PLoS ONE: Rhodacyanine Afledte selektivt Mål Cancer Cells og overvinder Tamoxifen Resistance

Abstrakt

MKT-077, en rhodacyanine farvestof, viste sig at producere kræft specifik celledød. Imidlertid komplikationer forhindret anvendelsen af ​​denne forbindelse ud over kliniske forsøg. Her beskriver vi YM-1, et derivat af MKT-077. Vi fandt, at YM-1 var mere cytotoksiske og lokaliseret anderledes end MKT-077. YM-1 demonstrerede denne cytotoksicitet på tværs af flere kræftceller. Denne toksicitet blev begrænset til kræft cellelinjer; udødeliggjort celle modeller var upåvirket. Korte anvendelser af YM-1 blev fundet at være ikke-toksiske. Kortvarig behandling med YM-1 gendannet tamoxifen følsomhed over for et ildfast tamoxifen-resistente MCF7 cell model. Denne effekt er potentielt skyldes ændret østrogenreceptor alfa phosphorylering, et resultat udfældes ved selektive reduktioner i Akt niveauer (AKT /PKB). Således kunne ændringer af rhodocyanine stillads potentielt gøres for at forbedre effektivitet og farmakokinetiske egenskaber. Desuden kunne indvirkningen på tamoxifen følsomhed være et nyt hjælpeprogram for dette stof familie

Henvisning:. Koren J III, Miyata Y, Kiray J, O’Leary JC III, Nguyen L, Guo J, et al. (2012) Rhodacyanine Afledte selektivt Mål Cancer Cells og Overvinder Tamoxifen Resistance. PLoS ONE 7 (4): e35566. doi: 10,1371 /journal.pone.0035566

Redaktør: Leonard Petrucelli, Mayo Clinic, USA

Modtaget: 9. februar 2012; Accepteret: 17 marts 2012; Udgivet: 26 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Koren et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dr. Dickey blev støttet af Alzheimers Association, CurePSP (Progressive supranukleær lammelse), National Institutes of Health /National Institute on Aging (NIH /NIA) R00AG031291 og NINDS (National Institute of Neurologiske og Stroke) R01NS073899. Dr. Gestwicki blev støttet af NIH R01NS059690. Dr. Cheng blev støttet af James Esther Kong Grant 1KG02-33967. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MKT-077, en kationisk rhodacyanine, har vist kræft specifik toksicitet og væksthæmning

in vitro

in vivo

tværs af flere kræft sorter [1]. Det blev bestemt, at MKT-077 lokaliseret til mitokondrierne [1]. MKT-077 indgik i kliniske forsøg til behandling af avancerede og ildfaste solide tumorer af forskellig cellulær oprindelse, herunder: nyre, lunge, prostata, colon, adenokarcinomer, og melanomer [2], [3]. Den primære negative bivirkning observeret i begge undersøgelser var renal toksicitet [2], [3]. Den observerede toksicitet standsede rekruttering til en rettergang, som lignende undersøgelser dyr viste irreversibel renal toksicitet efter administration af MKT-077 [2], [3]. Senere blev det opdaget, at MKT-077 interageret med Mortalin (MOT-2), en 70 kDa varmechokprotein (Hsp70) familiemedlem, og at interaktionen mellem MKT-077 med MOT-2 inducerede frigivelsen af ​​tumor suppressor p53 fra et kompleks med MOT-2 [4]. Dette mot-2 /p53-komplekset inaktiveret de tumor undertrykkelse evner p53 ved at udskille det i cytosolen

in vivo

[5].

Brystkræft er blandt de mest almindelige kræftformer diagnosticeret hos kvinder [ ,,,0],6]. Publicerede data, at behandling af MCF7-celler, en brystcancer celle model, med MKT-077 producerer cytotoksicitet og ændrer vækst [1], [2]. Men i resultaterne af to publiceret kliniske fase I forsøg, ingen patienter med en fast brysttumor eller refraktær brysttumor blev inkluderet i undersøgelsen [2], [3]. Selv om der er mange brystkræft kemoterapi, modstandsdygtighed over for brystkræft behandlingsformer kan opstå i omkring 30% af kvinder i behandling for brystkræft [7]. Kendte modstande i brystkræft er blevet observeret for ikke kun standard anti-cancer strategier, såsom doxorubicin, men også trastuzumab og tamoxifen (4-OHT) [8], [9], [10].

