PLoS ONE: Design og karakterisering af gensplejsede Cancer-Like Stem Cells

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) er en lille delmængde af kræftceller, der er ansvarlige for vedligeholdelse og progression af flere typer af kræft. Isolering, formering, og differentieringen af ​​CSCS i de rigtige stamceller nicher udsætte iboende vanskeligheder for yderligere undersøgelser. Her viser vi, at induceret kræft som stamceller (iCLSCs) kan dannes ved

in vitro

onkogen manipulation af muse embryonale stamceller (mESCs) med veldefinerede onkogene elementer; SV40 LTG og H

ras

V12 ved at bruge en mus stilk virus lang terminal repeat (MSCV-LTR) -baseret retroviral system. De omprogrammerede mESCs med begge onkogener blev karakteriseret gennem deres onkogene genekspression, forbedring af spredning, og uhindret vedligeholdelse af stamceller egenskaber

in vitro

og

in vivo

. Desuden er disse transformerede celler resulterede i dannelsen af ​​ondartede, umodne æggestokkene teratomer

i viv

o. For med held yderligere udvide disse egenskaber til andre organer og arter, har brug for mere forskning, der skal gøres for at forstå betydningen af ​​en tumor- gunstig mikromiljø fuldt. Vores nuværende undersøgelse har givet en ny tilgang til at generere induceret kræft ligesom stamceller gennem

in vitro

onkogen omprogrammering og med held indledt organspecifik ondartet svulst dannelse i et ortotopisk lille dyr kræft model.

Henvisning : Cho S, Park H, Jarboe EA, Peterson CM, Bae YH, Janát-Amsbury MM (2015) design og karakterisering af gensplejsede Kræft-Ligesom stamceller. PLoS ONE 10 (10): e0141172. doi: 10,1371 /journal.pone.0141172

Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, JAPAN

Modtaget: Juli 21, 2015; Accepteret: 3 Oktober 2015; Udgivet 21. oktober, 2015

Copyright: © 2015 Cho et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den hierarkiske teori om tilrettelæggelsen af ​​kræft tyder på, at kun en lille delmængde af celler er ansvarlig for initiering og yderligere vækst af kræft [1-3]. Disse små populationer af celler er blevet defineret som cancer stamceller (CSCS). Blandt andet CSCS udviser funktioner såsom selv-fornyelse og evne til differentiering i heterogene og tumorgene cancerceller [1, 4]. Formodede CSCS fra forskellige tumorer, herunder hjerne, bryst og ovariecancer blev isoleret til dato baseret på deres ekspression af specifikke molekyler eller en kombination af cellulære markører (fx CD133, CD44, ALDH) [5-9]. Den tumorigent potentiale af disse celler er blevet påvist i forskellige xenografundersøgelser hjælp immunkompromitteret mus [5, 6, 10]. Imidlertid har yderligere karakterisering af CSCS ‘egenskaber og kapaciteter været hæmmet af iboende vanskeligheder isolere rene CSCS befolkninger, formering af disse isolerede CSCS, og differentieringen af ​​CSCS i de rigtige stamceller nicher [11].

Normalt fibroblast og brystceller kan omdannes til deres inducerede cancerceller ved

in vitro

omprogrammering gennem den exogene indførelse af genetiske vekslinger ansvarlig for at øge længden af ​​telomer (hTERT), tilvejebringelse konstitutive proliferation signaler (H

ras

V12), og inhiberer vækst suppressor veje såsom p53 og pRB ved abevirus 40 (SV40) antigener [12, 13]. I samme retning af

in vitro

omprogrammering, Scaffidi

et al

rapporterede, at somatiske celler besidder nok plasticitet skal omprogrammeres og erhverve CSC egenskaber gennem

in vitro

onkogen introduktion [ ,,,0],14]. Talrige referencer, især i studiet af hæmatologiske kræftformer, viste, at CSCS kunne udledes fra væv stilk, stamceller, og selv fra somatiske celler [10, 14-18]. Imidlertid har potentiale

in vitro

reprograming af embryonale stamceller i CSCS forblev uklart.

