PLoS ONE: MicroRNA Underskrifter i tumorvæv Relateret til angiogenese i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

Angiogenese betragtes som et adelsmærke i udvikling af kræft, og anti-angiogenetisk behandling for tiden anvendes i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) patienter. MikroRNA’er (Mirs) er små ikke-kodning, endogene, enkeltstrengede RNA, der regulerer genekspression. I denne undersøgelse sigter vi på at identificere markant ændrede Mirs relateret til angiogenese i NSCLC.

Metoder

Fra en stor kohorte af 335 NSCLC patienter, paraffinindlejrede prøver fra 10 patienter med en kort sygdom specifik overlevelse (DSS), 10 med en lang DSS og 10 normale kontroller blev analyseret. De Mirs blev kvantificeret ved microarray hybridisering og udvalgte Mirs blev valideret af real-time qPCR. Virkningerne af forskellige veje, herunder angiogenese, blev evalueret af Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) afledt af proteinanalyse gennem Evolutionary Relationship (PANTHER). En af de mest interessante kandidat markører, miR-155, blev godkendt af

in situ

hybridisering (ISH) i den samlede kohorte (n = 335) og korrelation analyser med flere kendte angiogene markører blev gjort.

Resultater

128 Mirs var signifikant op- eller nedreguleret; normal versus lang DSS (n = 68) og /eller normal versus korte DSS (n = 63) og /eller lang versus korte DSS (n = 37). Den vej analyse viser angiogenese-relaterede Mirs at blive inddraget i NSCLC. Der var stærke signifikante korrelationer mellem array hybridisering og qPCR validering af data. De markant ændrede angiogenese-relaterede Mirs af stor interesse var miR-21, miR-106a, miR-126, miR-155, miR-182, miR-210 og miR-424. MIR-155 korrelerede signifikant med fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2) i den samlede kohorte (r = 0,17, P = 0,002), men mest fremtrædende i undergruppen med nodal metastase (r = 0,34, P 0,001).

konklusioner

Flere angiogenese-relaterede Mirs ændres betydeligt i NSCLC. Yderligere undersøgelser for at forstå deres biologiske funktioner og udforske deres kliniske relevans er berettiget

Henvisning:. Donnem T, Fenton CG, Lonvik K, Berg T, Eklo K, Andersen S, et al. (2012) MicroRNA Underskrifter i tumorvæv Relateret til angiogenese i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (1): e29671. doi: 10,1371 /journal.pone.0029671

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: Indtil 30. juni, 2011; Accepteret: December 2, 2011; Udgivet: 25 januar, 2012 |

Copyright: © 2012 Donnem et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev udelukkende finansieret af Nordnorge Regional Health Authority (Helse Nord RHF), der er ansvarlig for de offentlige hospitaler i det nordlige Norge. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den største årsag til kræft dødelighed hos både mænd og kvinder, og cirka 80% er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [1]. Trods nye forbedringer i tidlig diagnose og behandling modaliteter, den samlede 5-års overlevelse er på sølle 15%. TNM (Tumor, Nodes, Metastaser) fase er blevet betragtet den vigtigste prognostiske variable så tidligt stadie sygdommen er en forudsætning for fuldstændig kirurgisk resektion er nødvendig for potentiel kur. Behandling svar og bivirkninger fra nye behandlingsmuligheder har været tæt knyttet til forskellige histologiske enheder i NSCLC [2] – [4]. Men målrettede behandlinger rettet mod specifikke cellulære ændringer forudsætter en nøjagtig sub-klassificering af NSCLC, som er stort set uden dagens iscenesættelse og rutinemæssige diagnostiske histopatologiske teknikker [5].

MikroRNA’er (Mirs) er små ikke-kodning, endogene, enkeltstrengede RNA’er, der regulerer genekspression [6] – [9]. Ved at regulere genekspression på en posttranskriptionel niveau, Mirs har en stor indflydelse på en lang række forskellige veje, herunder forskellige veje i forbindelse med udvikling af cancer. Flere undersøgelser har udforsket dereguleringen af ​​forskellige Mirs i NSCLC og deres potentielle onkogene og tumor suppressor funktioner samt deres prognostiske betydning [10] – [20].