Breast kræft har også en høj forekomst af mutationer; mutationer, som kan fremme tumorigenese og overlevelse [11]. Mens disse mutationer producere mål for behandlinger, kan andre mutationer overvinde signalkaskade netværk kredsløb for at fjerne opstrøms mål [12], [13]. Dette reducerer antallet af potentielle mål, hvilket reducerer cadre af behandlingsmuligheder, og øge potentialet for resistens tilblivelse. Desuden kan resistens opstå når regulatoriske proteiner er ændret for at tillade pro-overlevelse proteiner til at handle med uformindsket styrke. Adskillige kinaser relateret til celle overlevelse har været impliceret i lette kemoterapi modstand [14], [15], [16], [17], [18]. For eksempel phosphorylering af østrogenreceptoren alpha (ERa) forårsager ERa at blive aktiv uanset østrogen binding, hvilket resulterer i resistens mod 4-OHT. Således strategier til at re-bevidstgøre ildfaste cancerceller til eksisterende behandlingsformer er hårdt brug for.

I disse data, vi identificerer et funktionelt derivat af MKT-077, der viste øget cytotoksicitet på tværs af flere kræft sorter, men bevare kræft specificitet forbundet med MKT-077. Denne forbedrede aktivitet skyldtes den intracellulære lokalisering af forbindelsen. Desuden korte behandlinger med YM-1 var i stand til resensitize kræftceller, der havde udviklet resistens over for ERa antagonist, tamoxifen. En måde, hvorpå disse forbindelser fungerer, er ved at reducere de samlede Akt niveauer, der kan bidrage til ERa ufølsomhed over for tamoxifen. Kombineret, den rhodacyanine stillads rummer et stort potentiale som cancer terapeutisk både som individuel behandling strategi, men også potentielt som multikombinerbare eller synergistisk option til brug med eksisterende regimer.

Metoder

cellelinier

Tamoxifen resistente (TR-MCF7) og forældreorlov MCF7 celler blev generøst tilvejebragt af Dr. Jin Q. Cheng fra Moffitt Cancer center (Tampa, FL). Den MCF7 linje blev oprindeligt genereret af Michigan Cancer Foundation og blev opnået fra ATCC (Manassas, VA) og TR-resistens blev produceret af kronisk behandling med lav dosis med tamoxifen. HEK-293, M17, H4, MDA-MB-231, Hs578T og NIH-3T3-celler blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA). HeLa-celler blev generøst tilvejebragt af Dr. Kenneth E. Ugen på University of South Florida. Han oprindeligt fået dem fra ATCC (Manassas, VA). Disse celler blev genereret fra en cervikal tumor fra Henrietta Lacks.

Kemikalier og antistoffer

Methylenblåt (MB) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). MKT-077 og YM-1 blev syntetiseret som beskrevet [19]. Anti-Akt1, Akt2, og pAktS473 blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-ERa, og pERα S167 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Actin blev købt fra Sigma Aldrich. Anti-GAPDH blev købt fra Meridian Life Science (Memphis, TN).

Cell Kultur og Drug behandlinger

MCF7, MDA-MB-231, Hs578T og HeLa-celler blev dyrket som tidligere beskrevet [ ,,,0],20]. H4 og HEK-293-celler blev dyrket i OPTI – modificerede Eagles medium (OPTI-MEM) fra Invitrogen suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% PenStrep (Invitrogen). M17-celler blev dyrket i OPTI-MEM suppleret med 10% FBS, 1% PenStrep og 100 mg /L natriumpyruvat. NIH-3T3-celler blev dyrket i DMEM med lavt natriumbicarbonat (1,5 g /l) fra ATCC suppleret med 10% FBS og 1% PenStrep. TR-MCF7 celler blev dyrket i DMEM (beskrevet med MCF7-celler) suppleret med 10 pM 4-OHT. MKT-077 og YM-1 blev opløst i DMSO. DMSO blev anvendt som vehikel til MKT-077 og YM-1 er angivet. Nøjagtige behandlingsstrategier ledsage data i resultater sektionen.

