PLoS ONE: Calcium Forhindrer tumorigenese i en musemodel af kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund og Formål

Calcium er blevet foreslået som en formidler af chemoprevention af kolorektal cancer (CRC), men den omfattende mekanisme bag denne forebyggende virkning er endnu ikke klart. Derfor gennemførte vi denne undersøgelse for at vurdere de mulige roller og mekanismer af calcium-medieret forebyggelse af CRC induceret af 1,2-dimethylhydrazin (DMH) i mus.

Metoder

For genekspression analyse , 6 ikke-tumor kolorektale væv fra mus fra DMH + Calcium-gruppen og 3 prøver hver fra DMH og kontrolgrupper blev hybridiseret på en 4 × 44 K Agilent hele genomet oligo microarray, og udvalgte gener blev valideret af real-time polymerasekædereaktion (PCR). Funktionel analyse af microarray data blev udført under anvendelse Kegg og Gene Ontology (GO) analyser. Hub gener blev identificeret ved hjælp af Pathway Studio software.

Resultater

De tumor incidensrater i DMH og DMH + Calcium grupper var henholdsvis 90% og 40%, hhv. Microarray genekspression analyse viste, at

S100a9

,

Defa20

,

MMP10

,

MMP7

,

Ptgs2

, og

Ang2

var blandt de mest nedreguleret gener, mens

Per3

,

Tef

,

Rnf152

, og

Prdx6

var signifikant opreguleret i DMH + Calcium-gruppen sammenlignet med DMH gruppe. Funktionel analyse viste, at de Wnt, cellecyklus, og arachidonsyre veje var signifikant nedreguleret i DMH + Calcium gruppe, og at GO udtryk relateret til celle differentiering, cellecyklus, proliferation, celledød, vedhæftning, og celle migration blev væsentligt påvirket .

Forkhead box M1 Hotel (

FoxM1

) og

nuklear faktor kappa-B Hotel (

NF-KB

) blev betragtet som potente hub gener.

Konklusion

i DMH-induceret CRC musemodel, blev omfattende mekanismer involveret med komplekse genekspression ændringer omfatter mange ændrede veje og GO vilkår. Men hvordan calcium regulerer disse begivenheder stadig at blive undersøgt,

Henvisning:. Wang J-L, Lin Y-W, Chen H-M, Kong X, Xiong H, Shen N, et al. (2011) Calcium Forhindrer tumorigenese i en musemodel af kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (8): e22566. doi: 10,1371 /journal.pone.0022566

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: November 13, 2010; Accepteret: 29 Juni 2011; Udgivet: 17 August, 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Ministeriet for Folkesundhed, Kina (nr 200.802.094), en bevilling fra National Science Fundet Kina (30.830.055) til Jing-Yuan Fang; og en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (No: 30.900.757) til Hua Xiong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den nuværende forekomst af kolorektal cancer (CRC) er høj, og dens prognose er fortsat dårlig [1]; derfor er det vigtigt at udvikle strategier til at forhindre udviklingen af ​​CRC. Mange midler anvendes til at forhindre CRC [2]; Men der er ingen sammenhæng i virkningerne på tværs af agenter [3], [4], [5], og nogle midler kan føre til alvorlige bivirkninger [6], [7]. Således er nødvendig til forebyggelse af CRC en alternativ fremgangsmåde.

En nylig systemisk afslørede, at calcium kan være mere attraktiv for forebyggelsen af ​​CRC sammenlignet med aspirin og screening [8]. Men effektiviteten af ​​calcium er stadig usikker. Puljede fund af 10 kohortestudier viste en omvendt sammenhæng mellem calcium indtag og CRC risiko [9], men dette forhold ikke blev bekræftet af en randomiseret, kontrolleret klinisk forsøg [10]. Men på grund af de begrænsninger af den randomiserede kontrol forsøg (RCT), for eksempel lav dosis af calcium, kort længde af opfølgning, og indflydelse af østrogen indtag [11], er konklusionen fra RCT var ikke overbevisende,. Alligevel effektiviteten af ​​calcium om forebyggelse af CRC forbliver kontroversiel [12].

