PLoS ONE: Anti-Cancer Effekten af ​​silybin Derivatives – En Struktur-aktivitet Relationship

Abstrakt

silybin eller silibinin, et flavonolignan isoleret fra mælk tidsel frø, er en af ​​de populære kosttilskud og er blevet grundigt undersøgt for sin antioxidant, leverbeskyttende og anti-cancer egenskaber. Vi har forestillet at styrken af ​​silybin kunne forbedres yderligere gennem passende modifikation /si sin kemiske struktur. Følgelig her, vi syntetiseret og karakteriseret en serie af silybin derivater nemlig 2,3-dehydrosilybin (DHS), 7-

O

-methylsilybin (7OM), 7-O-galloylsilybin (7OG), 7,23 -disulphatesilybin (DSS), 7-

O

-palmitoylsilybin (7OP), og 23-

O

-palmitoylsilybin (23OP); og sammenlignet deres anti-cancer virkning under anvendelse af human blærecancer HTB9, coloncancer HCT116 og prostata carcinoma PC3-celler. I alle de tre cellelinjer, DHS, 7OM og 7OG demonstrerede bedre væksthæmmende effekter og sammenlignet med silybin, mens andre silybin derivater viste mindre eller ingen effekt. Dernæst vi forberedt de optiske isomerer (A og B) af silybin, DHS, 7OM og 7OG, og sammenlignede deres anti-cancer effekt. Isomerer af disse tre silybin derivater viste også bedre effekt sammenlignet med de respektive silybin isomerer, men i hver, der var ingen klar snit silybin A versus præference B isomer aktivitet. Yderligere undersøgelser i HTB celler fandt, at DHS, 7OM og 7OG udøve bedre apoptotisk aktivitet end silibinin. Klonogene assays i HTB9 celler yderligere bekræftet, at både de racemiske blandinger såvel som rene optiske isomerer af DHS, 7OM og 7OG var mere effektive end silybin. Samlet set tyder disse resultater klart, at den anti-cancer effekt af silybin kunne øges væsentligt gennem strukturelle ændringer, og identificere stærke anti-cancer effekt af silybin derivater, nemlig DHS, 7OM, og 7OG, som betyder, at deres effektivitet og toksicitet bør evalueres i relevante prækliniske kræftmodeller i gnavere

Henvisning:. Agarwal C, Wadhwa R, Deep G, Biedermann D, Gažák R, Kren V, et al. (2013) Anti-Cancer Effekten af ​​silybin Derivatives – En Struktur-aktivitet relationer. PLoS ONE 8 (3): e60074. doi: 10,1371 /journal.pone.0060074

Redaktør: Stephen J. Polyak, University of Washington, USA

Modtaget: December 10, 2012; Accepteret: 21 februar 2013; Udgivet: 28 Mar 2013

Copyright: © 2013 Agarwal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NCI RO1 tilskud CA102514 og CA112304, AMVIS CZ-amerikanske samarbejdsprojekt ME10027 fra Undervisningsministeriet af Tjekkiet (VK og RA), og RVO61388971 (Institutional begrebet Institut for Mikrobiologi, Prag). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

silybin eller silibinin (C

25H

22 °

10, CAS-nr 22888-70-6, figur 1a) er et populært kosttilskud isoleret fra frø af

Silybum marianum

(L.) Gaertn (Family Asteraceae), kendt som marietidsel. Marietidsel ekstrakt betegnet som silymarin har en lang tradition for brug i folkemedicinen og er nu ofte ansat til forebyggelse og /eller behandling af leversygdomme, herunder viral hepatitis, levercirrose forbundet med alkoholmisbrug, leverskader fra narkotika industrielle toksiner [1] – [3]. Silybin også betragtes som en effektiv modgift mod forgiftning med døden cap champignon (