Protein Collection, blev Kvantificering og Western Blotting

Celler høstet ved anvendelse af pattedyrprotein udvinding reagens (Thermo) som tidligere beskrevet [20]. Protein niveaumåling, ækvilibrering, western blotting og påvisning blev udført som tidligere beskrevet [20].

lactatdehydrogenase (LDH) assay

indikeret cellelinier blev udpladet i udpegede medium. Når cellerne nåede ~ 95% sammenflydning, blev MKT-077 eller YM-1 anvendes i DMEM uden phenolrødt. Efter viste tidspunkter pr eksperiment blev medium opsamlet fra hver behandling og centrifugeret for at pelletere døde celler og nedbrudt materiale. Protokol blev fulgt som leveret fra Cytotox-96-kit (Promega).

mitokondrie Isolering og spektroskopi

MCF7-celler blev behandlet i 6 timer med vehikel (DMSO), MB, YM-1, eller MKT-077. Efter behandling blev cellerne høstet og subcellulære fraktioner opsamlet under anvendelse Pierce Mitochondrial Isolation Kit fra Thermo Scientific (Rockford, IL). Analyse af lokalisering lægemiddel blev udført ved spektroskopi på Thermo Scientific NanoDrop spektrofotometer. Koncentrationer og efterfølgende procentdele blev tilnærmet ved genereret koncentration:. Absorbans kurve (ikke vist)

MTT cellelevedygtighed Assay

TR-MCF7 celler blev udsået i en 96 brønd plade i medium indeholdende 10 uM-4- OHT. Når cellerne nåede -90% konfluens celler blev behandlet i OPTI-MEM i en af ​​fire tilstande 1: 10 pM 4-OHT i OPTI-MEM for hele 48 timer af forsøget. 2: YM-1 (eller vehikel) ved angivne koncentrationer i 4 timer efterfulgt af udveksling af YM-1 medium med medium indeholdende 10 uM 4-OHT. 3: YM-1 (eller vehikel) ved angivne koncentrationer i 4 timer efterfulgt af udveksling af YM-1 medium med medium indeholdende 95% EtOH (køretøj til 4-OHT). Eller, 4: YM-1 (eller køretøj) ved angivne koncentrationer for de fulde 48 timers eksperiment. MTT-assay kit blev fremskaffet fra ATCC og assay blev kørt som pr leveret protokol.

Isolering af kerneproteiner Salg

TR-MCF7 celler blev dyrket i udpegede medium i 10 cm skåle. Celler blev behandlet i 4 timer med 10 pM 4-OHT, 10 uM YM-1, både eller vehikel (er) for begge forbindelser. Efter inkubation blev cellerne høstet og kerneproteiner isoleret under anvendelse af reagenser og leveret protokol fra Qproteome kerneprotein Kit (Qiagen).

Resultater Salg

cytotoksiciteten profiler af en række af derivater til MKT-077 på MCF7-celler blev sammenlignet i en mindre skærm. Derivatet YM-1 var den eneste forbindelse sig at have dosisafhængigt højere toksicitet end MKT-077 efter 24 timer (LDH værdier normaliseret for celleantal) (figur 1A). En mulig årsag til dette forbedret styrke var cellulær lokalisering. Ved at udnytte de unikke spektrale egenskaber af disse forbindelser blev MCF7-celler behandlet med MKT-077 eller YM-1 og cellulær adskillelse af mitokondrier og cytosol blev udført. Methylenblåt, en forbindelse kendt for at lokalisere til mitokondrierne, blev anvendt som en kontrol [21]. De subcellulære fraktioner blev analyseret spektrofotometrisk. Disse værdier blev sammenlignet med en genereret standardkurve for Abs: koncentration (data ikke vist), hvilket gav en omtrentlig koncentration af forbindelse i hver fraktion og dermed en procentdel af lægemiddel pr placering. Interessant YM-1, i modsætning MKT-077 var mere fremherskende i de cytosoliske fraktioner (figur 1B).

MCF7-celler blev behandlet i 24 timer med tre koncentrationer af MKT-077 eller YM-1. Efter 24 timer blev mediet opsamlet og analyseret ved LDH-assay. De viste værdier er i% af køretøjets behandling ± SD (A). MCF7-celler blev behandlet med MKT-077, YM-1 eller methylenblåt (MB). Mitokondrie fraktioner opsamles og sammensatte placering blev målt ved spektrofotometer (B).

