PLoS ONE: Fremme af Cancer Cell Proliferation af Spaltet og udskilles Luminal domæner af ER Stress Transducer BBF2H7

abstrakt

BBF2H7 er en endoplasmatisk reticulum (ER) -resident transmembrane basisk leucin-zipper (bzip) transkriptionsfaktor, spaltes i det transmembrane domæne af reguleret intramembrane proteolyse som reaktion på ER stress. Den spaltede cytoplasmatiske N-terminus indeholdende transkription aktivering og bzip domæner translokerer ind i kernen for at fremme ekspressionen af ​​målgener. I chondrocytter, er den spaltede luminale C-terminus udskilles ekstracellulært og fremmer proliferation af naboceller gennem aktivering af hedgehog signalering. I nærværende undersøgelse fandt vi, at

Bbf2h7

ekspressionsniveauerne steget betydeligt med 1,070-2,567 gange i flere tumortyper herunder glioblastom sammenlignet med dem i de respektive normale væv, ved hjælp af ONCOMINE Cancer profilering Database. I nogle Hedgehog ligand-afhængig cancer cellelinjer, herunder glioblastom U251MG-celler blev BBF2H7 C-terminus secerneres fra celler i dyrkningsmediet og fremmes cancercelleproliferation gennem aktivering af hedgehog signalering. Knockdown af

Bbf2h7

udtryk undertrykte proliferation af U251MG celler ved nedregulering Hedgehog signalering. Den svækkede celleproliferation og hedgehog signalering blev udvundet ved tilsætning af BBF2H7 C-terminus til dyrkningsmediet af

Bbf2h7

-knockdown U251MG celler. Disse data antyder, at den udskilte luminale BBF2H7 C-terminus er involveret i Hedgehog ligand-afhængig cancer celleproliferation gennem aktivering af hedgehog signalering. Således kan BBF2H7 C-terminus være et hidtil ukendt mål for udviklingen af ​​lægemidler mod cancer

Henvisning:. Iwamoto H, Matsuhisa K, Saito A, Kanemoto S, Asada R, Hino K, et al. (2015) Fremme af Cancer Cell Proliferation af Spaltet og udskilles Luminal domæner af ER Stress Transducer BBF2H7. PLoS ONE 10 (5): e0125982. doi: 10,1371 /journal.pone.0125982

Academic Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIEN

Modtaget: 15. december, 2014 Accepteret: marts 27, 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Iwamoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Takeda Science Foundation, The Yasuda Medical Foundation, The Nakajima Fonden, Tokyo Biochemical Research Foundation, Kobayashi International Scholarship Foundation, Nagase Science Technology Foundation , Mitsubishi Foundation, SEI Group CSR Fonden og Japan Society for fremme af Science KAKENHI (25/677, 25.251.014, 25.650.069, 25.861.324, 24.300.135, 26.460.099). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

endoplasmatiske reticulum (eR) er den centrale cellulære organel ansvarlig for syntesen, foldning og post-translationelle modifikationer af proteiner til sekretoriske vej. Forskellige patofysiologiske tilstande, såsom ER calcium udtømning, oxidativt stress, hypoglykæmi, ekspression af mutante proteiner og hypoksi, påvirke den korrekte foldning af proteiner, og misfoldede eller ufoldede proteiner ophobes i ER lumen. Sådanne betingelser, som samlet benævnes ER stress, har potentiale til at inducere cellulær skade. ER reagerer på disse forstyrrelser ved at aktivere en integreret signaltransduktionsvej kaldet den udfoldede protein respons (UPR) [1,2]. Aktivering af UPR fører til forbigående translationel dæmpning for at formindske kravene til ER, at transskriptionel induktion af gener, der koder ER-resident chaperoner lette proteinfoldning, og ER-associeret nedbrydning (ERAD) nedbrydes de ufoldede proteiner, der er akkumuleret i ER. I mammale celler, er der tre veletablerede ER stress transducere: dobbeltstrenget RNA-afhængig proteinkinase-lignende endoplasmatisk reticulum kinase (PERK), inositol-krævende enzym-1 (IRE1), og aktivering transkriptionsfaktor 6 (ATF6) [ ,,,0],3-5]. PERK direkte phosphorylerer α-underenheden af ​​eukaryot initieringsfaktor (eIF2α), hvilket fører til en dramatisk reduktion i cellulær proteinsyntese [6]. Omvendt og paradoksalt nok, phosphorylering af eIF2α opregulerer også ekspressionen af ​​ATF4 [1]. ATF4 transaktiverer ekspressionen af ​​pro-apoptotisk protein, C /EBP-homologt protein (CHOP), pro-overlevelse proteiner, såsom ER chaperoner og antioxidative stressproteiner [7]. IRE1 behandler usplejsede former for

X-box-bindende protein-1 Hotel (

Xbp1

) mRNA til at generere splejsede former for mRNA [4,8]. XBP1 proteiner fra de splejsede former for

Xbp1

mRNA inducerer ekspression af ER-resident chaperoner og ERAD-relaterede molekyler. ATF6 spaltes ved dets transmembrane domæne ved site-1 og -2 proteaser (S1P og S2P henholdsvis) som reaktion på ER stress [5,8]. Den spaltede ATF6 N-terminus translokerer til kernen og inducerer ekspressionen af ​​ER-resident chaperoner at lette proteinfoldning.