Heri vi studerede, om mus embryonale stamceller (mESCs) held kan omprogrammeres til induceret kræft ligesom stamceller (iCLSCs) gennem

in vitro

onkogen manipulation. Hertil kommer, ved at udsætte iCLSCs til forskellige specifikke mikromiljøer

in vivo

, vi kunne observere potentialet i disse iCLSCs at generere stedspecifikke iCLSC tumorer i immunkompetente mus.

Materialer og metoder

Kemikalier og plasmider

følgende materialer blev indhentet fra producenterne anført: (a) Fugene 6 (Promega, Madison, WI), (b) Polybrene og FBS (Sigma-Aldrich, St-Louis , MO), (c) Geltrex (Invitrogen, Carlsbad, CA) (d) Mycozap plus CL (Lonza, Allendale, NJ), (e) pBABE-H

ras

V12 (# 1768), pBabe- SV40 LTG (# 10891), pMSCV-GFP (# 33336), og pMSCV-RFP (# 33337) (Addgene, Cambridge, MA), (f) pVSV-G (Clontech, Mountain view, CA).

Cell kultur

GP2-293 celler (Clontech) og deres derivater og γ-bestrålede mus embryonale fibroblast (MEF) celler (Cyagen, Santa Clara, CA) blev opretholdt i DMEM (ATCC, Manassas, VA ) suppleret med enten 10% eller 15% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich,), hhv. Mus embryonale stamceller (mESCs) (C57BL /6 mus embryonale stamceller, # MUBES-01001, Cyagen) blev opretholdt i Knockout DMEM (Invitrogen) suppleret med 15% knockout serum udskiftning (Invitrogen), 1% L-glutamin (Invitrogen) , 1% ikke-essentielle aminosyrer (Invitrogen), 0,1% beta-mercaptanol (Invitrogen), leukæmi inhibitorisk faktor (LIF, 10 ng /ml i dyrkningsmedium; StemRD, Burlingame, CA). Alle celler blev holdt i en fugtig inkubator med 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C.

Sub-Kloning af gener til pMSCV

For at udføre sub-kloning, H

ras

V12 og SV40 stort T antigen (LTG) blev adskilt fra pBABE-H

ras

V12 og pBABE-SV40 LTG ved den enzymatiske fordøjelse med BamHI og EcoRI (NEB, Ipswich, MA), eller med BamHI (NEB), hhv. Integration af H

ras

V12 og SV40LTg ind i enten pMSCV-GFP eller pMSCV-RFP blev udført af ligering med T4-ligase (NEB) og produceret pMSCV-H

ras

V12-GFP og pMSCV -SV40 LTG-RFP. Integration af indsatserne blev bekræftet ved både enzymatisk fordøjelse og DNA-sekventering.

Generation of retrovirus

For at generere retroviral supernatant, GP2-293 celler blev forbigående transficeret med enten pMSCV-H

ras

V12-GFP eller pMSCV-SV40 LTG-RFP kombineret med replikationsinkompetent hjælpevektoren pVSV-G i en 60 mm dyrkningsskål ved hjælp Fugene 6. cellerne blev tilført ved 24 timer efter transfektion, og retroviral supernatant var puljet fra samlingen ved 48 og 72 timer efter transfektion. Supernatanten blev opdelt i prøver efter centrifugering og opbevaret ved -80 ° C til senere brug. Den virale titer blev verificeret ved FACS-analyse (FACSCanto Analyzer, BD Biosciences, San Jose, CA) efter infektion til 1x 10

5 NIH-3T3 (ATCC) blev muse fibroblastceller.

Etablering af Stable GP2- 293 derivater

For at generere GP2-293 derivater med stabil gen integration, GP2-293 celler enten inficerede med H

ras

V12 eller SV40 LTG ved hjælp af et retroviral system. FACS-sortering blev udført for at vælge stabilt inficerede celler ifølge GFP eller RFP ekspression (FACSAria cellesorteringsapparat, BD Biosciences, San Jose, CA). Den genekspression i stabile celler blev bekræftet ved Western blot.

retroviral infektion til mESCs

mESCs blev vasket og trypsiniseret. Efter centrifugering blev de resuspenderet i serumfrit mESCs medium indeholdende 8 ug Polybrene pr ml-PBS og udpladet med 1×10