Ligeledes mekanismen af ​​calcium-medieret forebyggelse af CRC er endnu ikke klart. I tidligere undersøgelser, blev calcium menes at reducere risikoen for CRC ved binding til toksiske sekundære galdesyrer og danner uopløselige sæber i lumen af ​​colon [13], eller ved at reducere proliferation, stimulere differentiering og inducere apoptose i tyktarmsslimhinden [ ,,,0],14], [15]. En nylig undersøgelse antydede, at calcium kunne ophæve hyperplasi i den distale colon ved at hæmme en calciumkanal-receptor, dvs. transient receptor potential kanal, underfamilie V, element 6 (TRPV6) [16]. Disse fund indikerer, at calcium kunne reducere risikoen for CRC gennem en række mekanismer, men de specifikke og omfattende mekanisme er endnu ikke klart. Derfor gennemførte vi denne undersøgelse for at vurdere de mulige roller og mekanismer af calcium-medieret forebyggelse af CRC induceret af 1,2-dimethylhydrazin (DMH) i mus. Vi mener, at vores resultater vil bidrage til forskning i den kliniske anvendelse af calcium.

Materialer og metoder

Etik Statement

Vores undersøgelse blev godkendt af Animal Care og brug Udvalget af Shanghai Jiao-Tong University School of Medicine Renji Hospital, Shanghai, Kina. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er udviklet af Kina Rådet om Animal Care og protokollen er godkendt af Shanghai Jiao-Tong University School of Medicine, Renji Hospital, Shanghai, Kina.

Kemikalier

DMH blev opnået fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Normal og højt calcium foder til mus blev opnået fra Shanghai SLAC Laboratory Animal Company (Shanghai, Kina). De vigtigste komponenter i den normale og højt calcium foder var de samme: protein, 22,1%; fedt, 5,28%; aske, 5,2%; fiber, 4,12%; nitrogen-fri ekstrakt, 52%; phosphor, 0,92%; og vitamin D3 6818,4 IE /kg. Koncentrationen af ​​calcium (i form af calciumcarbonat) i normal og højt calcium foder var 1,24% og 3,0%, henholdsvis. Den høje calcium foder blev indstillet ved tilsætning af calciumcarbonat at opnå en endelig indhold på 3% calcium. Fordi vi tror, ​​at den kontroversielle effektiviteten af ​​højt calcium kost om forebyggelse af CRC delvist kan skyldes den lille dosis af calcium i tidligere undersøgelser, så vi besluttede at bruge højere indhold af calcium til at teste den nøjagtige forebyggende effekt af CRC og musenes tolerance .

Forsøgsdyr

I alt 80 kvindelige SLAC: ICR-mus [vægt, 18-20 g; klasse, SPF-(SPF)] blev købt fra Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). De blev opretholdt ved stuetemperatur (22 ° C) med en relativ fugtighed på 60% og 12-timers lys /mørke cyklus; de blev leveret en standard laboratorium kost og drikkevand. Musene blev tilfældigt inddelt i 4 grupper (20 mus i hver gruppe): kontrolgruppe, DMH gruppe, DMH + Calcium gruppe, og Calcium gruppe. Musene i kontrolgruppen blev leveret normal foder og modtog subkutane injektioner af normal saltopløsning; de af DMH gruppe blev tilvejebragt normal foder og modtog subkutan injektion af DMH i en dosis på 20 mg /kg én gang om ugen i 20 uger; de af DMH + Calcium gruppe blev tilvejebragt høj calcium foder og modtog subkutan injektion af DMH i en dosis på 20 mg /kg én gang om ugen i 20 uger; de af Calcium gruppe blev tilvejebragt høj calcium foder og modtog subkutane injektioner af normal saltopløsning. Musene blev dræbt i slutningen af ​​24 uger, og forekomsten af ​​CRC i hver gruppe blev undersøgt. Denne metode er blevet beskrevet i detaljer i vores tidligere undersøgelse [17]. Kort fortalt blev langsgående snit af kolorektale væv til at observere antallet af grove tumorer. Efter da blev de grove tumorer fjernes separat og fuld-tykkelse kolorektale væv blev cutted i halvdelen af ​​den langsgående akse. Nogle af de frisk opnåede tumorprøver sammen med deres halv tilsvarende ikke-tumor kolorektale væv blev frosset øjeblikkeligt i flydende nitrogen. De resterende prøver blev fikseret i formalinopløsning og indlejret i paraffinblokke til patologisk analyse og immunhistokemi.