grøn fluesvamp

) [2], [4]. Desuden silybin også udstiller stærk antioxidant aktivitet gennem opfangning hydroxylradikaler og hæmmende lipidperoxidation ved at fungere som en kæde-breaking antioxidant [5], [6]. I de seneste to årtier, foruden hepatobeskyttende og antioxiderende virkning, er silybin demonstreret bemærkelsesværdige anti-cancer samt kræft-kemoforebyggende virkning i præklinisk cellekultur og dyremodeller af flere epiteliale cancere, herunder hud, blære, tyktarm, prostata, lunge etc. [7], [8]. Baseret på disse lovende resultater fra prækliniske studier, er silybin også blevet testet på patienter humane cancer i fase I-II pilot kliniske forsøg, hvor det blev rapporteret at være veltolereret og viste plasma og target-væv biotilgængelighed [7], [ ,,,0],9] – [11]. Flere traditionelle toksikologiske undersøgelser har vist det ikke er giftige for silybin, og det er rapporteret at være sikkert til konsum [10], [12]. Baseret på dens dokumenterede samt nye forebyggende og terapeutiske virkning mod kræft, ville det være af stor betydning og translationel værdi, hvis effekten af ​​silybin kunne forbedres yderligere gennem passende kemisk modifikation /s i sin struktur, da det er indlysende, at silybin har en effektiv “lead struktur”.

(a-h) Kemiske strukturer af silybin, silybin a, silybin B, 2,3-dehydrosilybin, 7-

O

-methylsilybin, 7-

O

-galloylsilybin, 7,23-disulfat silybin, 7-

O

-palmitoylsilybin, og 23-

O

-palmitoylsilybin.

i de seneste år har der været en større vægt på at forstå den detaljerede kemiske struktur af silybin, identificere og syntetisere sine stereoisomerer samt vurdere deres biologiske effektivitet [13] – [17]. Silybin er nu bekræftet at være en 01:01 blanding af to optiske isomerer nemlig silybin A og silybin B (figur 1b og 1c). Endvidere den detaljerede rolle respektive hydroxylgrupper og dele af silybin er nu godt karakteriseret, og at viden har tilladt identifikation af egnede steder til udformning og syntese af hidtil ukendte silybin derivater uden at påvirke den biologiske aktivitet af de resulterende konjugater [18] , [19]. Disse undersøgelser har påpeget, at de bedst egnede positioner til silybin modifikationer er 7-OH og /eller 23-OH [18], [19]; og baseret på disse kritiske observationer har flere derivater af silybin blevet designet, syntetiseret og karakteriseret [20] – [23]. For eksempel har vi syntetiseret og karakteriseret 7

-O

– og 23

-O

acyl-derivater af silibinin med varierende acyl kædelængder og har bekræftet deres antioxidant og anti-virale aktiviteter [20]. Ligeledes har en række silybin galloyl estere også blevet syntetiseret, og 7

-O

-galloylsilybin blev identificeret som den mest effektive forbindelse i form af anti-angiogene effekt [21]. Vi har også rapporteret, at den antiangiogene virkning af B-isomeren af ​​7

-O

-galloylsilybin er betydeligt højere end A-isomer [21]. Ligeledes silybin oxidationsprodukt, 2,3-dehydrosilybin, er også blevet syntetiseret, der viste bedre antioxidant potentiale end silybin; carboxylsyrederivatet af 2,3-dehydrosilybin, nemlig 2,3-dehydrosilybinic syre, har vist bedre anti-lipid-peroxidation og anti-radikaler aktiviteter og viser bedre vandopløselighed [22], [24]. Vi har også udarbejdet en stor serie af

O

ky derivater (methyl- og benzyl) af silybin og 2,3-dehydrosilybin, og har identificeret nogle nye derivater med stærk effekt mod P-glycoprotein-medieret lægemiddel efflux aktivitet [23]. Tilsammen ovennævnte undersøgelser klart antydet, at den biologiske effekt af silybin kunne øges væsentligt gennem passende kemiske modifikationer.

Med den opfattelse, at flere af silybin derivater har vist bedre aktivitet, forælder molekyle i forskellige biologiske systemer, og at silybin selv udøver stærk anti-cancer effekt, i nærværende undersøgelse, vi sammenlignet anti-cancer effekt af flere silybin derivater (både eksisterende samt nydesignede) i tre forskellige humane cancer cellelinjer, og identificeret tre silybin derivater med anti- cancer aktivitet bedre end silybin.

