PLoS ONE: Prognostisk Betydningen af ​​den kombinerede Score af endotel ekspression af Nucleolin og CD31 i Kirurgisk resektion Ikke-småcellet lungekræft

Abstrakte

Nucleolin er impliceret at spille en rolle i angiogenese, en vital proces i tumorvækst og metastase. Forekomsten og kliniske relevans af nucleolin i human ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) forbliver stort set ukendt. I denne undersøgelse udforskede vi ekspressionen og prognostiske implikation af nucleolin i kirurgisk resektion NSCLC-patienter. En kohorte af 146 NSCLC patienter, som gennemgik kirurgisk resektion blev udvalgt til væv microarray. I dette væv microarray blev nucleolin ekspression målt ved immunofluorescens. Farvning for CD31, en markør for endotelceller, blev udført for at markere blodkar. En Cox proportional hazard model blev anvendt til at vurdere den prognostiske betydning af nucleolin. Nucleolin ekspression blev observeret i 34,2% af alle patienter, og 64,1% i høj CD31 ekspression patienter. Det sygdomsfri overlevelse (DFS) var signifikant kortere hos patienter med høj nucleolin (CD31

hiNCL

hi) sammenlignet med patienter med lav tumor blodkar (CD31

loNCL

LO) (5 ys af DFS 24% vs 64%,

s

= 0,002). En sådan forskel blev demonstreret i følgende lagdelte analyser: fase I (

s

0,001), planocellulært karcinom og adenosquamøst celle carcinom (

s

= 0,028), lille tumor ( 5 cm,

s

= 0,008), og kirurgi alene (

s

= 0,015). Multivariat analyse viste endvidere, at nucleolin udtryk uafhængigt forudsagt for værre overlevelse (

s

= 0,003). Denne undersøgelse viser, at nucleolin er forbundet med de kliniske resultater i postoperative NSCLC patienter. Således kan ekspressionsniveauerne af nucleolin give en ny prognostisk markør for at identificere patienter med højere risiko for manglende behandling, især i nogle undergrupper

Henvisning:. Zhao H, Huang Y, Xue C, Chen Y, Hou X Guo Y, et al. (2013) Prognostisk Betydningen af ​​den kombinerede Score af endotel ekspression af Nucleolin og CD31 i Kirurgisk resektion ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (1): e54674. doi: 10,1371 /journal.pone.0054674

Redaktør: Mitsunobu R. Kano, Okayama University, Japan

Modtaget: 16. juli 2012; Accepteret: 17. december 2012; Udgivet: 31 januar 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i. mænd og kvinder [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 85% af alle lungekræft, og det er typisk forbundet med dårlige resultater. Recidivraten af ​​NSCLC er betydeligt høj i patienter med komplet resektion af den primære tumor, hvilket forklarer den højeste cancerrelateret mortalitet i hele verden. For trin I /II NSCLC, tilbagefald sats er omkring 35-67%, og de fem-års overlevelse spænder fra 33 til 63% [2], [3]. De fleste behandlingssvigt skyldes i høj grad til fjerne gentagelser.

Angiogenese er en kritisk proces, tumor udvikling og metastase [4], [5]. Det er blevet påvist, at neoangiogenese er en væsentlig prognostisk faktor for både samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse i lungekræft [6] – [12]. Talrige undersøgelser har målt tumor mikrokar densitet (MVD) ved CD31-farvning. Men sammenhængen mellem MVD og overlevelse hos patienter med lungecancer er stadig uløst [13].

Nucleolin er et allestedsnærværende ikke-histon-protein, der oprindeligt blev isoleret fra nucleolus [14]. Som et multifunktionelt protein, nucleolin spiller fundamentale roller i mange vigtige processer, herunder celleproliferation, ribosom forsamling, rDNA transskription, emballering af præ-RNA, og organisering af nucleolar kromatin [15], [16]. Men akkumulere data viser, at nucleolin dåse shuttle til cytoplasmaet og membranen fra nucleolus [17] – [20]. Selvom nucleolin overvejende er lokaliseret i nucleolus, har det også vist sig, på celleoverfladen af ​​forskellige celletyper i en phosphoryleret form [21]. For nylig blev nucleolin ekspression observeret på overfladen af ​​endotelceller i fremspirende tumor blodkar [22], [23]. I mangel af celleoverfladen nucieolin, endotelcellerne delvist mistet deres motilitet og undlod at danne tubulære strukturer [24]. Som en hidtil ukendt funktionel receptor for endostain, nucleolin er ansvarlig for de potente antiangiogeniske og antitumoraktiviteter af endostain [25], [26]. Tidligere undersøgelser har fundet nucleolin udtryk lokaliseret til de fleste blodkar i xenotransplantattumorer, hvilket tyder på den potentielle inddragelse af nucleolin i tumor angiogenese [23], [26]. Men indtil videre er der i øjeblikket få rapporter, som studerer effekten af ​​nucieolin i human NSCLC.