Nogle Mirs synes at være involveret i angiogenese [21] – [24]. Angiogenese er en proces med dannelse af nye blodkar fra præ-eksisterende, og spiller en central rolle i tumorudvikling [25]. Angiogene inhibitorer anvendes i NSCLC behandling. Det monoklonale antistof bevacizumab i kombination med kemoterapi er FDA godkendt som en behandlingsmulighed i metastatisk ikke-skællede NSCLC patienter, og mange tyrosinkinasehæmmere rettet angiogene veje er lovende [3], [26].

Den første beviser viser Mirs i reguleringen af ​​angiogenese kom fra Dicer knockout-mus. Dicer er en kritisk enzym i miR syntese. Musene Dicer underskud døde tidligt under udviklingen grund af udtynding af vaskulære vægge og alvorlig desorganisering af nettet af blodkar [27]. Desuden viste en anden murine undersøgelse, at en delmængde af Mirs ændret under den angiogene kontakt blev modsat reguleret som reaktion på anti-angiogenetisk behandling [23].

I en stor umarkeret NSCLC kohorte vi tidligere studeret den prognostiske betydning af flere vigtige angiogene vækstfaktorer og receptorer samt den prognostiske rolle mIR-155 og mIR-126 af

in situ

hybridisering [28] – [38]. Heri vi evaluerede MIR udtryk profiler i NSCLC ved hjælp af væv fra udvalgte patienter fra denne kohorte. Vi havde til formål at identificere interessante angiogenese-relaterede MIR kandidater til yderligere potentiale storstilede og dybtgående undersøgelser.

Resultater

Patienter

Den demografiske, kliniske og histopatologiske variabler i patientgrupperne (lang DSS, korte DSS og kontroller) er vist i tabel 1. den gennemsnitlige DSS var 8,0 (spændvidde 6.5-9.9) måneder og 160,5 (interval 60,5-184,3) måneder i lav og høj DSS-gruppen. Der var fire adenocarcinomer og seks planocellulært karcinom i hver gruppe.

Micro RNA ekspressionsanalyse

Ud af 281 Mirs, Figur 1 viser antallet og fordelingen af ​​128 differentielt udtrykte Mirs betydelige på tværs af forskellige sammenligninger i undersøgelsen (P 0,1 korrigeret for falsk opdagelse sats, FDR). De respektive-up og nedreguleret (-1,1) Mirs er vist i tabel S1. miR-182 var den eneste miR ændres i alle tre kombinationer; normal versus korte DSS, normal versus lang DSS og korte versus lang DSS. En Principal komponent analyse (PCA) (figur 2A) på hele prøven sæt udtryk værdier afslørede, at hovedprincippet komponent i variation adskiller normale prøver fra NSCLC prøver. For at understrege forskellen mellem grupperne af NSCLC tumorprøver en bro delvis mindste kvadraters (PLS) model blev brugt til at udtrække et underrum, hvor gruppen forskellene er mere indlysende end i PCA (figur 2B). Tabel 2 viser de ti Mirs med højeste fold ændring stratificeret i grupperne lange overlevelse versus normal kontrol og korte overlevelse versus normal kontrol. Tabel 3 viser Mirs med højeste fold ændring i kort versus lange overlevelse grupper

Venn-diagram viser antallet af alle differentielt udtrykte miRNA på tværs af forskellige sammenligninger:. Væv fra NSCLC patienter med kort overlevelse versus væv fra NSCLC patienter med lang overlevelse, væv fra normale lunge versus væv fra NSCLC-patienter med langt overlevelse og væv fra normale lunge versus væv fra NSCLC patienter med kort overlevelse. Ud af 281 Mirs evalueret, antallet af forskellen udtrykt Mirs med FDR justeret P. 0,1 (i alt n = 128) af hver sammenligning er angivet