5 celler /1 ml pr brønd af en tolv-brønds plade. Retroviral supernatant fra enkelt virus blev tilsat ved 1 ml /1×10

5 celler eller samme volumenforhold af retroviral supernatant fra individuelle virus blev tilsat til co-infektion. Efter 1 time inkubation i CO

2 inkubator blev pladen centrifugeret i 2 timer ved 1000 g ved stuetemperatur. Næste dag blev de retrovirale supernatanter fjernet; cellerne blev igen suspenderet i mESCs medium og udplades på skåle enten coatede med Geltrex eller belagt med bestrålede MEF. De stabilt inficerede mESCs blev sorteret ved FACS baseret på GFP eller RFP udtryk (FACSAria celle sorteringsanlæg).

Western Blotting

Cellerne blev lyseret med RIPA buffer (# 9806, Cell Signaling) suppleret med 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich). Western blotting blev udført under anvendelse 4-20% gradient SDS-polyacrylamid TRIS-HCI-gel (Mini-PROTEAN TGX

®, BioRad) ifølge fabrikantens protokol (Biorad). Antistoffer anvendt til Western blotting var anti-ras (# 610001, 1: 1000, BD Bioscience), anti-SV40 stort T og lille T-antigen (# 554.150, 1: 1000, BD Bioscience), anti-β-actin (# A5441 , 1: 2500, Sigma-Aldrich), og anti-muse-IgG-HRP (# 7076S, 1:. 5000, Cell Signaling)

alkalisk phosphatase Farvning og Immuncytokemi Farvning af levende celler

alkalisk phosphatase-farvning blev udført under anvendelse af alkalisk phosphatase-farvning kit II ifølge fabrikantens protokol (Stemgent). For immuncytokemi-farvning af levende celler blev celler dyrket i en plade med 12 brønde indtil viser synlige kolonier behandlet med antistof (StainAlive ™ SSEA-1 (DyLight 550 ™), Stemgent) opløsning fremstillet i frisk celledyrkningsmedium med en slutkoncentration på 2,5 ug /ml. Efter inkubation i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO

2, celler blev undersøgt under et fluorescerende mikroskop (automatiseret mikroskop, Nikon, Japan) med TRITC filter.

celleproliferationsassay

Celleproliferation blev udført ved anvendelse celletælling assaykit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, MD). Kort fortalt blev 100 pi cellesuspension (3000 celler /brønd) udpladet i 96 brønds kulturplade overtrukket med Geltrex (Invitrogen). I perioden vækst blev celleproliferation i hver brønd målt efter 1 times inkubering med 10 pi CCK-8 opløsning under anvendelse af en mikropladelæser (Spectramax 250, Molecular Device Inc., Sunnyvale, CA) ved en bølgelængde på 540 nm. Efter subtraktion af iboende absorbans medier ved en bølgelængde på 540 nm, blev den relative celleproliferation (%) beregnet ud fra ([Absorbans]

test /[Absorbansen]

kontrol) × 100. [Absorbansen]

kontrol refererer til absorbansen af ​​celler dyrket i medier ved dag 1 efter podning af cellerne til pladen.

In vivo tumor produktion under anvendelse modificerede mESCs og histo-patologisk evaluering væv

Denne undersøgelse blev gennemført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske dyreforsøg fra University of Utah (Permit Nummer: 14-08.011).

Både modificerede mESCs og naive (kontrol) mESCs blev dyrket i en uge på MEF fødeceller indtil synlige kolonier blev set før implantation. For orthotopisk æggestokkene bursa podning af celler til dyr, seks til otte uger gamle, blev C57BL /6-mus (Jackson Lab, Bar Harbor, ME) vejes før intraperitoneal bedøvelsesmiddel injektioner (xylazein-ketamin, 0,1 ml /10 g legemsvægt). Hvert dyr anbringes i bugleje blev modtaget omkring ~ 1,5 cm i længde dorsale indsnit, en smule til venstre for midterlinien. Dermis blev separeret fra underliggende væv, og et mindre snit blev foretaget gennem den dorsale fascia flad muskel at få adgang til abdominale peritoneum. Efter identifikation venstre nyre, blev området umiddelbart under nyren dissekeret at lokalisere venstre æggestok, som derefter blev externalized gennem snittet. 1x 10