Histologisk analyse

I histologisk analyse, 4-um-tykke sektioner af formalinfikseret, paraffin- indlejrede tyktarmstumorer fremstillet. Efter hematoxylin og eosin-farvning blev snittene hver tumors undersøgt under et lysmikroskop (Olympus, Japan). Resultaterne blev bekræftet af patologen Chen XY.

RNA ekstraktion, mærkning, hybridisering og analyse

I alt RNA fra 12 ikke-tumor kolorektale væv [3 fra kontrolgruppen, 3 fra DMH-gruppe, 6 fra DMH + Calcium gruppe (blandt de 6 fra DMH + Calcium gruppe, 3 var fra mus med tumorer og 3 var fra mus uden tumorer)] blev høstet under anvendelse af TRlzol (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. RNA-indholdet blev målt under anvendelse af en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer, og denaturerende gelelektroforese blev udført. Derefter blev prøverne amplificeret, mærket ved anvendelse af Agilent Quick Amp mærkningskit og hybridiseret under anvendelse af Agilent hele genomet oligo microarray (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ved anvendelse af Agilent SureHyb hybridiseringsbetingelser kamre. Efter hybridisering og vask, blev de forarbejdede dias scannet med Agilent mikromatrice scanner ved hjælp af de indstillinger, der er anbefalet af Agilent Technologies.

De resulterende tekstfiler udvundet fra Agilent Feature Extraction Software (version 10.5.1.1) blev importeret til Agilent GeneSpring GX-software (version 11.0) til yderligere analyse. Baggrund intensitet er blevet skåret fra, før normalisering. Microarray datasæt blev normaliseret i GeneSpring GX hjælp af Agilent FE ensfarvet scenario (hovedsagelig median normalisering). Differentielt udtrykte gener blev identificeret ved at bestemme fold-ændring (FC) og p-værdierne af

t

-test. Gener med en FC på ≥1.5 og en p-værdi på ≤0.05 mellem to grupper blev identificeret som differentielt udtrykte gener. Funktionel analyse af de differentielt udtrykte gener blev udført ved hjælp af Gene Ontology (GO) (https://www.geneontology.gov/) [18] og Kegg PATHWAY Database (https://www.genome.jp/kegg/pathway. html). Hub gener blev identificeret under anvendelse Pathway Studio (Ariadne Genomics) [19].

Real-time polymerasekædereaktion

Revers transkription blev udført under anvendelse af oligo (dT) primere og hævet II revers transkriptase (Takara ). Kvantificering af genekspression blev udført under anvendelse af en real-time polymerasekædereaktion (PCR) kittet (Takara). Ekspressionsniveauet af 18 s rRNA blev anvendt som en intern kontrol. Udtrykket af følgende gener blev analyseret:

S100a9

,

Defa20

,

MMP10

,

Ptgs2

,

Per3

,

Tef

,

Rnf152

, og

Prdx6

. Primerne er anført i tabel 1.

Immunhistokemi

Fire mikrometer tykke sektioner af formalinfikserede, paraffinindlejrede non-tumor colonvæv blev afparaffiniseret og rehydreret. Mikrobølgeovnen reparation metode blev anvendt til antigen-genvinding. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubering af sektionerne med 0,3% hydrogenperoxid i 10 min. Ikke-specifik antigen blev blokeret ved inkubering af sektionerne med fåreserum i 30 min. Objektglas blev inkuberet natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer med kanin monoklonalt anti-β-catenin (Cell Signaling Technology, # 9562) i en fortynding på 1:200. Anti-kanin IgG blev anvendt som sekundært antistof (30 minutters inkubation). Diaminobenzidin blev anvendt som kromogen og blev snittene modfarvet med hematoxylin. Prøver inkuberet med PBS i stedet for primært antistof blev anvendt som negative kontroller.

