 fandt, at MSC’er stimulerede den invasive evne PC3 celler gennem Col-I ved at inducere sekretion af proteasen MMP-12 fra PC3-celler [10]. Desuden en nylig artikel vist, at mesenkymale fibroblaster kan føre kollektive cancer invasion ved at remodeling deres omgivende matrix, og dermed skabe fysiske rum, hvorigennem kræftcellerne simpelthen kan følge [11].

Disse data allerede antyder specifikke cross-talk mellem prostata kræftceller og MSC, men stadig er det ikke klart, om og hvor stærk disse to celletyper kan interagere og hvad kunne være mekanismerne bag denne interaktion. Specifikke molekyler på celleoverfladen kan mediere cellulære interaktioner. Sådanne molekylære interaktioner er blevet målt mekanisk ved at spore den nødvendige kraft til at adskille receptor-ligand-par eller interagerende celler med optisk pincet, den biomembran kraft probe eller atomic force mikroskopi [12] – [14]. Sådanne eksperimenter er ikke kun i stand til at måle molekylære udstationeringsprocedurer begivenheder, men også at probe den mekaniske forankring og forankring af de målte molekyler i cellerne [15] – [17]. Således er hovedformålet med denne undersøgelse var at få nye indsigter i prostatakræft celle-interaktioner med MSC’er med vægt på de mekaniske kræfter, der forekommer på det molekylære niveau. Især kvantificeringen af ​​de adhæsive kræfter mellem prostatacancerceller og matrixproteinet Col-I viste sig at være af afgørende betydning, fordi tidligere studier for at undersøge affiniteten af ​​prostatacancerceller til forskellige matrixproteiner ikke bestemme deres interaktion kraft.

som prostatacancerceller anvendte vi PC3-celler, som har oprindelse fra knoglemarv metastaser og som kontroller, LNCaP-celler, som blev isoleret fra lymfeknudemetastaser. Som mesenkymale stamceller vi brugte en udødeliggjort MSC cellelinie ved navn SCP1 [18], som besidder de typiske MSC funktioner, såsom selv-fornyelse og multipotency og giver mulighed for langsigtet standardiseret analyse. Vi først visualiseret vedhæftningen og formering på prostatacancerceller på MSC monolag af tidsforskydningen fluorescensmikroskopi på flercellede niveau. Derefter, vi kendetegnet de faktiske fysiske kræfter er involveret i enkelte celle-til-substrat kontakter med magt mikroskopi med en AFM: begge prostatacancerceller linjer blev immobiliseret på en AFM cantilever og bringes i kontakt med en Col-I coatet substrat. Endelig har vi målt celle-til-celle adhæsive kræfter mellem PC3 eller LNCaP-prostatacancerceller, der er knyttet til en AFM cantilever, og en mesenchymal stamcelle (SCP1) monolag.

Materialer og metoder Salg

celledyrkning for Time-lapse mikroskopi

PC3 (afledt af knoglemetastase) og LNCaP-celler (afledt af lymfeknudemetastaser) blev opnået fra ATCC (Wesel, Tyskland). PC3 celler blev holdt i RPMI-1640 celledyrkningsmedier (PAA, Cölbe, Tyskland) og 10% FBS (Sigma-Aldrich, München). Den SCP1 cellelinie er en immortaliseret human mesenchymal stamcelle linje fuldstændigt beskrevet i Böker et al. 2008 [18]. LNCaP og SCP1 celler blev dyrket i MEM Alpha GlutaMAX dyrkningsmedier (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) suppleret med 10% FBS. Under rutinemæssig cellekultur blev alle celletyper vokset op til 80% konfluens i T-25 eller T-75 dyrkningskolber og holdt ved 37 ° C i 5% befugtet CO

2. Dyrkningsmediet blev skiftet tre gange om ugen og for celle passage, celler blev løsnet ved behandling med 1x trypsin /EDTA-opløsning (PAA). Udarbejdelsen af ​​cellerne før AFM målinger er beskrevet Bellow i afsnittet “Cell capture”.