Bekymret, at manglen på mitokondrie interaktion ville reducere den cytotoksiske specificitet set med rhodacyanine s for kræftceller, selektiviteten af ​​YM-1 på flere cancer og udødeliggjorte cellelinier blev testet. Disse omfattede: MCF7, Hs578T og MDA-MB-231 (brystkræft), M17 (neuroblastom), H4 (neurogliomceller), HeLa (livmoderhalskræft), og to immortaliserede cellelinjer: HEK 293 (human embryonisk nyre) og NIH 3T3 ( murine fibroblast). Robust cytotoksicitet (1323% af vehikel), som målt ved lactatdehydrogenase (LDH) assay blev observeret i MCF7-celler efter 24 timers YM-1 behandling (figur 2A). Som forventet, disse toksicitetsværdier var højere end dem, der observeres i figur 1A, da vi brugte en større celle population (1A≈0.2 × 10

6 celler; 2A≈1.2 × 10

6 celler) og dermed mere LDH blev frigivet af den associerede toksicitet. De andre cancer cellelinjer testet alle viste toksicitet efter YM-1 administration; henviser, de to immortaliserede cellelinjer viste minimal til ingen toksicitet ved LDH-assay (figur 2B). Dette viste, at den cytosoliske lokalisering af YM-1 ikke påvirkede dens specificitet for cancerceller.

MCF7-celler (brystkræft) blev behandlet i 24 timer med stigende koncentrationer af YM-1. Efter 24 timer blev mediet opsamlet og analyseret ved LDH cytotoksicitet assay. De viste værdier er i% af køretøjets behandling ± SD (A). Hs578T og MDA-MB-231 (brystkræft), M17 (neuroblastom), H4 (neurogliomceller), og HeLa (livmoderhalskræft) celle behandlet med stigende koncentrationer af YM-1 og toksiciteten blev sammenlignet med NIH-3T3 (mus embryonisk fibroblast ) og HEK 293 (humane embryonale nyre) celler til kræft specifik toksicitet. Alle cellelinier blev behandlet i 24 timer. Efter 24 timer blev mediet opsamlet og analyseret ved LDH-assay. De viste værdier er i% af køretøjets behandling ± SD (B).

YM-1 Effekten blev derefter testet i en celle model af tamoxifen-resistens. Toksiciteten af ​​YM-1 i en ildfast tamoxifen (4-OHT) resistente MCF7 (TR-MCF7) cellelinien blev sammenlignet med den af ​​den parentale MCF7 (ikke-resistent) cellelinie. Faktisk YM-1 effektivt dræbt både standard- og resistente (TR-MCF7) celler efter 48 timers inkubation (figur 3A). I betragtning af de tidligere problemer med kronisk MKT-077 behandling, vi spekuleret på, at en kortere behandling med YM-1 kan være lige så giftige. For at teste dette blev MCF7-celler og TR-MCF7 celler behandlet med 10 pM YM-1 i 4 timer. Dette blev fjernet og erstattet med vehikel i 44 timer. Desuden blev TR-MCF7 celler behandlet med enten 4-OHT eller køretøjet for 4-OHT (95% EtOH) (figur 3B). I hvert tilfælde blev minimal toksicitet observeret.

TR-MCF7 og forældreorlov MCF7 celler blev behandlet i 48 timer med 10 pM YM-1. Efter 48 timer blev mediet opsamlet og analyseret ved LDH-assay. De viste værdier er i% af køretøjets behandling ± SD (A). MCF7-celler blev behandlet i 4 timer med 10 pM YM-1. Efter 4 timer blev mediet erstattet med standard vækstmedium i 44 timer. TR-MCF7 celler blev behandlet med 10 pM YM-1 i 4 timer. Efter 4 timer blev mediet fjernet og erstattet med standard TR-MCF7 medier indeholdende 10 pM 4-OHT eller 95% EtOH, køretøjet til 4-OHT, i 44 timer. Efter 48 timer fra den indledende behandling blev mediet opsamlet og analyseret ved LDH-assay. De viste værdier er i% af køretøjets behandling ± SD (B).