(A) To-dimensionelle PCA af Mirs, afledt fra 20 patienter med NSCLC og 10 vævsprøver fra normale lungevæv, der viser adskillelse af de to prøvegrupperne. (B) Handlingen skildrer komponenter 1 og 2 i PLS model, som bruges overlevelsestid som en scoring kriterier. Analysen klart adskiller vævsprøve grupper for korte og lange overlevelse NSCLC patienter. Alle prøver er farvekodede efter gruppe: Sort: Normale patientprøver; grøn: Prøver fra patienter med kort overlevelse; rød:. Prøver fra patienter med lang overlevelse Vejviser

Pathway analyse

Tabel 4 viser resultaterne fra GSEA. Genet sæt forbundet til 31 angiogenese-relaterede Mirs afslørede den højeste gen indstillet nominel berigelse score (NES = -1,17, nominel p-værdi 0,28, FDR 0). Figur 3 viser varme kort repræsenterer 31miRs forbundet til det angiogene gensæt.

Forskellen i miR ekspression mellem tumorprøver fra NSCLC-patienter med lange (L) og korte (S) overlevelse er vist. MIR udtryk værdier er vist i et spektrum, hvor nedreguleret er blå og opreguleret er rød.

PCR validering

Scatter plots sammenligner microarray hybridisering og qPCR data fra 28 udvalgte Mirs er vist i figur 4. inkluderet Mirs, og data fra alle tre kombinationer (både hybridisering og qPCR) er anført i tabel S2. Der var stærke og signifikant sammenhæng mellem hybridisering og qPCR data: Short versus normal r = 0,81, P 0,001; lang versus normal r = 0,85, P 0,001; kort versus lang r = 0,85, P. 0,001

Sammenligning mellem microarray hybridisering (dLMR, forskel i de gennemsnitlige udtryk niveauer mellem prøve grupper, log2 skala) og qPCR (DDCP, forskel i de gennemsnitlige udtryk niveauer mellem prøve grupper, log2 skala) data, korrelationskoefficient = r (Pearson): (A) lav versus normal r = 0,81, P 0,001; (B) høj versus normal r = 0,85, P 0,001; (C) høj versus lav r = 0,85, P 0,001. I rød; miR-150.

Correlation analyse mellem angiogene markører og miR-155

Vi har tidligere offentliggjort på prognostiske konsekvenser af miR-155 i vores store (335 patienter) NSCLC befolkning [ ,,,0],37]. I denne undersøgelse udforskede vi korrelationen mellem MIR-155 og flere kendte angiogene markører. De samme cut-off værdier som tidligere offentliggjorte blev brugt til FGF2 og miR-155 [33], [37]. Figur S1 viser

situ

hybridisering (ISH) analyse af NSCLC i repræsenterer stærke og svage intensiteter for tumorceller miR-155 udtryk samt negative og positive kontroller. Tabel 5 viser sammenhængen mellem angiogene markører [vaskulær endotelvækstfaktor – A (VEGF-A), blodpladeafledt faktor – B (PDGF-B), HIF-1α og fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2)] og MIR-155. miR-155 korreleret signifikant med FGF2 i den samlede kohorte (r = 0,17, P = 0,002), men mest fremtrædende i undergruppen med nodal metastase (r = 0,34, P 0,001). De krydstabuleringer i tabel 6 og tabel 7 viser sammenhængen og distribution af høj og lav ekspression af FGF2 og miR-155. Vejviser

Diskussion

Til vores viden dette er den første NSCLC miR ekspressionsprofil undersøgelse, der viser et gensæt tilsluttet angiogeneserelaterede Mirs med den største virkning i pathway analyse. I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser, vi observerer betydelige forskelle i MIR-profiler mellem normalt og tumorvæv og mellem prøver fra patienter med en dårlig versus en gunstig DSS. Flere af disse væsentlige ændrede Mirs er forbundet med angiogenese og er interessante kandidat markører for yderligere vurdering. Ved at validere en af ​​disse markører, miR-155, i en kohorte af 335 NSCLC patienter, finder vi denne miR for første gang at være signifikant associeret med den velkendte angiogene markør FGF2.