Time-lapse mikroskopi og Kvantificering af Cell Vedhæftning

SCP1 celler (10

6 celler ) blev dyrket i 6-brønds skåle til fuld konfluens (som vist i fig. 1C). PC3 og LNCaP-celler blev mærket med 10 pM grønt fluorescerende CFDA farvestof (carboxyfluorescein-diacetat, acetoxymethylester, Invitrogen) og derefter udpladet på de dannede SCP1 monolag (5 x 10

5 cancerceller /brønd). Umiddelbart efter blev mikroskopi billeder indsamlet med 25 minutters mellemrum i mindst 12 timer. I dette tidsrum blev cellerne holdt i et bio-kammer, hvilket giver stabil 37 ° C og 5% befugtet CO2 atmosfære (Pecon, Erbach, Germnay), monteret på en inverteret optisk mikroskop (Axiovert 100, Carl Zeiss Hallbergmoos, Tyskland). Billederne blev taget med et AxioCam MRM CCD-kamera (Carl Zeiss) og ved at bruge manuelt celletalsmåleren redskab for billede J version1.40 software (National Institute of Health, USA) antallet af adhærente celler blev anslået, og vist i procent til indledende celle input på 4 og 12 timer.

(A) Phase-kontrast og fluorescerende mikroskopi af CFDA-mærkede PC3 og LNCaP-celler udpladet på SCP1 monolag i 6-brønds plader. Billeder er taget efter 4 timer. (B) Kvantificering af vedhængende PC3 og LNCaP celler efter 4 og 12 h dyrkning på SCP1 monolag. Procentdelen af ​​adhærente celler blev kvantificeret dels ved manuel tælling af CFDA-mærkede celler med celletalsmåleren værktøjet i Image J software og andet, ved at sammenligne med det oprindelige antal udpladede celler (5 x 10

5 celler /brønd ). I billederne også en lille baggrund af CFDA farvestofpartikler er synlig (mere tydelig i LNCaP billede). Analyserne viste, at allerede ved 4 h PC3 celler helt levet på SPC1 celler, mens LNCaP celler havde en signifikant lavere vedhæftning hastighed 4 t og 12 t. Grafen søjler viser middelværdi ± SD af fire uafhængige forsøg (p 0,0001, uparret t-test). (C) PC og LNCaP-celler (2 x 10

5 celler /brønd) blev dyrket på SCP1 monolag i 6-brønds skåle i op til 8 dage. Fase-kontrast demonstreret dannelsen og udbredelsen af ​​PC3 kolonier (skitseret) på toppen af ​​SCP1 celler mellem dag 1 og 8. I modsætning hertil LNCaP-celler dannede små celleklynger (pile), der ikke ekspanderede men snarere regression på dag 8. (D) Kvantificering af pc og LNCaP celle tal efter 1, 5 og 8 dages dyrkning på SCP1 monolag. Spredningen af ​​PC3 og LNCaP celler blev beregnet ved at fratrække de SCP1 kontrol monolag fra den totale celletal af co-kultur. I lighed med de mikroskopi data, den kvantitative analyse bekræftede, at PC3-celler, men ikke LNCaP var i stand til at dele og udvide på SCP1 celler. Grafen viser gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg for hvert tidspunkt (p 0,0001, uparret t-test).

Cell Proliferation Analyse

SCP1 monolag blev dannet som beskrevet ovenfor og 2 × 10

5 PC3 og LNCaP-celler blev tilsat og efterladt til at ekspandere på SPC1 celler i en periode på 8 dage. Desuden blev flere dyrkningsbrønde kun opbevares med SCP1 celler (

SCP1

mono

) for at blive anvendt som kontroller til kvantificering analyse. De co-kulturer (

PC3

+ SCP1, LNCaP

+ SCP1

) blev overvåget mikroskopisk og fotograferet med AxioCam MRM kamera (Zeiss). På dag 1, 5 og 8 de co-kulturer blev trypsiniseret, og ved hjælp af Neubauer celle tællekammer blev den samlede celleantal anslås. Spredningen af ​​PC3 og LNCaP celler på SCP1 monolag (

PC3

på mono

,

LNCaP

på mono

) blev beregnet som følger:

Immuncytokemi

Før protein belægning, objektglas blev renset med 70% ethanol og derefter autoklaveret. For at kontrollere collagen type I (Col-I)-belægning af objektglas og collagen I udtryk på SCP1 blev dias og SCP1 monolag fremstilles som følger. SCP1 celler blev dyrket på objektglas i to dage for at danne sammenflydende cellemonolag, mens Col-I – coatede objektglas blev fremstillet ved tilsætning af 1 mg /ml Col-I-opløsningen ved 4 ° C natten over. Derefter blev SCP1 monolag og Col-I-coatede objektglas fikseret med ren acetone i 20 minutter ved -20 ° C, skyllet med PBS. Image-iT FX Signal Enhancer (et Invitrogen produkt til reduktion baggrund og signal intensivering af Alexa Flour sekundære antistoffer) blev anvendt i 30 min og blokeret med 10% BSA i 1 time. Musen monoklonalt primære anti-collagen-I-antistof (Sigma) blev påført natten over ved 4 ° C. Dette trin blev efterfulgt af inkubering med det sekundære anti-muse-antistof konjugeret til Alexa Flour 488 i 1 time og den nukleare pletten DAPI i 5 minutter. Sideløbende hermed blev negative kontroller udført ved at udelade primært antistof. Mikrofotografier blev taget med en Axiocam MRM kamera på en Axioskope 2 mikroskop (Carl Zeiss) ved hjælp af 40x objektiv.

AFM Setup

Der blev udført Kraft spektroskopi eksperimenter ved hjælp af en NanoWizard II sammen med en CellHesion modul ( JPK instrumenttyper, Berlin, Tyskland), monteret på en Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland) med en skræddersyet temperatur enhed for 37 ° C. For reduceret indflydelse af omgivende støj blev Axiovert anbragt på en aktiv isolation tabel (Micro 60, Halcyonics, Gottingen, Tyskland) mod vibrationer og hele opsætningen blev anbragt i en 1 m

3 lydisoleret kasse også stabilisere temperaturen af hele eksperiment.

De kraftsensorerne anvendes til kraft-spektroskopi var spidsfrie siliciumnitrid cantilevere med en nominel fjederkonstant på 0,01 N /m (spidsfrie, MLCT’er-O10, Veeco, USA). Disse kraftsensorer med en lav fjederkonstant viste sig at være mest velegnet til celleadhæsions målinger. Især spidsfrie plane overflade tilvejebringer en vedhæftning område for en enkelt celle. Ved belægning denne overflade med celle lim, såsom lektiner (e. G. Concavalin A) eller positivt ladede polymerer (fx polylysin) forskellige celletyper kan være fast og hurtigt fastgjort til sensoren [16], [19], [20]. Prostata kræftceller viste sig at stabilt overholde lysin elektrostatisk og desuden holde deres kugleform hele måling processen snarere end at sprede som på Col-I coatede overflader. Forud for celleadhæsion spektroskopi eksperimenter, kraftsensorerne blev derfor overtrukket med poly-D-lysin (PDL, Millipore, USA) i en opløsning af 100 pg /ml PDL natten over. PDL blev anvendt i stedet for PLL fordi det er mindre nedbrydelig og cellerne ikke tendens til at sprede sig. Fjederkonstanterne af kraftsensorerne blev bestemt individuelt af den termiske støj metoden [21].

Kraft afstande kurver blev optegnet mens piezo rejste i et lukket kredsløb på op til 20 um ved en tilgang hastighed på 7 um /s, indtil en udløser kraft 100pN blev nået, og en tilbagetrækning hastighed på 3 um /s.