Statistisk analyse

Resultaterne af dyreforsøg og real-time PCR blev analyseret under anvendelse SAS 9.2 software (SAS Institute Inc. USA). Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Studerendes

t

-test blev brugt til at sammenligne værdier mellem 2 uafhængige grupper.

Resultater

Dyreforsøg

De vigtigste resultater af dyreforsøg er vist i figur 1. Vi held induceret CRC i mus under anvendelse DMH (figur 1A). De fleste af de kræftformer blev identificeret som adenokarcinomer ved histologisk analyse (figur 1B, 1C). I DMH og DMH + Calcium grupper, tumoren var forekomsten 90% og 40% (figur 1 D), det gennemsnitlige antal tumorer per mus var 5,39 ± 1,97 og 3,0 ± 1,31 (figur 1E), og betyde maksimale diameter af tumorerne var 6,44 ± 1,72 og 2,63 ± 1,19 (figur 1F), hhv. Ingen tumor blev fundet i kontrollen og Calcium grupper. Vækst og udvikling af mus i Calcium gruppe blev ikke signifikant påvirket, og den patologiske undersøgelse af deres nyrer, hjerter, lunger, lever og milt afslørede ingen tydelige abnormiteter (data ikke vist).

A.

Observation af tumorer i tyktarmen hos mus efter aflivning efter 24 uger.

B Hotel (× 200) og

C Hotel (× 400). De fleste af tumorer blev bekræftet som adenokarcinomer ved patologisk undersøgelse.

D

. Tumorincidensen blandt de 4 grupper.

E

. Tumor nummer /mus blandt de 4 grupper.

F

. Maksimal tumor diameter blandt de 4 grupper (Kontrol: Kontrol gruppe, fik normal foder og injektion af normal natrium i 20 uger DMH: DMH gruppe, fik normal foder og injektion af DMH i 20 uger DMH + Calcium gruppe: modtagne høj calcium foder og injektion af DMH i 20 uger; calcium gruppe: modtagne høj calcium foder og injektion af normal natrium i 20 uger). *

P Drømmeholdet værdi. 0,05 mellem DMH + Calcium gruppe og DMH-gruppe på Airbnb

Genekspression profil ved microarray analyse

Alle 12 colon væv ryddet kontrol trin kvalitet og blev analyseret som beskrevet i afsnittet Fremgangsmåder. Den microarray analyse blev foretaget mellem kontrolgruppen (3 prøver), DMH-gruppe (3 prøver), og DMH + Calcium gruppe (6 prøver). Vi sammenlignede også genekspressionsniveauer mellem prøverne med eller uden tumorer blandt DMH + Calcium gruppe.

Hierarkisk klyngedannelse analyse af de 12-array udtryk data viste en homogen udtryk profil blandt de prøver af hver gruppe (figur S1 ). Ved at sætte filter til FC til ± 1.5 og p-værdi på ≤0.05, fandt vi, at ekspressionen af ​​12395-generne blev ændret signifikant i DMH-gruppen sammenlignet med dem i kontrolgruppen (se tabel S1), og af 1508 gener blev ændret signifikant i DMH + Calcium gruppe sammenlignet med dem i DMH-gruppen (se tabel S2). Sammenlignet med tabel S1 og S2 tabel, fandt vi, at ekspressionen af ​​549 gener, hvis ændringer som følge af DMH behandling kunne vendes ved calcium i kosten (se tabel S3). I tabel 2 er de 30 mest differentielt udtrykte gener vist, hvoraf de fleste er tæt knyttet til tumorigenese, såsom

S100a9

(S100 calcium-bindende protein A9 [calgranulin B]),

Defa20

(defensin alpha 20),

MMP10

(matrixmetalloproteinase 10),

Ang2

(angiogenin, ribonuklease En familie, medlem 2),

Per3

(periode homolog 3) ,

Tef

(thyrotroph embryonale faktor), og

Ptgs2

(prostaglandin-endoperoxid syntase 2). For de 8 udvalgte gener, dvs.

S100a9

,

Defa20

,

MMP10

,

Ptgs2

,

Per3

,

Tef

,

Rnf152

, og

Prdx6

, de opnåede resultater fra microarray analyse blev bekræftet af real-time PCR (figur 2). Vi valgte disse gener til PCR bekræftelse, fordi de er tæt knyttet til tumorigenese og værd yderligere forskning.