Materialer og metoder

Cell Culture, Behandling og reagenser

Menneskelige blære kræft HTB9 celler, tyktarmskræft HCT116 celler og prostata karcinom PC3 celler blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HTB9 og PC3-celler blev dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycinsulfat ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 incubator. HCT116 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycinsulfat ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 incubator. Alle cellekultur materialer var fra Invitrogen Corporation (Gaithersburg, MD). Celler blev udpladet og behandlet ved 40-50% konfluens med forskellige doser af silybin eller dets derivater (5-60 um i medium) oprindeligt er opløst i DMSO for de ønskede tidsperioder under serum tilstand. En lige mængde af DMSO (køretøj) var til stede i hver behandling, herunder kontrol; DMSO-koncentration oversteg ikke 0,1% (vol /vol) ved nogen behandling. Ved udgangen af ​​ønskede behandlinger blev forskellige analyser udført som beskrevet senere. Primært antistof i cPARP og anti-kanin peroxidase-konjugeret sekundært antistof blev indkøbt fra Cell Signaling (Beverly, MA). Antistof til tubulin var fra NeoMarkers (Fremont, CA). Hoechst 33342, krystalviolet og propidiumiodid (PI) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL detection system og anti-muse peroxidasekonjugeret sekundært antistof var fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Alle andre reagenser blev opnået i deres kommercielt tilgængelige renhed kvalitet højest.

Kemi

Silymarin som grundmateriale for alle på hinanden følgende produkter er indhentet fra Liaoning Senrong Pharm. Co, LTD (Panjin, Liaoning-provinsen, Kina). Optisk rent silybin A og silybin B blev opnået som beskrevet tidligere [25], [26]; navnlig en ny præparativ adskillelse metode udviklet af os for nylig [25], [26], som er baseret på lipase-katalyseret enzymatisk diskriminering af både silybin stereoisomerer, muliggjorde fremstillingen af ​​alle derivaterne nævnt i dette værk i optisk ren form i store skala. Fremgangsmåderne til syntese, de synteseskemaer og de analytiske data bekræfter strukturen af ​​det tidligere syntetiseret og rapporteret silybin derivater (som blev evalueret for deres anti-cancer-aktivitet i den foreliggende undersøgelse) er opsummeret i Methods S1 og fig S1, S2, S3, S4, S5, og tabel S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, hhv. Kort fortalt blev 2,3-Dehydrosilybin (DHS) A og B fremstilles ved en basekatalyseret oxidation af respektive silybin A og B som beskrevet for nylig [22], [24]; 7-

O

-Methylsilybin (7OM) A og B blev fremstillet ved basekatalyseret methylering af respektive silybin A og B [23]; og 7-

O

-palmitoylsilybin (7OP), 23-

O

-palmitoylsilybin (23OP) og 7-

O

-galloylsilybin (7OG) fra både silybin A og B blev syntetiseret som beskrevet tidligere af os [20] – [23].

Forberedelse på 7,23-disulfat silybin [silybin-7,23-diyl

bis

(hydrogensulfat), DSS], og karakterisering af Mass og NMR spektre

til en omrørt opløsning af silybin [silybin a, silybin B eller naturlig silybin a B (01:01), 200 mg, 0,43 mmol] i DMF (2 ml), Py⋅SO

3 (200 mg, 1,26 mmol) blev tilsat. Reaktionen blev standset efter 1 h omrøring ved 40 ° C ved tilsætning af EtOH (0,5 ml). Efter en kort omrøring, blev reaktionsblandingen påsat søjlen af ​​silicagel og kromatograferet med opløsningsmidlet EtOH /MeOH /CH