Baseret på de tidligere undersøgelser af prognostiske biomarkører i NSCLC patienter [27], [28] og inddragelse af nucleolin i tumorangiogenese, vi den hypotese, at nucleolin kan tjene som en vigtig markør for tumor neoangiogenese og er forbundet med en dårlig prognose i begyndelsen NSCLC efter radikal kirurgi. I denne undersøgelse undersøgte vi sammenhængen mellem nucleolinantistof udtryk og clinicopathogical variabler i 146 operable NSCLC patienter.

Materialer og metoder

Patienter

I alt 146 konsekutive NSCLC patienter behandlet med radikal kirurgi fra august 2000 til november 2004 fremsatte Cancer center i Sun Yat-Sen University blev indrulleret i denne undersøgelse. Undersøgelsen blev godkendt af Medical Ethics Committee of Sun Yat-Sen University. Patienter med tidligere historie af maligne sygdomme blev udelukket. Tumor vævsprøver og opfølgende data var tilgængelige for alle omfattede tilfælde. Patientdemografi er anført i tabel 1. Karakteren af ​​tumor differentiering blev bestemt i henhold til kriterierne i World Health Organization. Den patologiske Tumor-Node-Metastase (TNM) status blev vurderet af TNM klassifikation af Den Internationale Union mod Kræft (UICC, 2002). Sygdomsfri overlevelse blev defineret som perioden fra datoen for kirurgi til datoen for sygdomsprogression eller død. Hvis der blev ikke observeret nogen sygdomsprogression eller død i slutningen af ​​opfølgningen blev sygdomsfri overlevelse defineret fra datoen for operationen til den sidste tid af tumor evaluering. Samlet overlevelse blev defineret som perioden fra datoen for kirurgi til dødsdagen eller den sidste opfølgning. Knoglemetastaser tid blev defineret fra datoen for kirurgi til datoen for knoglemetastaser. Hvis der ikke knoglemetastaser blev bemærket i den sidste opfølgning blev knoglemetastaser tid beregnet som intervallet fra datoen for kirurgi til sidste gang tumor evaluering. Startdatoen for neoadjuverende kemoterapi blev ignoreret. Datoen for opfølgende undersøgelse ende var 3. marts 2010. median opfølgning var 70,8 måneder. (Interval: 10.4-114 måneder)

Konstruktion af Tissue Microarrays (TMA)

TMA blev konstrueret ifølge en fremgangsmåde beskrevet tidligere [29]. Kort fortalt er det individuelle donorvævsblok og den tilsvarende hematoxylin og eosin (H 0,05

Resultater

Kohorte Beskrivelse og Kliniske Prædiktorer

De kliniske og patologiske karakteristika for hver patient er anført i tabel 1. Det betyder tumor størrelse var 4,25 cm (interval, 1-12 cm). Sixty af 146 patienter (41%), som blev opereret modtog også kemoterapi eller strålebehandling. Tumor progression blev bemærket i 71 patienter (49%), med fjernmetastaser i 62 patienter og lokalt recidiv i 9 patienter. Fifty-tre patienter (36%) døde under follow-up tid. Den anslåede 5-års sygdomsfri overlevelse sats var 47% (95% CI, 40,7% -59,3%), og 5-års samlede overlevelsesrate var 69% (95% CI, 63,2% -78,7%) for alle 146 patienter. Som forventet, den univariate analyse viste betydelige sammenslutninger af kræft differentiering, tumorstørrelse, N scenen, og patologisk scenen med både sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse. Imidlertid blev behandlingsmodalitet kun forbundet med sygdomsfri overlevelse, men ikke samlet overlevelse (tabel 1).

Nucleolin Expression i NSCLC

Nucleolin blev påvist hos 50 patienter ud af det samlede patient kohorte (34,2%). Yderligere analyse med patologiske faktorer viste, at nucleolin udtryk var signifikant forbundet med store tumorer (≥5 cm) (store versus små: 44,4% vs. 28,3%,

P

= 0,047). Der var ingen signifikante sammenhænge mellem nucleolin og andre faktorer, såsom alder, køn, histologisk undertype, kræft differentiering og patologiske stadier.