Vi brugte 18 s rRNA som en intern kontrol. Relativ mRNA ekspression blev beregnet efter den 2

-ΔΔT metode. Dataene er gennemsnittet af 10 prøver ± SD. Kontrol, genekspression niveau i normale colon væv af mus i kontrolgruppen; DMH, genekspression niveau i ikke-tumor colon væv af mus i DMH-gruppe; DMH + Calcium, genekspression niveau i ikke-tumor colon væv af mus i DMH + Calcium-gruppe; Calcium, genekspression i ikke-tumor colon væv af mus i calcium-gruppen. *

P Drømmeholdet værdi 0,05 mellem DMH + Calcium gruppe og DMH gruppe; §

P Drømmeholdet værdi. 0,05 mellem Calcium og kontrolgruppe

For at afgøre, om bestemte biologiske veje eller funktionelle gen grupper forskelligt påvirket af højt calcium kost, vi analyseret vores microarray datasæt (på grundlag af resultaterne vist i tabel S3) ved anvendelse af GO og Kegg software. De detaljerede resultater er vist i tabel S4 og S5 tabel. Ved at sætte p-værdi på ≤0.05, fandt vi signifikant nedregulering af 39 signalveje, herunder nogle tumorrelaterede veje såsom cellecyklus pathway, Wnt signalvejen, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) signalvejen, og transformerende vækstfaktor ( TGF-β) signalvejen. De mest berigede veje er vist i tabel 3. Vi anvendte immunhistokemi til påvisning af protein-ekspression og distribution af β-catenin, kernemolekylet i Wnt-vejen, og fandt, at dets ekspression var signifikant højere i den ikke-tumor tyktarmsslimhinden fra DMH-gruppen end i den fra kontrolgruppen, men dets ekspression i DMH + Calcium gruppe blev markant reduceret sammenlignet med den DMH gruppe (figur 3). I alt 703 GO vilkår, herunder tumor-relaterede GO begreber som celledifferentiering, celleproliferation, apoptose, angiogenese, celle adhæsion, cellecyklus, og celledeling, blev ændret betydeligt

Kontrol, kontrol gruppe.; DMH, DMH-gruppe; DMH + Calcium, DMH + Calcium-gruppe; Calcium, Calcium-gruppe.

Vi brugte også Pathway Studio software til at filtrere hub gener, der kan spille vigtige roller i calcium-medieret forebyggelse af CRC (tabel 4). Af disse blev 2-gener udvalgt til at konstruere gen net (figur 4). På grundlag af de netværk, kunne vi tydeligt bestemme de centrale roller hub gener

De differentielt udtrykte gener, der reguleres af de 2 hub gener (A,

FoxM1

,. B,

NF-KB

) vises i form af et netværk diagram. Grøn eller rød farve, sekvenser, der er nedreguleret eller opreguleres i DMH + Calcium-gruppen sammenlignet med DMH-gruppen. Intensiteten af ​​farven er proportional med graden af ​​forandring.

Derudover har vi yderligere sammenlignet genekspressionsniveauer blandt musene fra DMH + Calcium gruppe med /uden tumorer og fundet at genet ekspressionsniveauerne for de fleste af ovennævnte udvalgte gener i mus fra DMH + Calcium gruppe med tumorer var mellem dem fra DMH + Calcium gruppe uden tumorer og dem fra DMH gruppen (se tabel S6 og figur S1). Vi fandt også, at ekspressionen af ​​visse calcium transportører var forskellige blandt musene fra DMH + Calcium gruppe med /uden tumorer. For eksempel blev ekspressionen af ​​Trpv6 og Trpv3 signifikant opreguleret i mus fra DMH + Calcium gruppe med tumorer sammenlignet med dem uden tumorer; dog udtryk for plasmalemmal Ca

2 + -ATPase (PMCA) var signifikant nedreguleret.