2Cl

2 /vand (2/1/9 /0,3), hvilket gav en lysegul olie, der blev lyofiliseret for at opnå titelforbindelsen enten som den rene diastereomer a eller B eller blandingen a B (cca 160 mg, 60%) som et svagt gult lyofilisat

massespektrene af det syntetiserede. forbindelse, blev målt på en matrix-assisteret laser desorption /ionisering reflectron time-of-flight MALDI-TOF massespektrometer UltraFlex (Bruker-Daltonics, Bremen, Tyskland). Positive spektre blev kalibreret eksternt ved hjælp af monoisotopisk [M + H] + ion af menneskelig angiotensin I 1296,69

m /z

, MRFA peptid 524,26

m /z

og CCA matrix peak 379,09

m /z

. En 10 mg /ml opløsning af α-cyano-4-hydroxy-kanelsyre eller 2,5- dihydrobenzoic syre i 50% MeCN /0,3% eddikesyre blev anvendt som en MALDI-matrix. A 1 pi af prøven opløst i vand blev tilladt at tørre ved omgivelsestemperatur, og over-lagt med en 0,3 pi af matrixen løsning på målet. MALDI-TOF-positive eller negative spektre blev opsamlet i reflectron mode. MS (MALDI-TOF):

m /z

(%) = 643 (17, M

+ + H.), 561 (32), 547 (36), 545 (100), 481 (25), 465 (69).

NMR spektre blev målt på Bruker AVANCE III 400 (observation frequence 400,13 MHZ for

1H, 100,62 MHz for

13C) i DMSO

d

6

(Sigma Aldrich) ved 30 ° C. Resterende opløsningsmiddel signal blev anvendt som intern standard ((δ

H 2.500, δ

C 39,60). Kemiske skift og interaktion konstanter blev registreret fra spektre, hvor vægtning funktioner (eksponentielle med negativ eksponent og Gauss-funktion) blev anvendt. kemiske skift er udtrykt i δ-skala (ppm) og interaktion konstanter i Hz. Digital opløsning giver mulighed for at udtrykke kemiske skift af protoner med tre og kul med to decimaler, henholdsvis og proton-proton interaktion konstanter med en decimal. Multiplicitet af kulstof-signaler blev bestemt ud fra proton-redigerede HSQC spektre Signal opgave er baseret på 2D NMR eksperimenter -. COSY, HSQC, HMBC, der blev udført ved hjælp af standard programmer (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, DE)

1 H og

. 13C NMR spektre af både optisk rent silybinA-7,23-diyl

bis

(hydrogen sulfat) og silybinB-7,23-diyl

bis

(hydrogen sulfat), som ikke er blevet rapporteret hidtil, er skitseret i tabel 1 og 2.

cellevækst Analyser

i hvert tilfælde celler udpladet til omkring 40-50% sammenløb og behandlet med silybin eller dets derivater eller rene isomerer af hver forbindelse under serum tilstand som beskrevet ovenfor. Efter 24 og 48 timer af behandlinger blev celler opsamlet ved kort trypsinisering og vasket med PBS. Totalt celleantal blev bestemt ved tælling hver prøve in duplo under anvendelse af et hæmocytometer under et omvendt mikroskop. Hver behandling og tidspunkt havde tre uafhængige plader.

Apoptose Assay

Kvantitativ apoptotisk celledød ved silybin og blodprodukter i HTB9 celler blev målt ved Hoechst assay som tidligere beskrevet [27]. Kort fortalt, efter ønskede behandlinger blev celler opsamlet og derefter farvet med DNA-bindende farvestof Hoechst 33342 og PI. Apoptotiske celler blev kvantificeret under anvendelse af fluorescerende mikroskop (Axioskope 2 plus-HBO 100, Zeiss, Jena, DE) ved at tælle celler /mikroskopisk felt (ved 400 ×) i seks felter for hver prøve (i tre kopier). Apoptotiske celler viste lyse blå (tidlig apoptotisk) eller orange-rød fluorescens (sent apoptotisk), som blev adskilt fra nekrotiske celler viser lyse rød fluorescens (PI-farvet).

Western Blotting

For Western blotting, lysater (80 ug) blev denatureret i 2X SDS-PAGE-prøvebuffer og blev opløst på 8% Tris-glycin-geler. De separerede proteiner blev overført til nitrocellulosemembran efterfulgt af blokering med 5% fedtfri mælkepulver (vægt /volumen) i Tris-saltvand (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) til 1 time ved stuetemperatur. Efter blokering blev membranerne probet med primært antistof i 2 timer ved stuetemperatur og derefter natten over ved 4 ° C efterfulgt af passende peroxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur og visualiseret ved ECL detektionssystem. I hvert tilfælde blev blots udsat for flere engagementer på filmen for at sikre, at bandet tætheden i det lineære område. For alle resultater, blev autoradiogram /bands scannet med Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA). For at sikre lige protein lastning, blev hver membran strippet og re-testet med α-tubulin antistof.