Især var høj CD31-ekspression bemærket i 53,2% af hele kohorten (n = 78 ). Nucleolin blev colocalized med den pan-endotel markør CD31 i alle 50 patienter med nucleolin udtryk (64,1%). Imidlertid nucleolin var til stede i andre 28 patienter med CD31-ekspression. Disse fund tyder på en potentiel rolle for nucleolin i udviklingen af ​​tumorangiogenese. Patienterne blev yderligere opdelt i tre grupper baseret på status for nucleolin og CD31-ekspression (figur 1). Dette omfattede høj forekomst af tumor blodkar med nucleolin ekspression (CD31

hiNCL

hi), en gennemsnitlig blodkar antal mere end 10 /bane, og typiske blodkar morfologi bør være indlysende. Endvidere ekspressionsniveauet af NCL på disse tumor blodkar er signifikant højere (mindst 2 gange større gennemsnitlige fluorescensintensitet målt ved Nikon NIS-Elements Software) end basal NCL plan i hele tumoren regionen. Øget samarbejde lokalisering blev også observeret mellem CD31 positive rørformede strukturer og NCL positive områder. Patienterne blev også yderligere opdelt af den høje forekomst af tumor blodkar uden nucleolinantistof udtryk (CD31

hiNCL

lo). Disse kriterier omfatter en tilsvarende høj blodkar tæthed som for CD31

hiNCL

hej gruppe, udtryk niveau af NCL på tumor blodkar ikke var signifikant højere ( 2-fold, betyder fluorescensintensitet) end den basale NCL niveau inden for hele tumorvæv. Desuden sås ingen signifikante forskelle mellem co-lokalisering af CD31 positive rørformede strukturer og NCL positive områder.

Tumoren blodkar og nucleolin blev farvet med anti-CD31 (grøn) og anti-nucleolin (rød) , henholdsvis. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Repræsentative billeder fra de tre grupper blev vist her. (A) CD31

hiNCL

hej, (B) CD31

hiNCL

lo, (C) CD31

loNCL

lo. Scale bar, 50 um.

Med hensyn til lav tumor blodkar (CD31

loNCL

LO), det gennemsnitlige antal blodkar med typiske rørformede struktur skal være mindre end 10 /felt. Disse tumor blodkar bør hverken udtrykke høj nucleolin eller co-lokalisere med CD31 positive skibe. Næppe nogen lavt blodkar density-høj nucleolinantistof udtryk afsnit blev observeret blandt NSCLC sektioner.

univariate Survival Analysis

Vi brugte univariat analyse for at fastslå virkningen af ​​nucleolin udtryk på overlevelsen af ​​NSCLC-patienter med resektable tumorer. Overlevelsen data er præsenteret i tabel 2. Nucleolin udtryk var signifikant forbundet med nedsat sygdomsfri overlevelse (

P =

0,002, figur 2), men påvirkede ikke den samlede overlevelse (

P =

0,841 ). Stratificeret analyse viste en signifikant association af nucleolin udtryk med sygdomsfri overlevelse hos patienter med skællede eller adenosquamøst celle karcinom (

P =

0,028, figur 3), men ikke hos patienter med adenocarcinom (

P =

0,061). Nucleolin udtryk var også forbundet med sygdomsfri overlevelse, når stratificeret efter andre tumor egenskaber, såsom lav differentiering kræft (

P =

0,038, figur 3), median /høje kræft differentiering (

P =

0,01), kirurgisk behandling alene (

P =

0,015), og mindre tumorstørrelse (

P =

0,008, figur 3). Vigtigere, nucleolin haft en betydelig indvirkning på sygdomsfri overlevelse i fase I-patienter (

P

0,0001, figur 3), men ikke hos patienter med stadie II til IIIA sygdom (

P =

0,374). Men der var ingen signifikante forskelle for total overlevelse blandt de tre nucleolin grupper i relation til kliniske og patologiske tumor variabler