Diskussion

I denne undersøgelse anvendte vi den DMH-induceret CRC musemodel, der viser fænotypisk og genotypiske egenskaber svarende til dem observeret i humane sporadiske CRCs og således kan anvendes til at studere forebyggelse af CRC [20]. I denne undersøgelse fandt vi, at forekomsten af ​​CRC faldt betydeligt i mus fodret en højt calcium diæt, hvilket indikerer en klar rolle af calcium i forebyggelsen af ​​CRC. Vore resultater stemmer overens med mange andre undersøgelser. Pence [21] har fundet, at rotter på højt calcium kost har en nedsat CRC incidens sammenlignet med diæt med lavt calciumindhold (86% vs. 53%), Salas [22] også observeret en væsentlig forringelse i antallet af tumorer og et fald i CRC incidens i gruppen fodret højt calcium diæt (97% vs. 64%). Imidlertid har nogle undersøgelser observeret forskellige resultater. Sitrin [23] fandt, at hverken calciumtilskud alene eller supplerende calcium sammen med D-vitaminmangel ændret forekomsten af ​​CRC induceret af DMH, Mølck [24] selv fundet en øget forekomst i rotter fodret med højt calcium kost. Vi mener, at forskellene i dyret stammen, dyr alder, opdræt miljø, basis kost, DMH doser og varigheden af ​​injektion, calcium koncentration, regnskabsmæssigt kan calcium indgriben tid for forskelle i resultatet af forskellige undersøgelser ved hjælp af høj calcium. Det bekræftede forebyggende virkning CRC med højt calcium kost endnu ikke kunne indeholdes fra disse undersøgelser. Vi synes, det er måske på grund af de små doser af calcium i disse undersøgelser. Så vi bruges højere indhold af calcium (3%) i foderet for at teste den forebyggende effekt af CRC og musene tolerance. Faktisk viste denne høje calcium foder god forebyggende effekt af CRC i vores eksperiment og uden tydelige bivirkninger blev fundet i mus. Desuden blev ingen tumor fundet i Calcium grupper. Vækst og udvikling af musene i Calcium gruppe blev ikke signifikant påvirket, og den patologiske undersøgelse af deres nyrer, hjerter, lunger, lever og milt afslørede ingen tydelige anormaliteter, ekspressionen af ​​hovedparten af ​​de udvalgte gener bekræftet ved realtids-PCR i Calcium gruppen var lig med i kontrolgruppen. Disse fund indikerer, at denne høje calcium kost er sikkert for musene.

Dernæst anvendte vi microarray genekspression profil analyse for at bestemme mekanismen af ​​calcium-medieret forebyggelse af CRC. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at bruge microarray-teknologi til at studere den rolle, højt calcium kost i forebyggelsen af ​​CRC.

Når FC blev sat til ≥1.5, ændringerne i 549 gener der var resultatet af DMH behandling kunne vendes med kosten calcium.

S100a9

er den mest nedreguleret gen; dens produkt er en cytoplasmatisk Ca

2 + -bindende protein. Selvom ekstracellulær S100a9 kunne inducere apoptose ved binding til en endnu ukendt receptor og forårsage dimerisering af Bax og Bak og deres translokation til mitokondrierne fører til mitochondriebeskadigelse [25], kan dets ekspression i epitelceller faktisk inducerer celleproliferation ved at aktivere phosphoinositid 3- kinase (PI3K) -Akt-NF-KB overlevelse pathway, som er forbundet med tumorigenese [26]. Desuden S100a9 er et vigtigt proinflammatorisk cytokin, der indgår i medfødte immunitet, og dets ekspression viste sig at være forhøjet i adskillige patologiske tilstande forbundet med inflammation [27]. Mange andre inflammatoriske cytokiner, såsom Defa, blev også signifikant nedreguleret [medlemmer af defensin familie var nedreguleret på forskellige niveauer:

Defa-RS2

(FC = -9,88),

Defa20

(FC = -8,16)]. Tumornekrosefaktor (

TNF

) og dets receptorer blev også nedreguleret på forskellige niveauer:

TNF

(FC = -1,87),

Tnfrsf11b

(FC = -5,98),

Tnfrsf19

(FC = -2,27). Flere andre undersøgelser udført under anvendelse af DMH eller azoxymethan (AOM) -induceret CRC modellen også fundet høje ekspressionsniveauer af S100a9 og Defa i tumorvæv [28], [29]. Inflammatoriske cytokiner spiller en vigtig rolle i det medfødte og adaptive immunitet; dog er disse forhøjede cytokiner også involveret i tumor initiering, forfremmelse samt invasion [30], [31], [32], [33], og dermed spiller en vigtig rolle i inflammation-associeret carcinogenese [34].