Klonogen Assay

HTB9 udpladedes i 6-brønds plader og tilladt at fastgøre til pladerne i 24 timer. Derefter, afhængig af protokol behandling, celler blev behandlet med hver forbindelse hver 72 timer eller behandlet kun i 2 timer hver 24 timer. Ved udgangen af ​​angivne periode blev cellerne vasket to gange med iskold PBS, fikseret med blandingen af ​​methanol og iseddikesyre (03:01) i 10 minutter og derefter farvet med 1% krystalviolet i methanol i 15 minutter efterfulgt af vask med deioniseret vand. Kolonier med mere end 50 celler blev talt.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SigmaStat 2,03 software (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Dataene blev analyseret ved hjælp af en måde ANOVA efterfulgt af Tukey t-test, og en statistisk signifikant forskel blev behandlet på

s

≤0.05.

Resultater

Effekt af silybin og dets derivater på cancer Cell Growth

først, vi sammenlignede væksthæmmende effekt af silybin og dets derivater (kemiske strukturer vist i figur 1) DHS, 7OM, 7OG, DSS, 7OP og 23OP i humane kræftceller fra blæren , tyktarm og prostata oprindelse, nemlig HTB9, HCT116 og PC3 henholdsvis; især har silibinin vist stærke anti-cancer effekt i pre-cancer modeller af blære, tyktarm og prostatakræft [7], [8]. Som vist i tabel 3, i HTB9 celler ved 30 og 60 uM doser, DHS, 7OM og 7OG var mere effektive end silybin efter 24 og 48 h behandlinger med hensyn cellevækstinhiberingen; dog på ækvimolære koncentrationer, de væksthæmmende virkninger af andre derivater, nemlig DSS, 7OP, og 23OP, var usammenhængende og enten lig med eller lavere end silybin. Ligeledes i HCT116 celler, DHS, 7OM og 7OG var mere effektive til at hæmme cellevækst sammenlignet med silybin og andre silybin derivater (tabel 3). I PC3-celler, silybin derivat (30 og 60 uM doser) viste tilsvarende eller bedre vækstinhibering end silybin Efter 24 timers behandling (tabel 3). Igen, DHS, 7OM og 7OG var meget mere effektiv end silybin eller andre derivater efter 24 og 48 timer af behandlinger i form af cellevækstinhiberingen; Men virkningen af ​​andre silybin derivater (DSS, 7OP, og 23OP) blev i vid udstrækning tabt ved 48 h tid-point (tabel 3). Samlet set viser disse resultater viste klart, at kun DHS, 7OM og 7OG derivater af silybin har meget stærkere anti-cancer effektivitet end forælder struktur, og derfor kun disse tre derivater blev anvendt i efterfølgende studier.

Effect silybin og dets derivater på Apoptose induktion i HTB9 Celler

Næste sammenlignede vi effekten af ​​silybin og dets tre mest aktive derivater (DHS, 7OM og 7OG) ved 30 uM dosis på induktionen af ​​apoptotisk celledød i HTB9 celler. Som vist i figuren 2A-bundpanel, efter 24 timers behandling, silybin og dets derivater signifikant forøgede apoptotisk celledød i HTB9 celle, og 7OG var mest potente til at inducere apoptose. Men Western blot analyser for apoptose markør cPARP viste en kraftig stigning med kun 7OG (figur 2A-øverste panel). Den bedre effekt af silybin derivater var mere tydeligt efter 48 timers behandling, hvor DHS, 7OM og 7OG steg betydeligt apoptotiske cellepopulation (figur 2B-bund panel) samt øget niveauet cPARP i HTB9 celler (figur 2B-øvre panel). Disse resultater bekræftede yderligere den stærke og bedre anti-cancer virkning af DHS, 7OM og 7OG forhold til silybin mod HTB9 celler.