De store svagheder undersøgelsen i søgningen efter nye kandidat markører er den relativt heterogene studiepopulation og det lave antal patienter indgår i analysen. Mange af resultaterne præsenteret heri er derfor kun grænsesignifikant (eller nogle kun viser en tendens) og yderligere validering i et større NSCLC sæt, som på MIR-155, er en forudsætning for fastere konklusioner. Dette er især tilfældet, når man sammenligner signifikante forskelle mellem tumorvæv (lang versus korte overlevelse), da der generelt er større forskelle mellem tumorvæv og normale kontroller. De fold ændringer er i gennemsnit højere og p-værdier stærkere i tabel 2 (tumorvæv versus normale kontroller) sammenlignet med tabel 3 (lang versus kort overlevelse). Fra et klinisk synspunkt, i hvert fald når det kommer til Mirs som potentielle prognostiske eller prædiktive markører, Mirs med ændret udtryk mellem korte versus lang overlevelse gruppe er af særlig interesse. Vi har derfor undersøgt litteraturen om fire angiogenese relaterede Mirs fra tabel 3 (MIR-106a, MIR-155, MIR-182 og MIR-424) og valideret MIR-155 i et stort sæt af NSCLC-patienter. Ud ønskede vi at fremhæve den potentielle virkning af miR-21, miR-126 og miR-210 fra tabel 2, som der er overbevisende rapporter indikerer disse Mirs at have potentiale effekt i angiogenese. Desuden har vi tidligere vist miR-126 at have prognostisk betydning i vores NSCLC kohorte [38].

Styrkelse vores resultater er stærke og signifikante korrelationer mellem de microarray hybridisering data og de samme Mirs valideret af qPCR. Endvidere er de ændrede MIR udtryk i tumor versus normalt væv er i høj grad i overensstemmelse med tidligere publicerede NSCLC MIR undersøgelser [15] – [17], [20] og som diskuteret i det følgende er der konstant nye litteratur tilsat, understøtter vores kandidat Mirs at være involveret i angiogenese.

Kun få studier har undersøgt effekten af ​​veje relateret til MIR gen mål i NSCLC. Fortolkningen af ​​sådanne analyser er ikke ligetil, da resultaterne er meget afhængige af målværdien gener er forbundet med de Mirs og hvilke Mirs er forbundet til de forskellige veje. Desuden Mirs ofte multifunktionelle og samme miR kan målrette forskellige gener i forskellige veje, og et gen kan i adskillige Mirs. Selvom det ikke er statistisk signifikant, den GSEA varierede angiogenese som den vigtigste pathway i vores NSCLC prøver. Der er flere nye rapporter forbinder specifikke Mirs til angiogenese understøtter vores resultater [23], [24], [39] – [42]. Desuden Raponi et al. har vist, at angiogenese-relaterede fibroblastvækstfaktor (FGF) pathway haft en betydelig gen berigelse i squamous NSCLC [17].

I en omfattende murint undersøgelse, Olson et al. identificerede specifikke mir udtryk signaturer forbundet med trin i tumorigenese og forskellige kendetegnende for kræft, herunder angiogenese [23]. Angiogeneseinhiberende signatur Mirs blev evalueret ved qPCR teknik og defineret som de Mirs væsentligt ændret i normal versus sunitinib-behandlede primære tumorer af 1,3 gange ændring [23]. Sunitinib er en tyrosinkinaseinhibitor målretning vaskulær endotel vækstfaktorreceptor (VEGFR), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGFR) og c-Kit. I overensstemmelse med vores qPCR valideringsresultater, PCR data generelt viser ofte en øget fold ændring i forhold til hybridisering data. Mange af de angiogenese-relaterede Mirs observeret af Olson og medarbejdere er også ændret signifikant i vores materiale [23]. Blandt de mest interessante angiogenese-relaterede Mirs markant ændret i begge undersøgelser finder vi miR-126, miR-155, og miR-21 og miR-424.