MMP’er er en familie af matrixmetalloproteinaser, der kan spille vigtige roller i tumormikromiljøet [35]. Mange medlemmer af MMP familien signifikant nedreguleret i DMH + Calcium gruppe [

MMP10

(FC = -9,47),

MMP13

(FC = -9,1),

MMP7

(FC = -7,07), og

MMP11

(FC = -1,56)]. Andre metalloproteinaser blev også nedreguleret, såsom

Adam8

Adam10

, som blev nedreguleret med 2,08 og 1,6 gange, henholdsvis. Nylige undersøgelser har vist, at mange medlemmer af MMP og ADAM familie kunne spille forskellige roller i tumorigenese. For eksempel,

MMP7

kunne kløve Fas ligand, og derved sænke virkningen af ​​kemoterapi på tumoren ved ophævelse apoptose [36].

Adam10

kan udløse frigivelse af opløseligt epidermal vækstfaktor (EGF), medierer afgivelse af E-cadherin, translokere β-catenin til kernen, og således, kørsel celleproliferation [37]. Imidlertid er den vigtigste rolle af medlemmerne af MMP og ADAM familie fremme tumorinvasion og metastaser ved at nedbryde ekstracellulære matrix [38], [39]. Disse fund indikerer, at et højt calcium kost kan spille en vigtig rolle ved inhibering invasion og metastaser af CRC. Fordi

in vitro Salg undersøgelser viste, at, i CRC-celler, E-cadherin ekspression kunne induceres ved at øge ekstracellulære Ca

2+ koncentration [40], calcium kan anses for at undertrykke epitel-mesenkymale overgang (EMT) til at hæmme CRC metastaser.

Per3

var den mest opreguleret gen i vores undersøgelse, tilhører periode gener. Disse gener er centrale elementer i de transkriptionelle /translationelle feedback-sløjfer, der genererer den endogene døgnrytme, og

Per3

deltager i tidtagning i hypofysen og lunge [41]. Nylige undersøgelser har antydet, at døgnrytmen gener deltage i væksten og udviklingen af ​​forskellige kræftformer, og den periode generne er nu blevet forbundet med DNA skade responset veje, inhibering af væksten af ​​cancerceller, og forhøjelse af den apoptotiske sats [42]. Oshima undersøgelse har vist, at ekspressionen af ​​

Per3

i CRC væv var signifikant lavere end i det tilstødende normale slimhinde, hvilket tyder på, at

Per3

kan fungere som et tumorsuppressorgen [43].

Tef

var den anden mest opreguleret gen i vores undersøgelse. Det hører med til PAR-domænet grundlæggende leucin zipper (PAR bzip) transkriptionsfaktorer og er involveret i afgiftning og lægemiddelmetabolisme [44] og i vedligeholdelse af cellens form i fibroblaster [45]. Det fungerer også som en pro-apoptotisk gen ved at fremme ekspression af bcl-gs eller bik [46], [47]. Mange andre gener blev også opreguleres fx

Rnf152

Prdx6

.

Rnf152

er et hidtil ukendt RING finger protein og er blevet vist at have pro-apoptotiske aktivitet [48].

Prdx6

er medlem af PRDX familien, der er forbundet med funktioner såsom celleproliferation, differentiering og apoptose, hvilket udfører anticanceraktivitet [49].