Cellelevedygtighed (MTT) assays blev derefter anvendt til at teste, om denne kortere behandlingsstrategi påvirkede celleproliferation. TR-MCF7 celler blev dyrket i medier, der indeholdt 10 pM 4-OHT. Vores designet behandlingsstrategi indeholdt fire betingelser alle ender ved 48 timer: 1. 10 pM 4-OHT alene i 48 timer, 2. YM-1 (eller køretøj) behandling i 4 timer efterfulgt af re-tilsætning af 10 uM 4-OHT for 44 timer, 3. YM-1 (eller køretøjer) behandling i 4 timer efterfulgt af 95% EtOH (køretøj til 4-OHT), og 4. YM-1 (eller køretøj) behandling for de fulde 48-timer. MTT-assays viste, at 4 timers 10 pM YM-1 efterfulgt af 10 uM 4-OHT-behandling reducerede levedygtigheden med 60% i forhold til 4-OHT-behandling alene. Den 10 pM YM-1 efterfulgt af 95% EtOH behandling ændrede ikke levedygtighed (figur 4A). 48-timers 10 pM YM-1-behandling reducerede levedygtigheden med 40% i forhold til 48-timers 4-OHT behandling, svarende til fig 3A.

TR-MCF7 celler blev behandlet med 4-OHT i 48 timer, YM-1 (eller vehikel) i 4 timer efterfulgt af 44 timer af enten 4-OHT eller 95% EtOH, eller YM-1 (eller vehikel) i 48 timer. Efter 48 timer fra den indledende behandling, blev MTT levedygtighed assays udført. Levedygtighedsværdierne af hver behandling i% af 48 timer af 4-OHT behandling ± SD (A). 2-vejs ANOVA-analyse sammenligner alle YM-1 behandlingsgrupper (Gray squares- 4 timers YM-1then 4-OHT, åben diamonds- 48 timer YM-1, sort triangles- 4 timers YM-1 og derefter 95% EtOH), afsløret betydning tværs koncentrationer (F (2,30) = 54,22, p 0,0001), og behandling strategi (F (4, 30) = 41,04, p 0,0001), men ingen signifikant interaktion (F (8,30) = 1,83 , p = 0,1107). * – Angiver signifikant forskel (p 0,05) 4-timers YM-1 og derefter 4-OHT fra to andre grupper med undtagelse af 10 uM behandlinger, betydning som angivet (ns = p 0,05) (B). 1-vejs ANOVA YM-1 + 4-OHT strategi afslørende betydning af 10 uM koncentration (F (4,10) = 16,49, p = 0,0002) (C). Analyse af YM-1 + 95% EtOH, med 1-vejs ANOVA, viste ingen betydning på tværs testede koncentrationer (F (4,10) = 3,435, p = 0,0516) (D). 48-timers YM-1 behandling viste signifikans forskel mellem alle koncentrationer og koncentrationen 10 uM, med 1-vejs ANOVA (F (4,10) = 12,32, p = 0,0007) (E). 1-vejs ANOVA-analyse (F, (5,12) = 24,33, p 0,0001) sammenligning alle 10 um ym-1 behandlinger, 48-timers 4-OHT, og køretøjets behandlinger viste ingen signifikant forskel mellem 48-timers 4-OHT og begge 4 timers 10 pM YM-1 + 95% EtOH og 48-timers 10 pM YM-1 behandlinger; henviser til 48-timers 4-OHT og 4 timers 10 pM YM-1 + 95% EtOH var signifikant forskellige fra den 4 timers YM-1 + 4-OHT-behandling (p 0,05). (F)