MIR-126 er for nylig blevet revideret som en vigtig aktør i angiogenese [43] og Wang et al. viste i en murin model som det øger proangiogene virkninger af VEGF og FGF ved at undertrykke ekspressionen af ​​spred-1, en intracellulær inhibitor af angiogen signalering [44]. MIR-126 er også blevet placeret i den epidermale vækstfaktor-lignende domæne 7 (EGFL7) genet. EGFL7 kan have en vigtig rolle i angiogenese ved at fremme VEGF-signalering og vaskulær integritet [45]. Desuden har vi tidligere rapporteret, at MIR-126-ekspression er signifikant associeret med VEGF-A i NSCLC [38]. Yderligere observerede vi, at den prognostiske virkning af MIR-126 er relateret til histologiske subtyper og nodal status. Desuden ekspressionen og roller af MIR-126 kan være forskellige i forskellige maligniteter [23].

MIR-155 er en af ​​de Mirs mest konsekvent involveret i neoplastisk sygdom [46], men så vidt vides, ikke været relateret til angiogenese før den undersøgelse, som Olson og kolleger [23]. Det er blevet rapporteret at være opreguleret i flere humane NSCLC undersøgelser [15], [17], [20], og nedreguleret i en murin model ved brug af angiogen inhibitor sunitinib [23]. I vores array-data, miR-155 havde tendens til at blive ændret betydeligt mellem de korte og lange overlevelse grupper (tabel 3), og var betydeligt over-udtrykt i tumor versus normalt væv i qPCR validering sæt. Vi har rapporteret den prognostiske betydning af miR-155 at være forbundet med histologiske undertyper og nodal status, men ikke linke disse resultater til angiogene markører [37]. Baseret på disse nye data, vi nu undersøgt, om MIR-155 korreleret med velkendte angiogene /hypoxiske parametre som VEGF-A, PDGF-B, HIF-1α og FGF2. Interessant observerede vi, for første gang, MIR-155 at være signifikant associeret med FGF2 med den højeste effekt i N + NSCLC undergruppe. Selvom FGF2 har flere funktioner, er det en vigtig aktør i angiogenese. Faktisk MIR-155 havde også tendens til at korrelere med VEGF-A i N + undergruppen. MIR-155 var en af ​​de første Mirs at være forbundet med NSCLC udvikling og yderligere undersøgelser vil være vigtigt for at undersøge dens potentiale angiogen funktion.

I denne undersøgelse MIR-21 er signifikant opreguleret i tumor versus normalt væv (tabel 2), støtter tidligere NSCLC rapporter [15], [17], [20], og den observerede nedregulering efter antiangiogen behandling [23]. MIR-21 har også vist sig at være højt udtrykt i endotelceller [24]. I en nylig undersøgelse af Liu et al., Blev MIR-21 overudtrykkes ved transfektion pre-MIR-21 i humane prostatacancerceller og tumorangiogenese blev analyseret under anvendelse kylling chorioallantoiske membran [47]. De fandt, at overekspression af MIR-21 i DU145-celler forøgede ekspression af HIF-1α og VEGF, og induceret tumor angiogenese. De konkluderer, at MIR-21 inducerer tumorangiogenese gennem målretning PTEN, hvilket fører til aktivering af AKT og ERK1 /2 signalveje, og derved forbedrer HIF-1α og VEGF-ekspression. De samme veje er beskrevet som vigtige i NSCLC udvikling samt [48], og yderligere undersøgelser til at tage dette forhold med miR-21 i lungekræft ville være af interesse.

Olson undersøgelse viser miR-424 til at være involveret i angiogenese, da dette miR blev nedreguleret efter sunitinib behandling [23]. Desuden Ghosh et al. har studeret denne miR og beskrevet, at hypoxi-induceret MIR-424-ekspression i humane endotelceller regulerer HIF-α isoformer og fremmer angiogenese [49]. De foreslår yderligere MIR-424 spiller en vigtig fysiologisk rolle i post-iskæmisk angiogenese. I modsætning hertil Nakshima et al. rapporteret nedregulering af miR-424 for at bidrage til den unormale angiogenese via MEK1 og cyclin E1 i senil hemangioma, viser den potentielle væv og iscenesætte specifik virkning af samme miR [50]. I vores undersøgelse blev MIR-424 ikke ændret, når man sammenligner tumor med normalt væv, men var signifikant opreguleret i væv fra patienter med dårlig prognose sammenlignet med væv fra patienter med en gunstig prognose (tabel 3). Der er så vidt vi ved ikke offentliggjort undersøgelse, som har udforsket den prognostiske virkning af MIR-424 i cancer. Men da der er en betydelig miR-424 opregulering i den fattige prognostiske gruppe vil det være af interesse for yderligere at evaluere denne markør i stor skala NSCLC studiet.