Substrat Forberedelser

Vi har brugt kollagen type i (Col-i) overtrukne glas dækglas og SCP1 monolag som substrater for AFM kraft spektroskopi eksperimenter inden for samme kultur parabol låg. For at danne SCP1 monolag blev SCP1 celler dyrket på ubehandlede kultur parabol låg (petriskål 35 × 10 mm, nunc A /S, Roskilde, Danmark) i to dage ved 37 ° C, 5% CO

2. Før anvendelse blev de vasket med og dækket med 1,5 ml frisk serumfrit MEM-Alpha-medium (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) suppleret med 15 mM Hepes (Sigma-Aldrich, Tyskland) resulterer i en CO

2 uafhængige måling medium. For celle til Col-I målinger dækglas (Ø 15 mm vasket i 70% ethanol og destilleret vand) blev coatet med Col-I (100 ug /ml) ved 4 ° C natten over. Forud for celleadhæsions målinger blev Col-I-overtrukne dækglas anbringes oven på SCP1 monolag i dyrkningsskålen låg (som afbildet i fig. 2B). En yderligere dækglas overtrukket med BSA (0,5% vægt /volumen) ved 4 ° C natten over blev anbragt oven på et andet afsnit af SCP1 monolaget og det blev brugt til celleindfangning (se næste afsnit). Dyrkningsskålen låg, der indeholder alle tre typer substrater (BSA, Col-I og SCP-1 monolag) blev derefter monteret på en temperaturreguleret stadium i AFM, og den blev efterladt til at ækvilibrere i 10 minutter i fri luft ved 37 ° C.

(a) fasekontrast billeder af en prostatacancercelle tilknyttet udliggeren (pile) over en SCP1 monolag (til venstre) og et Col-i-coatede objektglas (til højre). Skalaen søjler indikerer 10 um. I nederste venstre hjørne er indsat immunofluorescens billeder. Col-I, mærket med AlexaFluor488 fluorescens farvestof vises i grønne og cellekerner, farvet med DAPI i blåt. (B) Enkelte celler fra to forskellige prostatacancer cellelinier (PC3 og LNCaP) blev immobiliseret til en spidsfrie AFM cantilever (force sensor) for at studere deres interaktion kræfter med den apikale overflade af et SCP-1 monolag (svarende mesenchymstamceller ) eller med Col-I (som repræsenterer knoglematrix). (C) Skematisk oven af ​​dyrkningsskålen låg med en BSA-coatede dækglas (som substrat til fiskeri en blidt injiceret prostatacancercelle) og et Col-I belagte glas dækglas både oven på et monolag af mesenchymstamceller . Til kalibrering og fiskeri en celle, den kraft sensoren besøger BSA slide, til eksperimentet på collagen Col-jeg glider, og for forsøget på mesenkymale celler SCP1 monolag.

Cell Kultur og Cell Capture for force spektroskopi

Celler (LNCaP eller PC3) dyrket til 80% konfluens blev inkuberet i trypsin /EDTA-opløsning (0,02%) i 5 min til 10 min, indtil de frigives fra substratet efter vask med PBS mangler calcium og magnesium . Denne procedure bør fjerne eventuelle matrixproteiner muligvis dækker celleoverfladerne uden at påvirke de integrinreceptorer [22], [23]. Derefter blev cellerne overført med yderligere MEM-Alpha-medium i et centrifugerør. Cellerne blev derefter centrifugeret (1000 rpm, 3 min) før resuspendering af pelleten med frisk MEM-alfa-medium. Cellerne blev efterladt i en inkubator ved 37 ° C i 15 min., Med henblik på at tilpasse dem til måling temperatur på 37 ° C i AFM.

Enten PC3 eller LNCaP celler (cirka. 2 μ

l

indeholdende 100 til 300 celler) blev derefter forsigtigt injiceret på den ikke-klæbende BSA-coatede dækglas for herefter fange en af ​​dem med klæbemidlet PDL-overtrukket cantilever: limen cantilever blev placeret over en af de tydeligvis raske celler (medium størrelse, rund ved normal derimod ingen blærer, ingen andre unormale indikationer i form) på BSA-overtrukne dækglas, og sænkes på en trinvis måde, indtil det var tæt til overfladen af ​​denne celle. Derefter udliggeren blev forsigtigt i holdt kontakt med cellen i et par sekunder, før udliggeren-bundne celle blev løftet lodret med ca. 100 um [24]. Cellen blev tilladt at etablere fast vedhæftning på udliggeren i et par minutter. Nogle celler (ca.. 10%) afviste at klæbe fast til armen snarere hængende løst som bestemt ved forsigtigt at ryste mikroskopet og ser celle farten med den inducerede omrøring. I dette tilfælde cellen blev vasket af udliggeren ved at løfte det ud af væsken og tilbage igen for at fange en ny celle. I tilfælde af faste adhæsion blev cellen anvendes til vedhæftning eksperimenter og overvåges af eksperimentatoren via lysmikroskop billede under hele perioden af ​​målinger.