5-celler (50 pi i 1: 1 blanding af PBS og matrigel (# 354.248, Corning, Tewksbury, MA)) blev injiceret direkte i æggestokkene bursa anvendelse af en Hamilton-sprøjte (30 G nål). Efter celleinokulering, ovariet var sted tilbage til sin oprindelige position i den peritoneale kavitet. 4-0 suturer blev anvendt til at sy indsnit i bagvæggen og hud [19, 20]. Ortotopisk inokulering af celler til brystet af mus blev udført ved direkte injektion af 1 x 10

5-celler (50 pi i 1: 1 blanding af PBS og matrigel (# 354.248, Corning, Tewksbury, MA)) til højre bottom pattedyr fedt . pad

Denne pilot

in vivo

undersøgelse omfattede (n = 16; S1 Table) dyr. Kort fortalt afhængigt tumorstedet (brystkirtlen versus ovarie bursa), enten umodne teratomer med maligne egenskaber (ovarie) eller modne teratomer (bryst) dannet. Det samlede antal dyr (n = 16) blev inddelt i fire forsøgsgrupper. Group1: mælkekirtlerne podet med Mesc; Gruppe 2: æggestokkene bursa podet med Mesc; Gruppe 3: mælkekirtlerne podet med Mesc-Ras-LTG (iCLSCs), Gruppe 4: æggestokkene bursa podet med Mesc-Ras-LTG (iCLSCs). Efter orthotopisk celleinokulering blev mus overvåget hver anden uge gennem hele 15 uger eksperimentelle perioder. Dyrene blev huset under standardbetingelser i Center for Komparativ Medicin Animal Facility i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Utah. For histo-patologiske evaluering af væv, hematoxylin og eosin (H 0,05 blev anvendt til statistisk signifikans

Resultater

Konstruktion af pMSCV-HrasV12 og pMSCV-LTG

retrovirale plasmider med den MSCV LTR (muse stamcelle virus lange terminale gentagelse) blev konstrueret ved subkloning af enten H

ras

V12 eller SV40 LTG genet ind i et multipelt kloningssite (MSC) efterfulgt af et IRES driver ekspression af GFP eller RFP genet vist som diagram i fig 1A. Indsatserne i konstruktioner blev verificeret ved enzymatisk fordøjelse (Fig 1B), og DNA-sekventering.

(A) Gener af interesse (dvs. HrasV12 eller LTG) blev indsat i mellem MSCV LTR, og enten GFP eller RFP genet var anvendes som sporstof gen. (B) Inserts klonet ind pMSCV plasmider blev bekræftet ved enzymatiske fordøjelse med enten BamHI eller EcoRI. M: DNA-stige, 1: pMSCV-GFP; 2: pMSCV-H

ras

V12-GFP; 3: pMSCV-GFP

cut; 4: pMSCV-H

ras

V12-GFP

cut; 5: pBABE-H

ras

V12

cut (+ kontrol); 6: pMSCV-RFP; 7: pMSCV-SV40 LTG-RFP; 8: pMSCV-RFP

skære 9: pMSCV-SV40 LTG-RFP

cut; 10: pBABE-SV40 LTG

cut (+ kontrol). Hvide pile angiver skær. Sekvenser af insert blev også bekræftet ved DNA-sekventering.

Etablering af GP2-293 derivater til at generere retrovirus

At etablere stabile cellelinier, der producerer retrovirus, GP2-293 celler, et derivat af 293 human nyre cellelinie med stabil integration af

gag /pol

retrovirale komponenter, blev transduceret med pMSCV plasmider. De celler, der udtrykker enten GFP eller RFP sorteret ved FACS (Fig 2A og 2B) blev yderligere bekræftet at observere deres tilsvarende genekspressioner med immunoblotanalyse vist i fig 2C. De kontrollerede stabile celler blev yderligere anvendt til at danne retrovirus gennem transfektion af en viral kappe plasmid, pVSV-G. Infektion evne af disse retrovira blev påvist ved FACS-analyse ved måling af mængden af ​​retroviralt inficerede-NIH3T3 muse fibroblastceller udtrykker enten GFP eller RFP (Fig 2D).