En anden væsentlig up-reguleret markør i vores materiale er mIR-210 (tabel 2), som tidligere er blevet relateret til angiogenese [41], [51], [52]. MIR-210 opregulering menes at være et afgørende element i endotelcelle respons på hypoxi og derfor potentielt vigtige i tumorangiogenese. Denne miR er for nylig blevet revideret af Devlin et al. [51] og konkluderede, at MIR-210 er en robust mål for hypoxi-inducerbar faktor, og at der er påvist dets overekspression i en række kardiovaskulære sygdomme og faste tumorer. Hos NSCLC cellelinjer, er MIR-210 rapporteret at mediere mitokondriel ændringer forbundet med modulering af HIF-1-aktivitet [52]. En stor del af den funktionelle og prognostiske virkning af MIR-210 i NSCLC stadig uløst.

MIR-182 er inkluderet i angiogenese pathway i GSEA, dels fordi fibroblastvækstfaktorreceptor substrat 2 (FRS2) er en af ​​dens målgener. FRS2 er en vigtig regulator af fibroblastvækstfaktor pathway, som vi og andre har vist sig at være vigtige i NSCLC progression, potentielt ved at stimulere angiogenese [33], [53]. Interessant MIR-182 var den eneste miR signifikant ændret i alle tre kombinationer som vist på Venn-diagram (figur 1). Dens opregulering i tumor (både fattige og gunstig prognostisk gruppe, tabel 2) i forhold til normalt væv, er i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse fra Raponi et al. [17]. Desuden MIR-182 er betydeligt opreguleret i korte DSS versus lange DSS patienter (tabel 3). Imidlertid Barchack et al. observerede højere miR-182-ekspression i primære tumorer end i de metastatiske lungetumorer, hvilket indikerer, at miR-182 udtryk kan nå et højdepunkt i tidlig fase NSCLC.

Vi observerer den samme tendens for miR-106a, som har været vist sig at være opreguleret under hypoxi i bryst og tyktarmskræft cellelinjer [40]. Som tidligere rapporteret, miR-106a var opreguleret i NSCLC [16], [17], [20]. Vi observerer også sit udtryk til at blive væsentligt forøget i tumorer versus normale kontroller (tabel 2). Som for miR-182, blev miR-106a yderligere forøget i væv fra patienter med en kort overlevelse frem for lange overlevelse (tabel 3).

Som forventet mange Mirs vides at være forbundet med angiogenese blev ikke ændret signifikant i vores undersøgelse. Cluster miR-17-92 (miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a og miR92-1), lad-7, lad-7f, miR- 27b, mIR-15b, mIR-16, mIR-92a, mIR-99a, mIR-130a, mIR-214, mIR-221, mIR-222 og mIR-296 samt nogle af de Mirs præsenteres i varmen kortet ( figur 3), blev ikke ændret signifikant, eller de udstillede kun mindre fold ændringer [24], [39], [41], [42]. Denne mangel på væsentlige ændringer kan skyldes falske negative resultater, som der er få patienter i hver gruppe. Som mange Mirs synes at være vævs- og fase specifik, kan nogle af disse Mirs alternativt udøve en virkning begrænset til undergrupper af reseceret NSCLC eller være vigtige i andre maligniteter.