(A-B) HTB9 celler blev behandlet med 30 pM dosis af silybin (SB), 2,3-dehydrosilybin (DHS), 7-

O

-methylsilybin (7OM), og 7-

O

-galloylsilybin (7OG). Efter 24 eller 48 timer af hver behandling blev cellerne opsamlet og apoptotisk befolkning blev bestemt ved Hoechst assay som beskrevet i “Materialer og metoder”. I baren diagrammer, hver data-punkt repræsenterer middelværdi ± SD af 3 prøver. (A-B, Western Blot indsætte) Cellerne blev også indsamlet efter silybin eller dets derivater behandling og analyseret for cPARP protein niveau ved Western blotting. I hvert tilfælde blev membraner også strippet og igen probet med α-tubulin antistof til at kontrollere protein loading. * P≤0.001.

Effekt af Pure optiske isomerer af silybin og dets derivater på kræft cellevækst

Som nævnt ovenfor, at silybin er en blanding (01:01 forhold) af optisk isomerer silybin A og silybin B, vi næste fremstillet store mængder af disse to silybin isomerer og anvendt dem til at syntetisere store mængder af deres derivater DHS (A og B), 7OM (A og B) og 7OG (A og B) som opsummeret i metoder ovenfor. Disse rene optiske isomerer af silybin og deres derivater blev derefter vurderet for deres cancervækst celle inhiberende virkninger. I alle de tre cancercellelinier, nemlig HTB9, HCT116 og PC3, rene isomerer (30 og 60 uM doser) af DHS, 7OM og 7OG var mere effektiv i forhold til respektive isomer af silybin efter 24 og 48 timer af behandlinger (tabel 4) . Da vi sammenlignede cellevækst inhiberende virkninger af isomer A versus isomer B og deres respektive derivater, kunne ingen klar snit observation gøres imidlertid silybin B-isomer og dens derivater syntes mere effektiv end isomer A og dets derivater (tabel 4).

Næste, vi sammenlignede væksthæmmende effekter af lavere doser (5 og 10 uM) af optiske isomerer af silybin (silybin A og silybin B) samt derivater DHS (A og B), 7OM (A og B) og 7OG (A og B) i HTB9 celler. Som vist i figur 3, ved 5 uM dosis, forskellen mellem silybin og dets derivater var mindre slående. Men ved 10 uM koncentration, forskellen i effektiviteten af ​​silybin isomerer med derivater deraf isomerer var helt tydelig med stærkere hæmning vækst ved derivater sammenlignet med forælder strukturer, specielt efter 48 h behandlinger (figur 3). Samlet set viser disse resultater antydede, at i lighed med en bedre aktivitet af racemiske silybin isomerer nemlig DHS, 7OM og 7OG sammenlignet med forælder racemisk silybin, derivaterne af ren silybin isomerer A og B er også mere effektive i forhold til deres respektive rene silybin A og B isomerer .

HTB9 celler blev behandlet med 5 og 10 uM doser silybin A, 2,3-dehydrosilybin A, 7-

O

-methylsilybin A, 7-

O

-galloylsilybin A eller silybin B, 2,3-dehydrosilybin B, 7-

O

-methylsilybin B, 7-

O

-galloylsilybin B. Efter 24 eller 48 timer af hver behandling, i alt celle nummer blev bestemt som beskrevet i “Materialer og metoder”. I baren diagrammer, hver data-punkt repræsenterer middelværdi ± SD af 3 prøver. * P≤0.001; # P≤0.01; $ P ≤ 0,05.

Effekt af racemiske blandinger og Pure optiske isomerer af silybin og dets derivater på Colony Formation i HTB9 Celler

Næste, vi sammenlignet effekten af ​​racemiske blandinger og rene isomerer af silybin og dets tre mest effektive DHS, 7OM og 7OG derivater på kolonidannelse ved HTB9 celler. I det første forsøg anvendte vi en dosis på 20 uM alle forbindelserne og vi observeret en fuldstændig inhibering af kolonidannelse med silybin samt derivater deraf (data ikke vist). Derfor næste vi anvendte lavere doser af racemiske blandinger såvel som rene isomerer af silybin og dets derivater. Som vist i figur 4A, DHS, 7OM, og 7OG (5 og 10 uM doser hver 72 h) inhiberede kolonidannelse med HTB9 celler, og alle tre derivater var mere effektive end silybin ved begge doser. Tilsvarende behandling (5 og 10 uM doser) med rene isomerer (A og B) af DHS, 7OM, og 7OG også inhiberede kraftigt kolonidannelse med HTB9 celler; isomerer af alle de tre derivater blev endeligt mere effektive i forhold til de respektive isomerer silybin A og silybin B (figur 4A). Blandt alle de rene isomerer i dette assay, udviste 7OG-B den højeste effekt (figur 4A).