(A) Bekræftelse af vellykket GFP-ekspression i GP2 -293 celler og (B) Bekræftelse af vellykket RFP udtryk i GP2-293 celler efter indførelsen af ​​pMSCV plasmider. BF: lyse felt billede; FL: fluorescensbillede. Scale nøgne er 400 um. (C) Immunblotanalyse illustrerer stabil ekspression af H

ras

V12 og SV40 LTG i GP2-293 cellederivater; 1. BL: GP2-293 blank celle; 2. GFP: GFP indeholdende GP2-293 celle 3. HrasV12-GFP: H

ras indeholder

GP2-293 celle; 4. BL: GP2-293 blank celle; 5. RFP: RFP indeholdende GP2-293 celle 6. SV40LTg-RFP: SV40LTg og RFP indeholdende GP2-293 celle; M: Protein stigen. (D) Flowcytometrianalyse (FACS) af 1x 10

5 NIH-3T3 mus fibroblast efter infektion med retrovirus fremstillet af GP2-293 derivater.

Generation af genetisk modificerede mESCs

Mus embryonale stamceller (Mesc) blev forvandlet af infektion med retrovirus fremstillet af stabile GP2-293 cellederivater. Ekspression af gener indført i mESCs blev verificeret ved immunoblotanalyse (figur 3A og 3B). At bekræfte ændringerne af celleproliferation, blev celleproliferationsassays udført på transformerede mESCs, som også blev sammenlignet for at kontrollere mESCs (fig 3C). Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG viste signifikant stigning i spredning i forhold til Mesc-GFP og -H

Ras

V12 på dag 7 (Fig 3D). Yderligere sammenligne spredning af Mesc-SV40 LTG og Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG med Mesc-RFP, Mesc-SV40 LTG og Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG viste signifikant forbedring af proliferation (fig 3D). Men der var ingen forskel i spredning mellem Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG og Mesc-SV40 LTG (Fig 3D)

Repræsentative billeder fra immunoblotanalyse:. (A) H

ras

V12, (B) SV40 LTG. (C) CCK celleformeringsanalyse for 7 dage af spredning periode mESCs og omdannede mESCs. Sammenligning (D) af proliferationer på dag 7. Mean ± S.D. (N = 3), *, **, og #, ## p 0,05. ANOVA test blev udført med Tukey post-test ved hjælp af GraphPad Prism software.

Vedligeholdelse af stemness efter retroviral ændring af mESCs

For at bekræfte stemness af transformerede mESCs, udtryk for alkalisk phosphatase (AP) og trinspecifik embryonale anitigen-1 (SSEA-1) stamcellemarkør blev evalueret. De transformerede mESCs (Fig 4A- (c) – (e)), udtrykt tilsvarende niveauer af AP-farvning sammenlignet med naive (ikke-transformerede) mESCs (fig 4A- (b)), som angiver uafbrudt vedligeholdelse af udifferentierede celler, som bevarer deres selvfornyelse potentiale . Under yderligere kontrol af udifferentierede tilstand af transformerede mESCs med SSEA-1 specifikt antistof, transformerede mESCs (Fig 4B- (b) – (d)) viste en positiv for denne overflade markør som ligesom ikke-transformerede mESCs (Fig 4B- (en )). Påvisningen af ​​både AP og SSEA-1 i transformerede mESCs vist, at transformationsprocedurer ikke synes at påvirke stemness af mESCs.