Alle behandlingsstrategier indeholdende YM-1 blev analyseret ved to-vejs ANOVA (figur 4B). Denne analyse viste en signifikant effekt ved behandling strategi og koncentration af YM1 (F (4, 30) = 41,04, p 0,0001), (F (2,30) = 54,22, p 0,0001). Samspillet mellem behandlingsstrategi og koncentration var ikke signifikant (F (8,30) = 1,83, p = 0,1107). Bonferroni post-hoc analyse af denne 2-vejs ANOVA viste ingen signifikante forskelle mellem nogen af ​​de anvendte koncentrationer for 48-timers YM-1-behandling og 4 timers YM-1 efterfulgt af 95% EtOH behandling (alle p 0,05) ; henviser, alle de anvendte koncentrationer til 4 timers YM-1 efterfulgt af 4-OHT behandling var signifikant forskellige fra den 4 timers YM-1 efterfulgt af 95% EtOH behandling (alle p 0,05). Alle koncentrationer af 4-timers YM-1 efterfulgt af 4-OHT og 48-timers YM-1 var signifikant forskellige (alle p 0,05) med undtagelse af 10 uM YM-1 koncentration (p 0,05). Vi tilskrives den manglende betydning for den generelle toksicitet forårsaget af 48-timers 10 uM koncentration af YM-1 (se figur 3A B). En envejs ANOVA af YM-1 koncentrationskurve til 4 timers YM-1-behandling efterfulgt af 44 timer af 4-OHT behandling afslørede, at 10 uM-koncentrationen var signifikant forskellig fra alle andre koncentrationer (F (4,10) = 16.49, p = 0,0002) (figur 4C). Koncentrationen kurven for 4 timers YM-1 behandling efterfulgt af 95% EtOH behandling vises, at ingen koncentration var signifikant fra enhver anden koncentration ved envejs ANOVA (F (4,10) = 3,435, p = 0,0516) (figur 4D) . Sammenligning af alle de 48 timers ym-1-koncentrationer ved envejs ANOVA, vises der, igen, 10 uM-koncentrationen var signifikant forskellig fra alle andre koncentrationer i denne behandling (F (4,10) = 12,32, p = 0,0007 ) (figur 4E). Vi fortsatte vores analyse ved at sammenligne 10 uM YM-1-koncentration, fra alle behandlingsgrupper, med nul-behandling. Levedygtighed værdier for alle førnævnte behandling betingelser, med inddragelse af de 4-OHT 48 timer behandling og køretøjer behandlinger som separate grupper, blev analyseret af envejs ANOVA (F, (5,12) = 24,33, p 0,0001). Tukey post-hoc test afslørede, at fire timer YM-1 efterfulgt af 4-OHT var signifikant forskellig fra 4-OHT 48 timers behandling (p 0,05), hvorimod både 48 timers 10 uM YM-1 og 4 timers 10 uM YM-1 efterfulgt af 95% EtOH behandlinger var ikke signifikant signifikant fra 4-OHT 48 timer behandling (Figur 4F). Denne analyse viste også, at 10 pM YM1 efterfulgt af 4-OHT er signifikant forskellig fra 10 pM YM1 efterfulgt af 95% EtOH (p 0,05).

Disse resultater antydede, at kun en 4 timers behandling af 10 uM YM -1 kunne re-sensibilisere TR-MCF7 celler tamoxifen /4-OHT, standsning cellevækst uden at forårsage åbenbar toksicitet. De potentielle mekanismer for dette fænomen blev derefter undersøgt. En plausibel mekanisme var afvigende kinaseaktivitet, som er kendt for at fremme tamoxifen resistens ved phosphorylering ERa ved et sted kendt for at fremme østrogen uafhængig aktivitet [14], [15], [16], [17], [18]. Vi behandlede TR-MCF7 celler som beskrevet for eksperimenter i figur 4A B. nukleare proteiner blev isoleret og undersøgt for niveauer af ERa pS167, et websted, der når phosphorylerede formidler tamoxifen uafhængighed. Faktisk fosforylering af ERa pS167 blev forhøjet i nærværelse af 4-OHT; dog tilsætning af 10 uM YM-1 ophævede denne begivenhed (figur 5A B). YM-1 ændrede ikke den nukleare lokalisering af ERa ind i kernen (figur 5C D)

S167 af ERa falder er indeholdt i en Akt (Akt /PKB) konsensus site.. Akt er en pro-overlevelse kinase med to isoformer er kendt for at interagere med ERa. Vi behandlede MCF7-celler med 10 pM YM-1 til 6 timer for at undgå toksicitet og kiggede for ændringer i enten Akt niveauer eller aktivering. Niveauerne af Akt1 og Akt2 var dosisafhængig reduceret med YM-1 (figur 6A B). Dette antyder, at YM-1 kan forårsage toksicitet specifikt for kræftceller, svarende til den oprindelige forbindelse MKT-077, men at YM-1 gør det ved at reducere pro-overlevelse kinaser som Akt, der kan føre til ændringer i resistensmekanismer i ildfaste tumorer. Disse data er enig med arbejde tidligere arbejde påviser, at virkningerne af LY294002, en inhibitor af PI3K /Akt signalvejen inhibitor, på tamoxifen-induceret apoptose var specifikke for inhibering Akt aktivitet [16].