(A) HTB9 celler (~1000 celler) blev udpladet i plader med 6 brønde og behandlet hver 72 timer med 5 og 10 uM doser silybin (SB), 2,3-dehydrosilybin (DHS), 7-

O

-methylsilybin (7OM), 7-

O

-galloylsilybin (7OG), silybin A (SB-A), 2,3-dehydrosilybin A (DHS-A), 7-

O

-methylsilybin A (7OM-A), 7-

O

-galloylsilybin A ( 7OG-A) eller silybin B (SB-B), 2,3-dehydrosilybin B (DHS-B), 7-

O

-methylsilybin B (7OM-B), 7-

O

-galloylsilybin B (7OG-B). Den 11.

th dag blev cellerne behandlet og kolonier med mere end 50 celler blev talt. (B) HTB9 celler (~1000 celler) blev udpladet i plader med 6 brønde og behandlet i 2 timer hver 24. time med 20 pM dosis af silybin (SB), silybin A (SB-A), 2,3-dehydrosilybin A (DHS -A), 7-

O

-methylsilybin A (7OM-A), 7-

O

-galloylsilybin A (7OG-A) eller silybin B (SB-B), 2, 3-dehydrosilybin B (DHS-B), 7-

O

-methylsilybin B (7OM-B), 7-

O

-galloylsilybin B (7OG-B). Efter 7 dage blev cellerne behandlet og kolonier med mere end 50 celler blev talt. I baren diagrammer, hver data-punkt repræsenterer middelværdi ± SD af 3 prøver. *, P≤0.001; #, P≤0.01; $, P ≤ 0,05.

I en anden behandling regime blev HTB9 celler eksponeret for 20 uM dosis af silybin eller isomerer af silybin og dets derivater (DHS, 7OM, og 7OG) i 2 timer, og derefter blev frisk medium tilsat uden forbindelserne, og samme behandling protokol blev fulgt hver 24 timer. Disse eksperimentelle betingelser var baseret på vor iagttagelse i udfyldt klinisk forsøg, hvor vi har rapporteret silybin halveringstid og koncentration i plasmaet hos kræftpatienter i det samme område, dvs. 20 pM silybin i ca. 2 timer [28] Som vist i figur 4B, under disse behandlingsbetingelser blev effekten af ​​alle forbindelserne kompromitteret til en vis grad, men stadig 7OG og DHS bibeholdt højere inhiberende virkning mod HTB9 kolonidannelse. Denne analyse bekræftede, at 7OG er den mest effektive blandt alle de silybin derivater efterfulgt af DHS og 7OM.