(A) alkalisk phosphatase (AP) farvning. Rød-farvede områder angiver alkalisk fosfatase aktivitet. (en). Bright field billede af mESCs; AP-farvning: (b). mESCs; (C). Mesc-H

ras

V12; (D). Mesc-SV40 LTG; (E). Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG. Scale nøgne er 10 um. (B) Immuncytokemi farvning af levende-celler, der udtrykker SSEA1. Par af lyse arkiveret og SSEA1 billeder: (a). mESCs; (B). Mesc-H

ras

V12; (C) .mESC-SV40 LTG; (D). Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG. De repræsentative billeder blev opnået fra fluorescerende mikroskop med TRITC filter. Scale bar er 100 um.

beskrivelser af gensplejsede cancer-lignende stamceller

For at bekræfte onkogene potentiale omprogrammerede mESCs, Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG celler blev enten orthotopisk inokuleret til venstre ovarie bursa eller blokerede inguinale yverfedt pads. På 31 dage efter inokulering, havde en æggestokkene masse dannet i mus, der undergik ortotopisk podning af æggestokkene slimsæk. I modsætning hertil har mus undergået ortotopisk podning med inguinale brystfedtpuden dannede ikke nogen masserne. Den abdominale situs i mus efter æggestokkene inokulation demonstrerede en æggestokkene masse (figur 5A) i form af udvidede venstre æggestok sammenlignet med den normale contra-lateral, ikke-injicerede højre æggestok (Fig 5B). Efter yderligere grov undersøgelse, den injicerede venstre æggestok også synligt demonstreret dannede masse bryde igennem æggestokkene overflade samt at knytte sig til den peritoneal dæksiden. Den retroperitoneal rum viste sig også at være besat af massen klæber til bagvæggen, og venstre nyre (figur 5C). Der var ingen brutto bevis for abdominale metastaser følger af dette æggestokkene masse.

(A). Abdominal site med æggestokkene masse (blå cirkel); (B). Cervix med Livmoder, højre normalt ovarie (blå pil) og venstre ovarie masse (hvid pil); (C). Venstre æggestok med delvist intakte kapsel og masse bryde igennem æggestokkene overflade (blå cirkel).

histo-patologiske analyser af æggestokke injiceret med Mesc afslørede generation af en moden teratom udstiller veldifferentieret pladeepitel med keratinisering og respiratorisk-lignende epitel (fig 6A- (b)) sammenlignet med histologiske træk ved normalt ovarie (fig 6A- (a)). Interessant æggestokke injiceret med Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG også dannet modne teratomer, men derudover viste dele af et umodent teratom indeholdende spredt foci af en høj kvalitet malign neoplasma, kendetegnet ved maligne celler arrangeret lineært , i små klynger, og lejlighedsvis som rudimentære kirtel-lignende strukturer (fig 6A- (c) lille vindue). Større forstørrelse afslørede disse maligne celler til at være dårligt differentieret med høj kerne: cytoplasma-forhold, markant atypiske kerner med groft klumpet kromatin, variabelt fremtrædende nucleoli og talrige mitotiske figurer (Fig 6A- (c)). Mus, der havde deres lyske mamma fedtpuder injiceret med mESCs syntes at have genereret modne teratomer udviser veldifferentieret pladeepitel, der også indeholder pancreasvæv og respiratorisk-lignende epitel med velformet cilier (fig 6B- (b)) i forhold til histologisk vurdering af normalt brystvæv (figur 6B- (a). i modsætning hertil brystet injiceret Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG ikke viste nogen bemærkelsesværdige histologiske forskelle i forhold til den normale, ikke-injicerede … brystvæv

(a) Ovarian Panel: (a) Normal højre (ikke-injiceret) ovarie (100X) Scale bar er 100 um, (b) Venstre Ovarian masse (efter ortotopisk inokulering med Mesc. ), der viser tegn på en moden teratom (lille vindue, 100X) karakteriseret med fokus på moden, keratiniserende pladeepitel inden for det område afbildet inde i kassen (200X) Scale bar er 100 um;.. (c) æggestokkene masse (efter ortotopisk podning med Mesc-H

ras

V12 /SV40-LTG) viser tegn på umodne teratom (lille vindue, 100x) karakteriseret med spredte foci af en høj kvalitet malign neoplasma inden for det område afbildet inde i kassen (400X). Scale bar er 100 pm. (B) Breast Panel: (a). Normal murine mamma-væv (100X). Scale bar er 100 pm; (B). Breast masse (efter ortotopisk podning af Mesc i frigivet lyskelymfeknuder brystfedtpude) udviser tegn på moden teratom (lille vindue, 100X) karakteriseret med respiratoriske-lignende epitel have velformede cilier inden for det område afbildet inde i kassen (200X). Scale bar er 100 um.