HH:. CD31

hiNCL

hej, HL: CD31

hiNCL

lo, og LL: CD31

loNCL

lo

HH:. CD31hiNCLhi, HL: CD31hiNCLlo, og LL:. CD31loNCLlo

Uniltivariate hazard ratio analyse blev anvendt til at vurdere signifikant sammenhæng mellem nucleolin og sygdomsfri overlevelse. Samlet set patienter med nucleolin udtryk (CD31

hiNCL

hi) havde en højere risiko for tilbagefald sammenlignet med patienter med lav tumor fartøjer (CD31

loNCL

lo) (HR = 2,768, 95% CI 1,544 ~4.964,

P

= 0,001). Sammenlignet med CD31

hiNCL

hej gruppe, CD31

hiNCL

lo gruppe havde en lavere risiko for recidiv (HR = 0,568, 95% CI 0.325~0.991,

P

= 0,046). Yderligere analyse viste, at CD31

hiNCL

hej gruppe havde også en største risiko for tilbagefald i følgende undergrupper: planocellulært karcinom og adenosquamøst celle karcinom (HR = 3,907, 95% CI 1.285~7.462,

P =

0,012), lav og median /høj differentiering (HR = 2,363, 95% CI 1.129~4.949,

P =

0,023 og HR = 4,201, 95% CI 1.568~11.253,

P =

0,004 henholdsvis), lille tumor ( 5 cm) (HR = 3,382, 95% CI 1.505~7.603,

P

= 0,003), fase I (HR = 11,371, 95% CI 3.003~43.059,

P

0,001), og kirurgi alene (HR = 3,012, 95% CI 1.345~6.747,

P =

0,007). I disse undergruppe analyser, sammenlignet med CD31

loNCL

lo gruppe, CD31

hiNCL

lo gruppe var ikke forbundet med en højere risiko for tilbagefald, undtagen hos patienter med median eller høj cancer differentiering (HR = 2,826, 95% CI 1.081~7.386,

P

= 0,034). Således kan nucleolin blive en værdifuld markør for at identificere risikoen for recidiv for patienter med tidligt NSCLC.

Multivariate Farer Ratio Analyse

En multivariat overlevelsesanalyse hjælp Cox ‘proportionale hazard model for udvælgelse af de prognostiske faktorer for sygdomsfri overlevelse, herunder ovennævnte klinisk-patologiske parametre og immunofluorescens costaining resultater af blodkar tæthed og nucleolinantistof udtryk niveau, viste, at både nucleolin udtryk på tumor skibe og klinisk fase III er selvstændige faktorer af dårlig prognose for sygdomsfri overlevelse (

P

= 0,003 og

P

0,0001 henholdsvis tabel 3). Men fremskredent stadium, men ikke nucleolinantistof udtryk var en uafhængig prognostisk faktor for samlet overlevelse (

P

0,001 for fase II /III).

Bone metastase er en almindelig komplikation ved NSCLC. De fem-års overlevelsesraten for patienter ‘med knoglemetastaser, og CD31

hiNCL

hej, CD31

hiNCL

lo, CD3l

loNC

lo are72%, 81%, og 82%, hhv. Men hverken CD31

hiNCL

hej eller CD31

hiNCL

lo grupper viste en højere risiko for knoglemetastaser i forhold til CD31

loNCL

lo (

P

= 0,556 og

P

= 0,338, henholdsvis). Høj risiko for knoglemetastaser blev kun observeret hos patienter med fremskreden NSCLC (

P

= 0,014) (data ikke vist).

Diskussion

I denne undersøgelse fandt vi at nucleolin ekspression blev detekteret i 34,2% af NSCLC patienter med operativt fjernede tumorer. Dette kan være forbundet med co-lokalisering af nucleolin og CD31, som er i overensstemmelse med tidligere observationer af nucieolin på tumor endotelceller [23]. Nucieolin også betinget udtrykt på overfladen af ​​endothelceller kun under tumorangiogenese [23]. En mulighed for heterogenitet nucleolin ekspression på celleoverfladen er den lokale variation af endotelcelleproliferation i angiogene læsioner in vivo [24]. Desuden vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), ekstracellulær matrix, og intracellulær motor protein er afgørende for ekspression af nucleolin på overfladen af ​​endotelceller under angiogenese [24]. Disse undersøgelser kan forklare, hvorfor nucleolin er ikke let kan påvises i tumorvæv mangler CD31-ekspression i vores undersøgelse. Men undersøgelser af forholdet mellem MVD og nucieolin udtryk er få, især i ikke-småcellet lungekræft. Prøven størrelse var ikke stor nok til at opdage patienter med lav CD31 og høj nucieolin, og der er behov en større stikprøve for at bekræfte dette forhold. Yderligere forskning er nødvendig med mere følsomme blodkar markører. Desuden observerede vi, at en undergruppe af NSCLC patienter udtrykte CD31 i fravær af nucleolin. For at bestemme om CD31 alene kan tjene som en prognostisk markør i NSCLC, vi inddelt patienterne i tre grupper: CD31

hiNCL

hej, CD31

hiNCL

lo og CD31

loNCL

lo

.