Angiogene inhibitorer i kombination med kemoterapi er etableret som NSCLC behandling, men en yderligere viden om biologi, effektorer mekanismer og prognostiske og prædiktive markører er berettiget. Mirs er stabile og potentielt måles i både væv og serum. Adskillige Mirs er forbundet med angiogenese, og denne undersøgelse understøtter den antagelse, at en række angiogeneserelaterede Mirs er potentielt vigtige i NSCLC progression. Vi foreslår miR-21, miR-106a, miR-126, miR-155, miR-182, miR-210 og miR-424 for at være blandt de mest interessante kandidater. Da Mirs ofte er scene og vævsspecifik, er undersøgelser stor skala berettiget til yderligere at udforske deres prognostiske og prædiktive effekt. Udover den samme miR har ofte flere målgener og forskellige funktioner. Derfor funktionelle studier er stærkt behov for at få bedre indsigt i deres biologiske funktioner.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Undersøgelsen er godkendt af The National Datainspektionen, The regionale Udvalg for Forskning Etik og Biobank Board Indsamling af Tissue. Information og efterfølgende skriftligt samtykke fra patienter eller pårørende blev betragtet, men da dette var en retrospektiv undersøgelse med mere end halvdelen af ​​patienterne afdøde, nogle mere end ti år siden, Det regionale udvalg for Forskning Etik specifikt frafaldes behovet for samtykke.

patienter og vævsprøver

fra en tidligere velbeskrevet store NSCLC kohorte [30], tyve formalinfikserede og paraffinindlejrede (FFPE) tumor vævsprøver blev opnået fra patienter diagnosticeret med trin I -IIIA på University Hospital i Nordnorge (UNN) og Nordland Central Hospital (NLCH). Disse var ti patienter med en kort sygdomsspecifik overlevelse (DSS) (NSCLC_01 – NSCLC_10), og ti patienter med lange DSS (NSCLC_11 – NSCLC_20). Derudover blev prøver fra normale lungevæv steder i ti NSCLC patienter (NSCLC_01, NSCLC_02, NSCLC_06, NSCLC_11, NSCLC_12, NSCLC_13, NSCLC_15, NSCLC_16, NSCLC_18 og NSCLC_19) inkluderet i undersøgelsen (NORM_01 – NORM_10). Fire eksempler på kerner, hver 0,6 mm i diameter, fra levedygtige tumorområder fra hver tumor og normale prøve blev udtaget og blandet før RNA-isolering med henblik på at opnå en repræsentativ prøve af hver patient. Lange og korte DSS grupper blev stratificeret for at få ligelig fordeling af køn og histologi. De tumor prøver blev opbevaret ved departementerne Patologi på UNN og NLCH, iscenesat ifølge The International Union Against Cancer (UICC) TNM klassifikation, og histologisk subtyped ifølge World Health Organization retningslinjer [54], [55]. Alt patient materiale blev revideret af to uafhængige og uddannede patologer (SAS og KAS). Ingen af ​​patienterne modtog kemo- eller strålebehandling inden operationen. Komplet patientdata blev opnået fra medicinske journaler, herunder demografiske, kliniske, behandling og resultatet data.

RNA isolering

RNA blev isoleret fra de indsamlede kerneprøver ved at bruge Gendan All ™ Total Nucleic Acid Isolation Kit til FFPE væv (Ambion, Austin, TX), i henhold til producentens anvisninger, med nogle mindre justeringer. Xylen behandling blev forøget fra 3 min til 8 min, og protease behandling blev forøget fra 3 timer til ca. 20 timer. RNA kvalitet og kvantitet blev vurderet ved hjælp af NanoDrop 1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) og yderligere verificeret af en Agilent 2100 Bioanalyzer profil.

Microarray procedurer

Total RNA (700 ng ) fra prøve og reference blev mærket med Hy3 ™ og hY5 ™ fluorescerende mærke ved hjælp af miRCURY

Tm LNA Array power mærkning kit (Exiqon, Vedbæk, Danmark) efter beskrevet af producenten procedure. Den Hy3 ™ -mærket prøver og en hY5 ™ -mærkede henvisning RNA prøve (indeholdende en lige portion af alle RNA-arter, der indgår i denne undersøgelse) var blandet parvis og hybridiseret til miCURY