Diskussion

Kræft er en af ​​de førende årsager til dødelighed og sygelighed i hele verden. I USA alene, blev i alt 1,638,910 nye kræfttilfælde og 577,190 kræftdødsfald forventes at forekomme i 2012 [29]. Med den stigende brug af billeddiagnostiske værktøjer og biomarkører, mange kræftformer diagnosticeret på tidlige stadier, hvor terapeutiske muligheder er ret begrænset på grund af iboende bivirkninger forbundet med disse behandlinger. I sådanne patienter, kræft kemoforebyggelse og /eller indgriben gennem ikke-toksiske midler såsom silybin kunne være et attraktivt alternativ løsning kombineret med vagtsomme-venter. Desuden er kræft kemoterapi ofte begrænset af ledsagende akut toksicitet især hepatotoksicitet, hvilket resulterer i reduktion eller forsinkelser dosis i terapi, potentielt øge risikoen for tilbagefald [8]. Silybin har en lang tradition for brug for sine leverbeskyttende fordele, og derfor kan det bruges sammen med kemoterapeutiske stoffer som hepatobeskyttende [8]. Udover sænkning toksicitet, kunne silybin forbedre effektiviteten af ​​alle cancerpatienter kemoterapeutiske lægemidler [30]. I denne forbindelse har vi beskrevet, at silybin kraftigt synergizes humane prostata carcinoma celler til doxorubicin-, cisplatin, carboplatin- og mitoxantron-induceret vækstinhibering og apoptotisk død [31] – [33]. Lignende synergistiske virkninger af silybin med doxorubicin og cisplatin er også blevet rapporteret i forskellige andre cancer cellelinjer [34] – [37]. Andre almindelige elementer, der bidrager væsentligt til carcinogenese er kronisk inflammation og oxidativt stress [38]. Derfor er frugter og grøntsager, der er rige på antioxidanter samt anti-inflammatoriske midler anbefales til cancer chemoforebyggelse strategier [38]. Silybin har vist anti-inflammatoriske og antioxidant egenskaber [38], der giver en ekstra begrundelse for dens anvendelse i forebyggelse og indgriben kræft.

En af de store begrænsninger, der har hindret silybin terapeutiske anvendelighed i fortiden, er dens biotilgængelighed, hvilket i høj grad skyldes den store multi-ring struktur og lav vandopløselighed [22]. Flere silybin formuleringer (fosfatidylcholin, nano-suspensioner, etc.) er blevet testet til yderligere at forbedre sin biotilgængelighed og disse formuleringer har vist betydelig forbedring i silybin biotilgængelighed [12]. For eksempel blev silybin formulering med phosphatidylcholin (kendt som ‘Silipide «, varebetegnelse’ Siliphos) afprøvet i prostatakræft og tyktarmskræft patienter og afslørede høj plasma biotilgængelighed [9] – [11]. En anden tilgang til at forbedre silybin biotilgængelighed samt biologiske effekt er gennem passende kemisk modifikation /s i sin struktur; navnlig er silybin struktur såvel som rollen af ​​dens funktionelle dele godt karakteriseret i nyere undersøgelser [13], [18], [19]. I denne forbindelse har vi allerede med succes syntetiseret og karakteriseret en serie af silybin derivater, der er konstateret flere af dem med overlegen antioxidant og antiangiogene aktiviteter og fundet dem vandopløselige, når man sammenligner med silybin [20] – [23]. Baseret på disse vigtige resultater og i lighed, her vi syntetiseret og karakteriseret en anden silybin derivat, nemlig 7,23-disulfat silybin (DSS), som er en potentiel silybin metabolit i fase II biotransformation, og sammenlignet silibinin anticanceraktivitet med DSS samt flere tidligere syntetiseret silybin derivater, såsom DHS, 7OM, 7OG, 7OP, og 23OP. De store resultater af disse effektforsøg er: a) 7OG, DHS, 7OM konsekvent udviste anti-cancer effekt bedre end silybin, mens silybin derivater DSS, 7OP og 23OP viste mindre eller inkonsekvent effektivitet; understøtter en overordnet struktur-aktivitetsforhold; b) de rene optiske isomerer af 7OG, DHS, og 7OM udøvede også bedre anti-cancer effektivitet sammenlignet med respektive silybin isomerer (A og B); c) der var ingen klar cut præference mellem A- og B-isomerer med hensyn til virkning af silybin eller dets derivater; og d) den samlede effekt af disse silybin derivater var afhængig både af typen af ​​funktionel gruppe til stede, samt deres rumlige lokalisering.

Sammenfattende viser resultaterne fra den foreliggende undersøgelse viste, at anti-cancer virkning af silybin kunne øges væsentligt gennem passende ændringer i dets kemiske struktur, og identificeret 7OG, DHS, og 7OM som mere effektive silybin derivater. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere observationer viser, at substitution ved C-7 af silybin struktur forbedrer stærkt sin antioxidant og /eller antiradikal aktivitet. Da vores resultater med tre bly silybin derivater var konsistente i tre helt forskellige humane cancercellelinier, foreslår vi, at den observerede anti-cancer-aktivitet i ikke-cellelinie specifikke.