Ved hjælp pathway analyse, vi fandt, at Wnt-vejen blev signifikant påvirket. Selvom ekspressionen af ​​Wnt inhibitorisk faktor

wif1

var signifikant nedreguleret, blev der af mange gener forbundet med Wnt signalvejen og deres målgener nedreguleret [dvs

Tcf7

,

Myc

,

cyklin d1

(

CCND1

), og

MMP7 dele på FC på -1,53, -1,61, -1,62 og -7,07, henholdsvis]. Proteinet ekspression af β-catenin var signifikant reduceret i DMH + Calcium gruppe, hvilket antyder, at Wnt-vejen blev nedreguleret i denne gruppe. Dette er i overensstemmelse med tidligere resultater [28], [50]. Interessant nok blev cellecyklus vej også væsentligt hæmmet i DMH + Calcium gruppe, med mange gener i denne vej bliver konsekvent nedreguleret, dvs de cycliner

CCNB1

og

CCND1

blev nedreguleret med 1,79 og 1,62 gange, henholdsvis, og ekspressionen af ​​cyclin-afhængige kinase

Cdk1

blev reduceret med 1,66 gange.

Blandt de metaboliske veje, blev arachidonsyre-pathways signifikant hæmmet i DMH + Calcium gruppe. Mange enzymer i denne pathway udviste reduceret ekspression, fx Ptgs2, også kendt som cyclooxygenase-2 (COX-2) blev reduceret med 3 gange. Den arachidonsyre pathway aktiveres under inflammation, hvilket fører til syntesen af ​​prostaglandin og tromboxan, som spiller en vigtig rolle i inflammatorisk respons [51]. Endvidere nøgleenzymet i denne pathway, Ptgs2 (COX-2), spiller en vigtig rolle i initieringen af ​​CRC. COX-2-overekspression blev vist at være korreleret med carcinogenese hos mere end 80% af CRCs [52]. I dyremodeller, blev COX-2-ekspression sig at være tilstrækkelig til at inducere tumorigenese [53]. Mekanismen kan være relateret til aktiveringen af ​​inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) og VEGF signalering til fremme dannelsen af ​​nye blodkar [54]. På grundlag af den konstatering, at ekspressionen af ​​de inflammatoriske cytokiner S100a9, DEFA, TNF og TNF-receptorer også var signifikant nedreguleret i DMH + Calcium gruppe, vi spekuleret på, at calcium kan spille en vigtig rolle i at reducere inflammation-relaterede tumorigenese.

Blandt de Pathway Studio-afledte hub gener, som kan spille vigtige roller i calcium-medieret forebyggelse af CRC,

FoxM1

,

NF-KB

, etc., var også involveret. FoxM1 tilhører en familie af udviklingsmæssigt konserverede transkriptionelle regulatorer, der blev karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​et DNA-bindende domæne kendt som forkhead box-domænet. Højere ekspression af FoxM1 blev bemærket i mange typer af humane cancere [55]. FoxM1 kan spille vigtige roller i celleproliferation og apoptose [56]. Den molekylære mekanisme bag FoxM1 signalering-medieret induktion af tumorvækst er ikke blevet fuldstændigt belyst. Imidlertid er der flere onkogene veje såsom PI3K /Akt, NF-KB, ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK), mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), VEGF, reaktive oxygenarter (ROS), c-myc, og hypoxi-inducerbare faktor (HIF) -1 er blevet rapporteret at interagere med FoxM1 signaler; dette tyder på, at samspillet mellem FoxM1 signalering og andre signalveje kan spille vigtige roller i tumorigenese [57]. Det skal bemærkes, at ekspressionen af ​​mange gener, der reguleres af NF-KB viste ændret udtryk i DMH + Calcium gruppe, fx

TNF

,

PTGS2

,

MYC

,

CCND1

,

ETS-relaterede gen 1 Hotel (

ERG1

),

S100A9

, og

lymfoide forstærker faktor 1 Hotel (

LEF1

), hvilket antyder, at NF-KB også kan tjene som en hub gen i calcium-medieret forebyggelse af CRC. Selvom ekspressionen af ​​NF-KB ikke ændre sig væsentligt på det transskriptionelle niveau, kan det have ændret på det translationelle eller posttranslationel niveau. Ekspressionsmønsteret for NF-KB i DMH + Calcium gruppe og dens specifikke mekanisme bør yderligere belyst.

Vi fandt også, at genet ekspressionsniveauerne for de fleste af ovennævnte udvalgte gener i mus fra DMH + calcium gruppe med tumorer var mellem dem fra den samme gruppe uden tumorer og dem fra DMH gruppen, og dermed bekræftede vigtigheden af ​​disse gener i calcium er forebyggelse af CRC.