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse viser, at mus embryonale stamceller (mESCs) kan reprogramed ind induceret kræft ligesom stamceller (iCLSC) ved indføring af godt definerede onkogene elementer, (simian virus 40 store T onkogen (SV40 LTG) og en onkogene ras (H

ras

V12)) ved hjælp af en mus stilk virus lang terminal gentagelse (MSCV-LTR) -baseret retroviral plasmid .

in vitro

omprogrammerede mESCs udstillet forøgelse af spredning og vedligeholdelse af stamceller egenskaber under

in vitro

dyrkningsbetingelser. Derudover kan de transformerede celler viste også stedspecifikke forskelle i ortotopisk tumordannelse af efter podning af æggestok og brystvæv i immunkompetente mus. Foreslår derfor vi, at

in vitro

omprogrammering af mESCs med onkogene elementer kan være en potentiel metode til at generere induceret kræft ligesom stamceller.

MSCV-LTR retroviral systemet viste sig at være en potentielt nyttigt redskab for effektiv, onkogene transformation af mESCs. Retroviral infektion af mESCs synes meget afhængig af vira genereret fra forskellige typer af retrovirale plasmider. I vores MSCV-LTR retroviralt system vi observeret større infektion evne og vedligeholdelse af stabil genekspression, når der sammenlignes med den fælles Moloney virus-baserede retrovirale systemet (dvs. pBABE udgaven). Vores seneste fund er i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at retrovirus, der blev genereret fra en MSCV-LTR-baserede retroviral plasmid, kunne opretholde langsigtet og stabil ekspression af gener i både embryonale stamceller (ES) celler og hæmatopoietisk stængel (HS) celler [ ,,,0],21, 22].

In vitro

omprogrammering af mESCs til iCLSC opfyldt kravene i veldefinerede onkogene gener, H

ras

V12 og SV40 LTG, for både neoplastisk transformation og anti apoptose. Onkogen ras mutation, som forekommer hos ca. 30% af alle humane tumorer, er kendt for at være involveret i processen med neoplastiske transformation af celler

in vitro

og er blevet godt rapporteret [13, 23, 24]. Men indførelsen af ​​en konstitutivt aktiv form af ras alene (dvs. H

ras

V12) viste sit potentiale sensibiliserende celler til apoptose [24-26], og endda induktion af tidlig celle ældning gennem sammenslutning af p53 ophobning [27 ]. I vores spredning assay med omprogrammeres Mesc, manglen på en væsentlig forøgelse af udbredelsen af ​​den omprogrammeret Mesc med H

ras

V12 alene kunne være delvist forklares ved induktion af enten cellulær aldring eller apoptose gennem ekspression af et konstitutivt aktiv form af H

ras

V12 alene. I modsætning hertil Mesc-SV40 LTG og Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG demonstreret deres forbedrer proliferative effekter. Overvejer en anti-apoptotisk rolle SV40 LTG ved inaktivering af p53 [28], foreslår vi, at indførelsen af ​​SV40 LTG i Mesc kan spille en rolle i forebyggelsen Mesc mod for tidlig cellulær aldring eller induktion af apoptose. Desuden kunne SV40-LTG samarbejder med H

ras

V12 under neoplastisk transformation af mESCs med forebyggelse af H

ras

V12-induceret celledød, som viste sig at være i overensstemmelse med forskellige tidligere rapporter [13, 29, 30].