Tm LNA Array-version 5

th generation (Exiqon, Danmark), der indeholder capture prober rettet mod alle menneskelige miRNA registreret i miRBase udgave 14.0 ved Sanger Institute. Hybridiseringen blev udført i overensstemmelse med miRCURY ™ LNA-array manual under anvendelse af en Tecan HS4800 hybridisering station (Tecan, Østrig). Efter hybridisering mikroarrayet objektglas blev scannet og lagret i en ozon frit miljø (ozon niveau under 2,0 ppb) for at forhindre potentiel blegning af fluorescerende farvestoffer. De miCURY ™ LNA Array microarray objektglas blev scannet under anvendelse af Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies Inc., USA) og billedet analyse blev udført under anvendelse af Imagene 8.0 software (BioDiscovery Inc., USA). De kvantificerede signaler blev baggrund korrigeret med offset værdi 10 og normaliseret ved hjælp af den globale Lowess (lokalt Vægtet Scatterplot Smoothing) regression algoritme [56].

Database indsendelse af microarray data

De microarray data blev forberedt i henhold til minimum oplysninger om et microarray eksperiment (MIAME) henstillinger [57], og deponeret i GEO-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). GEO tiltrædelse nummer for platformen er GSE27705 og undersøgelsen kan ses på:. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27705

Kvantificering af modne miRNA ved real-time qPCR

En eller flere af følgende kriterier blev anvendt ved udvælgelsen Mirs til PCR validering; signifikant P-værdi, høj gange ændring og /eller angiogenese-relaterede Mirs. Fem prøver fra hver gruppe med tilstrækkelig tumor miR tilbage efter array analyse blev anvendt i PCR-validering. Ud af de 41 testede Mirs, blev påvist 28 Mirs i 7 eller flere prøver og analyseret. Stabiliteten af ​​de fundne i alle prøver miRNA blev testet ved Exicon hjælp af Normfinder softwaren. miR-423-5p var en af ​​de anbefalede reference- miRNA sammen med miR-150, miR-423-5p og miR-300. miR-300 blev udelukket på grund af meget lave niveauer detekteret. Yderligere Normfinder fundet stor variation i miR- 150 imidlertid MIR-423-5p viste sig at være den mest stabile miRNA i datasættet og følgelig anvendes som reference. Alle realtid qPCR forsøg blev udført af Exiqon, Vedbæk, Danmark. 10 ng RNA blev revers transkriberet i 10 pi reaktioner under anvendelse af miRCURY LNA ™ Universal RT miR PCR, polyadenylerings- og cDNA-syntese kit (Exiqon); hver prøve blev behandlet i triplikater. cDNA blev fortyndet 100 × og 4 ul blev anvendt i 10 ul PCR-reaktioner i overensstemmelse med protokollen for miRCURY LNA ™ Universal RT miR PCR; hver miR blev analyseret én gang af qPCR tredobbelt cDNA. Amplifikationen blev udført i en LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Roche) i plader med 384 brønde. LinRegPCR (version 11.5) software blev anvendt til at bestemme qPCR opformeringseffektivitet. Den gennemsnitlige forstærkning effektivitet blev brugt til at korrigere Raw Cp-værdier.

Pathway analyse

virkninger af de forskellige veje blev evalueret af Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) afledt af proteinanalyse gennem Evolutionær Relationship (PANTER). Det PANTHER klassifikationssystem er en unik ressource, der klassificerer gener ved deres funktioner, ved hjælp af offentliggjorte videnskabelige eksperimentelle beviser og evolutionære relationer til at forudsige funktion selv i mangel af direkte eksperimentelle bevismateriale. Genet sæt blev taget fra databasen MirDB (https://www.mirdb.org) (https://rnajournal.cshlp.org/content/14/6/1012.full), som har udarbejdet gen lister fra veje kurateret i PANTHER-databasen.

En komplet liste er tilgængelig på https://mirdb.org/cgi-bin/pathway.cgi. miRNA annotation er baseret på miRBase version 13 (https://www.mirbase.org/). GSEA analyse blev udført ved hjælp af R statistisk sprog (www.r-project.org) og GSEA pakke til R findes på https://www.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp.

Data