Udover de tre kanoniske ER stress transducere, der er hidtil ukendte typer af ER stress transducere, der deler domæner af høj sekvenslighed med ATF6. Disse transskriptionsfaktorer har transskription aktivering og grundlæggende leucin zipper (bzip) domæner i deres N-terminal og omfatter BBF2H7 /CREB3L2 [9], OASIS /CREB3L1 [10,11], Luman /LZIP /CREB3 [12], CREBH /CREB3L3 [ ,,,0],13] og CREB4 /AIbZIP /Tisp40 /CREB3L4 [14]. En af OASIS familiemedlemmer, BBF2H7, fortrinsvis udtrykkes i chondrocytter [15,16]. BBF2H7 spaltes i det transmembrane domæne af regulerede intramembrane proteolyse (RIP) som reaktion på ER stress. Den spaltede cytoplasmatiske N-terminus indeholdende transkriptionsaktiveringsdomæne og bzip domæner translokerer ind i kernen for at fremme ekspressionen af ​​målgener, herunder

Sec23a

[15]. I modsætning hertil er det spaltede C-terminus udskilles ekstracellulært og gælder binder til både Indian hedgehog (Ihh) og dens receptor, Patched-1 (Ptch1), efterfulgt af aktivering af Hedgehog (Hh) signalering [16]. Den vej medieret af BBF2H7 C-terminus spiller en rolle i proliferationen af ​​chondrocyter i udviklingslandene brusk. Funktionerne af både N- og C-terminale ende er afgørende for udviklingen af ​​muse brusk.

Hh-signalering er påkrævet for celledifferentiering og dannelse orgel under embryogenese [17]. I den voksne, Hh signalering forbliver aktiv i nogle organer, hvor det er impliceret i reguleringen af ​​stamcelle vedligeholdelse og spredning. I pattedyr er den Hh signalvej initieret af tre Hh ligander (Sonic hedgehog [Shh], Desert hedgehog [Dhh] og IHH) [18]. Hh ligander binder til det transmembrane Hh-receptoren, Ptch1. I fravær af Hh ligander, Ptch1 inhiberer funktionen af ​​det transmembrane protein, Smoothened (Smo), som aktiverer gliom-associeret onkogen 1 (Gli1) [19,20]. Når Hh ligander binder til Ptch1, er Smo frigjort fra inhibering og fremmer aktiveringen af ​​Gli1 transkriptionsfaktoren. Aktiveret Gli1 initierer transskription af Hh target gener såsom

Gli1

,

Forkhead box l1

(

Foxl1

),

Ptch1

,

cyclin D1

cyclin E1

[21].

Hh-signalering er også involveret i kræft forfremmelse. Patienter med Gorlin syndrom (eller basalcelle nevus syndrom) har arvet inaktiverende mutationer i Ptch1, hvilket fører til konstitutiv aktiv Hh-signalering i fravær af Hh ligander [22]. Disse patienter har en høj forekomst af basalcellekarcinomer (BCC), en hud tumor af keratinocytter, foruden medulloblastomer og rhabdomyosarcomer. Næsten alle tilfælde af sporadiske BCC skyldes aktivering af Hh signalvejen gennem Ptch1 tab af heterozygositet og /eller inaktivering eller aktiverende mutationer i Smo, der mindsker dens hæmning af Ptch1. Desuden har flere Hh ligand-afhængige kræftformer involverer overekspression af Hh ligander blevet identificeret i de seneste par år, herunder lunge, pancreas, brystkræft og prostatakræft [23,24]. I alle tilfælde er disse kræftformer svare Hh ligander på en autokrin måde. Hh ligander udskilt fra cancerceller virker på secernerende celler (eller beslægtede cancerceller) at stimulere celleproliferation og /eller overlevelse, hvilket fører til tumorvækst. Derfor kan specifikke inhibitorer af Hh-signalering tjene som anticancermidler. Men det er uklart, hvordan Hh-ligander, er deres receptor Ptch1 og nedstrøms signalering reguleret i kræftceller.