celleadhæsion kraftmålinger

Cellen immobiliseret af den kraft sensoren blev presset mod enten SCP1 monolag eller Col-i-belagte objektglas med en kontaktkraft på 100 pN. Kontakttiden mellem proben cellen og dens substrat blev sat til 0’er resulterer i en tvungen kontakt effektivt 0,3 s for at begrænse vedhæftning satser (procentdel af kurver med adhæsive hændelser) til et område så lille som muligt. Vedhæftning på under 30% giver en høj sandsynlighed for detektering enkelt molekylære interaktioner [24]. Ved højere vedhæftning satser individuelle uforpligtende skridt tendens til at resultere fra flere molekylære bindinger, der handler parallelt. For at kvantificere forskellene mellem cellelinjer og overflader, blev denne korte kontakttid og lav kontaktkraft af 100pN anvendes i hele hele eksperimenter. Tilbagetrækningskroppen hastighed blev indstillet til 3 um /s som et kompromis mellem hydrodynamisk modstand, hvilket øger med hastigheden (her ved ca. 5 pn) og termisk drift virkninger, som nedsætter med hastigheden. Tilbagetrækningskroppen afstand var sat til 20 um til regnskab for lange tøjr (fig. 2A) og sikre cellen havde adskilt fra substratet fuldstændigt efter hver cyklus. Kraftmålinger på SCP1 monolaget og Col-I blev udført under samme dyrkningsskål, mens der for hver celle immobiliseret på en udligger en ny skål blev fremstillet. Dette resulterede i to forsøg pr dyrkningsskål: Enten en LNCaP-på udliggeren vs. Col-I-coated glas og efterfølgende vs. apikale areal af SCP1 monolag eller et PC3 celle på udliggeren vs. Col-I og derefter vs. SCP1 monolag (fig. 2B). Rækkefølgen af ​​substrater blev også vendt inden for PC3 eksperimenter viser identiske resultater. I hvert forsøg (probing én type celle til én type substrat) mindst 80 kraft kurver blev taget mellem en celle på udliggeren og ét substrat type. Helt, mindst 10 uafhængige forsøg for hver kombination af celle-substrat-interaktioner (LNCaP vs Col-I; LNCaP vs. SCP1; PC3 vs. Col-I; PC3 vs. SCP1) blev udført, hvilket gav mindst 800 kraft kurver pr klasse af interaktion. Under hele eksperimentet, anvendte vi det optiske mikroskop for at overvåge den sfæriske form og den faste fastgørelse af cellen immobiliseret til PDL-overtrukne force sensor (fig. 2A). Endvidere har vi bevist ved langvarige celle-kontakter i 1 min ved 500 pN til Col-I at cellen immobiliseret til den kraft sensoren kan opretholde adhæsionskræfter på mindst 8,5 nN uden at fjerne fra sensoren.

Cell adhæsionskraft Evaluering

for dataanalyse kun tilbagetrækningsaksen dele af tilgang-tilbagetrækning cyklusser blev evalueret. For at opnå karakteristiske kvantitative oplysninger fra kraft afstande kurver, en specialdesignede data evaluering og trin afsløring software [25] blev brugt til at Denoise signalet (sorte linjer i Fig. 3), finder baseline (stiplede linjer i fig . 3), korrekt for hydrodynamisk træk og mulig afdrift og at uddrage følgende parametre:

det laveste datapunkt til venstre markerer kontaktkraft på 100 pN; den hvide stiplede linie repræsenterer baseline skærer tilbageløb kurven ved den sorte cirkel definerer celleoverfladen; den sorte linje er den de-noised signal og de røde kors indikerer opdaget de-vedhæftning trin, hvor vedhæftningen force evaluering finder sted. (A) Kraft kurve fra en PC3-celle interaktion med Col-I til illustration af vedhængningskraften evaluering: Rød pil # 1: trinhøjde på den første de-adhæsion begivenhed i tilbagetrækningskroppen kurve. Den detachement kraft er det absolutte mål fra det røde kryds ned til basislinien; # 2: trinhøjde på den anden de-vedhæftning begivenhed efter en kraft plateau på 0,9 um i længden; # 3: trins positionen for det første de-adhæsion begivenhed; # 4: step positionen af ​​den anden de-adhæsion begivenhed. (For definitioner se celleadhæsion force Evaluering i materialer og metoder afsnit). Karakteristiske kurver fra hver af de fire forskellige typer af eksperimenter er repræsenteret: (B) PC3 på Col-I, (C) PC3 på SCP1 monolag, (D) LNCaP på Col-I og (E) LNCaP på SCP1 monolag

trinhøjde [pN] beskriver forskellen i kraft, der måles før og efter en individuel frigørelse begivenhed, synlige som en kraft trin. Algoritmen identificerer sådant skridt ved maksima i den afledte af denoised signal, overvinde en vis tærskel og markerer det med et lille rødt kryds (se også fig. 3). Det sidste trin i en kraft kurve er den mest pålidelige en siden i modsætning til alle andre (mellemliggende) trin ingen anden forbindelse mellem celle og substrat fortsætter. Derfor det sidste trin er ikke potentielt formindsket af andre obligationer eksisterende parallelt.

vedhæftning sats [%] beskriver den del af kurver med mindst én opdaget force trin.

antal trin beskriver gennemsnitlige antal trin detekteret pr kurve (kun tælle kurver med mindst én opdaget force trin).

trin position [um] beskriver afstanden mellem kontaktpunkt (sort cirkel ved skæringspunktet mellem baseline og spore kurve) og en kraft trin.

arbejde udstationering [aJ] beskriver energi, der spredes i løbet af denne kraft eksperiment ved at integrere området mellem baseline (nul kraft) og trække kurven. (Bemærk:. Dette har ingen trivielle forhold til vedhæftning energi Faktisk hastighed afhængig tyktflydende og plastisk deformation af cellen og cellemembranen selv kraftigt bidrage til arbejdet i løsrivelse langt fra termodynamisk ligevægt).

detachement kraft [pN] beskriver den højeste målte vedhæftning (global maksimum) pr kurve.

peak position [nm] beskriver afstanden mellem kontaktpunkt og hvor blev opdaget detachement vedhæftning kraft.

Alle styrker målt er relative kræfter og således uafhængig af den konstante kraft offset (af 5pN) på grund af hydrodynamisk træk af den kraft sensor bevæger sig med konstant hastighed på 3 um /s.

plateau trin, for dette sæt af data vises efter en kraft plateau på mindst 500 nm længde ved lastning hastigheder på mindre end 2.7pN /s (se trin 2 i fig. 3A).

ved lastning satserne mellem 2,7 og 4,0 pN /s kriteriet var ikke klart nok til at undgå falsk positive eller negative skridt diskrimination.

stejle trin derfor forekomme efter en stigning i kraft på mindst 4,0 pN /s.

Semi-kvantitativ polymerasekædereaktion (PCR)

Den semi-kvantitativ PCR blev udført som beskrevet i Popov et al, 2011 [26]. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra PC3 og LNCaP-celler med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og 1 ug RNA blev anvendt til cDNA-syntese med AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). PCR for integrin α1, α2, β1 og GAPDH (anvendes til normalisering af cDNA input) blev udført med Taq-DNA-polymerase (Invitrogen) i en MGResearch instrument (BioRad, Munich, Tyskland). Primer sekvenser og PCR betingelser er beskrevet i Popov et al, har 2011. Alle PCR-resultater er gengivet tre gange uafhængigt af hinanden.