MCF7-celler blev behandlet med konstaterede koncentrationer af YM-1 i 6 timer. Celler lysater blev analyseret ved Western blot (A). Densitometri analyse af Akt-1 og Akt2 niveauer vist som% af køretøjets behandling ± SD (B).

Diskussion

Her beskriver vi det terapeutiske potentiale af en MKT-077 derivat, YM-1. Denne forbindelse, i lighed med MKT-077, var specifikt toksiske for cancerceller. YM-1 havde også større effekt og cytosoliske lokalisering end MKT-077. Kort udsættelse for YM-1 var i stand til at re-sensibiliserer ildfaste brystcancerceller tamoxifen, en fælles terapi anvendes i klinikken. Denne mekanisme blev vist at være Akt afhængige som YM-1 var i stand til at reducere Akt niveauer samt phosphorylering af ERa på en Akt konsensus site. Disse data viser potentialet for rhodacyanine derivater i behandling af refraktære cancere.

Det er muligt, at den cytosoliske tilstedeværelse af YM-1, versus mitokondrie af MKT-077, driver øget toksicitet og Akt clearance observere med YM -1. Selvom mitokondrielle aspekter af MKT-077 er velkarakteriserede [1], [2], [3], nylige data tyder på, at MKT-077 også kan interagere med cytosoliske Hsp70 familiemedlemmer [22]. Hvis MKT-077 er i stand til at hæmme cytosolisk Hsp70 som det gør Mortalin [4], [5], YM-1 kan også hæmme cytosolisk Hsp70. Hsp70-inhibitorer har demonstreret cancer specificitet såvel som evnen til at reducere Hsp70 klient-proteiner [20], [23], [24], [25]. Vi formoder, at Hsp70 hæmning kunne være den mekanisme af YM-1; dog yderligere undersøgelser er påkrævet.

Tamoxifen behandlinger mislykkes typisk på grund af udviklingen af ​​resistens. Erhvervede modstande tager tid at udvikle. Vores undersøgelser har vist, at korte behandlinger med YM-1 kan re-bevidstgøre ildfaste kræftformer til tamoxifen. Fordelen ved sådan en kort behandling er den manglende mulighed for en modstand til YM-1 selv samt reduceret sandsynlighed for off-target toksiciteter. Desuden evnen til at modbevise de eksisterende modstande giver mulighed for genindførelse af formodede kemoterapier; forebygge behovet for mere kostbare og potentielt farlige sekundære og tertiære terapeutiske strategier. Desuden YM-1 behandling alene var i stand til selektivt at dræbe kun visse cancerceller, hvilket antyder ikke kun tolerabilitet til den fremgangsmåde, men også et behov for yderligere karakterisering om de specifikke celletyper, der kan være følsomme over for disse forbindelser og Akt udtynding. Disse fordele for patienterne, og det store antal kræft sorter knyttet til Akt dysfunktion giver en platform for den fortsatte undersøgelse og udvikling af nye forbindelser at nedbryder Akt gennem manipulation af rhodocyanine stilladset.

Mens andre kinaser er blevet identificeret til phosphoryleret ERa, Akt er en stor overlevelse kinase, uanset resistens fænotype, og dets clearance kunne forbedre effektiviteten af ​​alle kemoterapeutika. Hvis vores hypotese, at YM-1 er et Hsp70-inhibitor er nøjagtig, kan dette clearance skyldes øget ubiquitinering af Akt, som ubiquitinligase for Akt, CHIP (carboxyterminale ende af Hsc70 interagerende protein) [26], er kendt for at interagere med Hsp70 [27].

Disse undersøgelser viser behovet for mere mekanistisk indsigt i virkemåde rhodacyanines. Mindre ændringer mellem MKT-077 og YM-1 føre til en øget cytosolisk tilstedeværelse, der var i stand til at opretholde lignende specificitet. Dette antyder, at modifikationer af dette stillads kunne fremkalde specifik toksicitet eller reducere renal toksicitet, som observeret i de kliniske og laboratorieforsøg [1], [2], [3]. Faktisk vores data demonstrerer en næsten præferentiel drab af brystcancerceller, versus andre cancer celletyper, tyder på, at specificitet for bestemte tumor sorter kunne bygges ind i rhodacyanine stilladset.