Vi fandt, at nucleolin udtryk kun var forbundet med store tumorer (≥ 5 cm), men ikke med andre patologiske faktorer som køn, alder, eller histologisk klasse. En forklaring kan være, at større tumorer har tilstrækkelig ilt og næring leveret af tumor angiogenese. Især er nucleolin blevet vist at være positivt korreleret med tumorvæksthastighed [24]. I flere nylige undersøgelser, specifikke antagonister af nucleolin udviste anti-tumor aktivitet ved at hæmme tumor angiogenese [23], [26], [30], [31].

Dette er den første undersøgelse for at undersøge den prognostiske værdi af nucleolin udtryk i NSCLC patienter. I multivariat Cox regressionsanalyse blev nucleolinantistof udtryk evalueres som en uafhængig faktor for sygdomsfri overlevelse i NSCLC patienter (HR = 2,414), hvilket antyder, at nucleolin kunne spille en vigtig rolle i tumor tilbagefald proces med NSCLC. Angiogenese er en vigtig begivenhed for tumorinvasion og metastase. Efter tumorfjernelse, pro-angiogene miljø var i stand til at udløse hvilende tumorer til hurtigt vokse [32] – [34]. Dette skyldes sandsynligvis forøget ekspression af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) eller nedsat ekspression af endostatin og angiostatin postoperativt, hvilket kan ændre pro-angiogene kontakt [34], [35]. Den forbedrede angiogenese sammen med optagelse af flere tumorceller i omløb letter således tumormetastaser [6], [36], [37]. Det er veldokumenteret, at forekomsten af ​​neoangiogenese er en vigtig indikator for dårlig prognose for både sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse i lungekræft [6], [7], [9], [11], [38], [ ,,,0],39]. I vores undersøgelse, den vigtigste grund til tilbagefald er en fjern metastase (87,3%), som er nært beslægtet med angiogenese. På den anden side, vi ikke kunne finde, at nucleolin er en prognostisk faktor af den samlede overlevelse. En mulig forklaring er, at patienterne vil modtage forskellige behandlingsstrategier (såsom endostain, bevacizumab) efter sygdomsprogression, hvilket kan påvirke overlevelse prognose.

I yderligere overlevelse analyser, fandt vi, at nucleolin udtryk var signifikant associeret med en nedsat sygdomsfri overlevelse og en høj gentagelse risiko, især i undergrupperne med stadium i, mindre tumor ( 5 cm) og kirurgi alene. Klinisk, en lille brøkdel af neoplasma er ganske aggressiv selv i de tidlige faser, som kan være fatal [40]. I nogle tilfælde kan fjernelse af den primære tumor accelerere tumortilbagevenden lokalt eller systemisk [34], [41], [42]. Derfor kan nucleolin tjene som nyttig markør til at identificere patienter med dårligt resultat, og at vejlede postoperativ behandling i tidlige fase NSCLC.

Bone metastase er en hyppig komplikation af lungekræft. Eksperimentelle observationer antyder, at knogle metastatiske tumorceller har kapacitet til at inducere endotelcelleproliferation, migration samt differentiering [43]. I denne undersøgelse har vi undladt at identificere en sammenslutning af nucleolin ekspression med en høj risiko for knoglemetastaser. En større kohorte kan være nyttigt for yderligere at bekræfte forholdet mellem nucleolin ekspression og knoglemetastaser i NSCLC.

Afslutningsvis vurderer vi for første gang ekspressionen af ​​nucleolin i NSCLC. Vores resultater giver bevis for, at nucleolin er lokaliseret med CD31 i tumorvæv af NSCLC, hvilket tyder nucleolin også findes på overfladen af ​​tumor endotelceller. Vi viser også, at nucleolin udtryk kunne være brug som en negativ prognostisk faktor sygdomsfri overlevelse for NSCLC patienter behandlet med radikal kirurgi. Den prognostiske indikator for nucleolin kunne også anvendes især hos patienter med SCC + ADSCC, trin I, lille tumor, og kirurgi alene, hvilket indikerer, at administrationen af ​​perioperative anti-NL lægemidler, såsom endostatin, kan være nyttige.