Den vellykkede vedligeholdelse af stamceller ejendomme i omprogrammerede mESCs kunne bekræftes

in vitro

in vivo

. I processen med

in vitro

omprogrammering af mESCs anvendte vi retroviral infektion til at indføre oncogene komponenter. Selv retroviral indføring af gener har fordelene ved høj infektion og stabil integration af exogene gener i værtskromosomerne, kan vilkårlig insertion af retrovirale komponenter ind i værtsceller genomer ikke udelukke den forstyrrelse eller tab af ekspressionen af ​​stamcelle egenskaber i mESCs. Men vi observere en stabil ekspression af de to stamcellemarkører, alkalisk phosphatase (AP) og SSEA-1 efter retroviral transformation af mESCs. For at få en mere omfattende forståelse af mekanismerne i den underliggende denne vedligeholdelse af stamceller genekspression efter retroviral infektion, er yderligere undersøgelse påkrævet. Ud over vedligeholdelse af stamcelle egenskaber

in vitro

, ortotopisk podning af omprogrammerede mESCs

in vivo

viste også dannelsen af ​​umodne teratomer i æggestokken af ​​mus. Faktisk er den observerede teratom dannelse

in vivo

, herunder umodne, maligne komponenter eksemplificeret også den vellykkede vedligeholdelse af stamcelle egenskaber

in vivo

hele omprogrammering processen.

Hvis udviklingen af ​​forskellige maligne tumorer fra stamcellerne faktisk vil være muligt, kan det kræve yderligere undersøgelser for yderligere at undersøge den særlige rolle, forskellige mikromiljøer i tumorigenese [31]. Vores dyreforsøg tilladt os at observere forskelle i teratom dannelse i to forskellige ortotopisk implantationssteder (æggestok og bryst). I ortotopisk æggestokkene implantation, Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG inducerer dannelsen af ​​umodne teratom udstiller spredt foci af en høj kvalitet malign neoplasma. Men bryst placeret med Mesc-H

ras

V12 /SV40 LTG viste ikke dannelsen af ​​teratom. Selv bidrag mikromiljø i disse to site for generering af malignitet stadig at blive undersøgt, en nylig rapport fra Yan T

et al

foreslog potentielle bidrag tumor-gunstige microenvironmental faktorer under omdannelsen af ​​mus induceret pluripotente stamceller (miPSCs) i cancer stamceller (CSCS) [32]. Derfor mener vi, at æggestokkene mikromiljø kan være gunstige for udviklingen af ​​tumorigenese af mESC- H

ras

V12 /SV40 LTG forhold til det sted, bryst.

Som konklusion, sted, vi demonstrerede vellykket generering af cancer som stamceller ved hjælp af oncogen

in vitro

reprograming af mESCs. De omprogrammerede mESCs blev karakteriseret gennem deres onkogene genekspression og uhindret vedligeholdelse af stamceller egenskaber

in vitro

og

in vivo

. Desuden viste disse modificerede celler dannelsen af ​​teratomer indeholder umodne, maligne dele, når vokser ortotopisk på implantationssted gunstige for tumorigenese. Begrænsninger af denne forskning eksisterer baseret på dannelsen af ​​avancerede teratomer

in vivo

i forhold til spørgsmålet om tumor- gunstige mikromiljøer. Desuden foreslår vi nødvendigheden af ​​en afvigende mikromiljø for udvikling og vedligeholdelse af tumorer afledt af induceret kræft ligesom stamceller. For bedre at forstå de processer af naturlig tumorigenese, samt at etablere mere forudsigelige kræft dyremodeller, fortsatte undersøgelse af de detaljerede roller tumor mikromiljø samt identifikation af potentielt afvigende microenvironmental faktorer vil være forpligtet til at få indblik i den

in vivo

generation af forskellige kræftformer afledt af cancer som stamceller. Vores arbejde har givet banebrydende grundlaget for at muliggøre en række yderligere fremtidige forsknings- applikationer til disse induceret kræft ligesom stamceller, men mere forskning er nødvendig for bedre at forstå de underliggende mekanismer iCLSCs tumorigenese.

Støtte Information

S1 Table . Tumor dannelse i mus

doi:. 10,1371 /journal.pone.0141172.s001

(TIF)

Tak

Forfatterens takker Dr.Yongen Sun for hans support gennemføre alle animalske operationer, Ms Kathy Harvey for hendes korrekturlæsning af manuskriptet, den biorepository og molekylær patologi (BMP) gruppe på Huntsman Cancer Institute for deres venlige støtte i håndteringen af ​​histopatologiske farvning af væv, og Dr. James Marvin og Mr. Chris Leukel for deres venlige støtte til FACS sortering celler i University of Utahs flowcytometri kerne.