Statistisk analyse

For at tage højde for de heterogene datasæt to statistiske analyser var anvendt:

først blev en t-test under forudsætning ulige varianser bruges til at analysere vedhæftningen sats, det gennemsnitlige antal trin eller den del af tether-lignende til filopodia-lignende skridt sammenligner de midler indsamlet fra individuelle celler mellem PC3 og LNCaP-celler. Hver gennemsnit af en celle er markeret som et rødt kryds; gennemsnittet af disse midler er indikeret som bar med på middelværdien i fig. 4 A B og fig. 5. For det andet blev en ikke-parametrisk Kolmogorov-Smirnov test uden forudsætninger anvendt til at sammenligne trinhøjde, skridt position, distance kraft og arbejde løsrivelse fra alle kraft kurver mellem PC3 og LNCaP celler. Medianerne er angivet som barer med kvartiler. Hver medianen af ​​en celle er repræsenteret ved et rødt kryds i fig. 4 C og D. Resultater med en p-værdi mindre end 0,05 er markeret som vigtig efter en asterisk.

(A) Procent af force kurver med mindst en de-vedhæftning begivenhed. (B) Antal de-vedhæftning omstændigheder senest et klæbende kurve. Fejlsøjler svarer til standardafvigelsen af ​​middelværdien. En signifikant p-værdi fra en uparret t-test af PC3 data med hensyn til LNCaP data er markeret med * (p 0,05). Gennemsnittet af de enkelte celle er givet ved et rødt kryds. (C) Medianer af højden af ​​individuelle de-adhæsion trin. (D) Medianer af positionen af ​​disse de-adhæsionsbegivenheder. (E) medianerne af løsrivelse kraft. (F) Medianer af arbejdet i distance. Kvartiler er angivet ved dobbelte flag og medianen af ​​hver enkelt celle er givet ved et rødt kryds. Celleadhæsion force data blev erhvervet fra 16 PC3 eller 10 LNCaP celler interagerer med Col-I (1485 og 760 kraft kurver henholdsvis), og 17 PC3 eller 11 LNCaP celler interagerer med SCP1 monolag (1526 og 878 kraft kurver henholdsvis).

midler til den procentdel af de enkelte de-vedhæftning trin repræsenterer typiske kraft mønster af filopodia-lignende trin (faste) og Tether-lignende trin (stribede) for to cellelinjer PC3 og LNCaP. Hver gennemsnit af en celle er repræsenteret ved et rødt kryds. Fejlsøjler svarer til standardafvigelsen af ​​middelværdien. En signifikant p-værdi fra en t-test mellem de forskellige trin i en prostata carcinom-cellelinje er angivet med * (p 0,05).

Resultater Salg

PC3 og LNCaP Adhæsion og spredning i Co-kultur med SCP1

først celleadhæsion blev analyseret ved hjælp af time-lapse billeddannelse til op til 12 timer. CFDA pre-mærket PC3 og LNCaP-celler blev overvåget på en SCP1 monolag og efter 4 timer, de fleste af PC3-celler optrådte spredes på SCP1 monolag mens LNCaP-celler forekom små og runde (fig. 1A). Som vist i fig. S1, PC3-celler dyrket på glas eller Col-I-belagt glas har en lavere planhed formfaktor sammenlignet med LNCaP-celler, hvilket indikerer en højere kapacitet til at sprede. Imidlertid blev form analyse af begge celletyper dyrket på SCP1 monolag ikke gennemføres på grund af risikoen for unøjagtige målinger af området, diameter og volumen på grund af de underliggende celle organer i SCP1 celler. Endvidere ved at udføre kvantitativ analyse på 4 og 12 timer, kunne vi vise, at ca.. 90% af PC3 celler var i stand til at holde sig til SCP1 monolag allerede efter 4 timer, og at deres vedhæftning også forblev tæt på 90% efter 12 h (Fig. 1B). I modsætning hertil LNCaP celler havde lavere vedhæftning til SCP1 (ca.. 25%), som ikke stige markant efter længere dyrkning tid.

For at undersøge PC3 og LNCaP celledeling på SCP1 monolag, vi udførte samarbejde kultur eksperimenter i op til 8 dage. Fasekontrastmikroskopi på dag 1 og 8 demonstreret dannelsen og udbredelsen af ​​PC3 kolonier oven på SCP1cells, hvorimod LNCaP-celler dannede små celleklynger, som ikke ekspanderede men snarere regression i denne periode (fig. 1C).

Fig. Fig.