Som nævnt ovenfor BBF2H7 C-terminalen aktiverer Hh signalering ved direkte binding til både Hh ligand og Ptch1, som fremmer celleproliferation. Interessant,

Bbf2h7

genet blev først identificeret som partner i

smeltet i sarkom

(

FUS

) i en kimære gen findes i lav kvalitet fibromyxoid sarkom (LGFMS) [25]. Nye rapporter har vist, at Hh og HH target gener er opreguleret i LGFMS patienter [25,26]. Derfor fremsatte vi den hypotese, at BBF2H7 kan have en vigtig rolle i spredningen af ​​Hh ligand-afhængige cancerceller. Her fandt vi, at det spaltede BBF2H7 C-terminalen udskilles fra visse typer af kræftceller og fremmer celledeling gennem aktivering af Hh-signalering.

Materialer og Metoder

ONCOMINE microarray datasæt for

Bbf2h7

udtryk

Microarray datasæt for glioblastom (The Cancer Genome Atlas-glioblastoma multiforme og Brain Lavere Grade Gliom DNA Copy Number data, 2013), invasiv duktalt brystkarcinom (The Cancer Genome Atlas-invasiv Breast carcinoma Gene Expression data, 2011), livmoderhalskræft pladecarcinom [27], prostata adenocarcinom [28], colon adenocarcinom [29], gastrisk adenocarcinom (The Cancer Genome Atlas-mave adenocarcinom DNA Copy Number data, 2013), og pancreas adenocarcinom (The Cancer Genome Atlas-pancreasadenocarcinom DNA Copy Number data, 2013) blev adgang til ved hjælp af ONCOMINE Cancer profilering Database (version 4.4.4.4, www.oncomine.org) at undersøge

Bbf2h7

udtryk i forskellige kræftformer.

Celledyrkning

HEK293T (afledt af humane embryonale nyre; American Type Culture Collection [ATCC]),

Bbf2h7

– /- mus embryonale fibroblast (MEF, der stammer fra

Bbf2h7

– /- mus ved hjælp af tidligere offentliggjorte protokoller [15 ]), MCF7 (afledt af human brystcancer, ATCC) og HeLa (afledt af humant livmoderhalskræft, ATCC) celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Life Technologies) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). LNCaP (afledt af human prostatacancer; ATCC) celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium-1640 (Life Technologies) indeholdende 10% FBS. U251MG (afledt af humant glioblastoma; JCRB Cell Bank) og LS174T (afledt af human coloncancer, ATCC) celler blev dyrket i Eagles minimale essentielle medium (DS Pharma) indeholdende 10% FBS. At afhjælpe ER stress blev cancerceller behandlet med 4-phenylbutyrat (4-PBA, WAKO), en kemisk chaperone. For at inducere ER stress blev cancerceller behandlet med 1 uM thapsigargin. (TG, WAKO), en inhibitor af ER Ca

2 + -ATPase

RNA-isolering, revers transkription-PCR (RT-PCR) og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev isoleret ved guanidin phenol-metoden under anvendelse af ISOGEN (NIPPON GENE) ifølge fabrikantens protokol. Alikvoter på 1 ug oprenset RNA blev revers transkriberet til første-streng-cDNA i en 20 pi reaktionsvolumen ved anvendelse af 200 U Moloney murin leukæmivirus-revers transkriptase (Life Technologies) [30]. PCR blev udført under anvendelse af specifikke primersæt i et samlet volumen på 20 pi bestående af 1 pi cDNA, 0,5 uM af hver primer, 0,2 mM dNTP’er, 1 U DNA-polymerase (Agilent), og PCR-buffer (Agilent). Primersekvenserne var som følger:

Gli1

fremad, 5’GAAGCCGTATGTATGTAAGCTCC-3 ‘;

Gli1

omvendt, 5′-CTTGGGCTCCACTGTAGAAATG-3 ‘;

Foxl1

fremad, 5’ACAGGCATAGAGGTGACTTTTGG-3 ‘;

Foxl1

omvendt, 5′-TTCACAGAGGCTGAGAGTTTGG-3 ‘;

Xbp1

fremad, 5’ATGGATGCCCTGGTTGCTGAAG-3 ‘;

Xbp1

omvendt, 5’GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC-3 ‘;

β-actin

fremad, 5’TCCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3 ‘;

β-actin

omvendt, 5’TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3 ‘. PCR cyklus parametre var 20 s ved 94 ° C, 20 s ved 58 ° C, og 25 sekunder ved 72 ° C i 18-33 cyklusser (

Gli1

, 33;

Foxl1

, 31

Xbp1

, 25;

β-actin

, 18) efterfulgt af 72 ° C i 5 min. Prøver (5 pi) af hver reaktionsblanding blev elektroforesebehandlet på 4,8% polyacrylamidgeler. Tætheden af ​​hvert bånd blev kvantificeret ved hjælp af Photoshop Elements 6.0 (Adobe Systems).

At analysere mRNA-ekspressionsniveauer, kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse Light Cycler 480 II (Roche) og Light Cycler SYBR Green I Master (Roche). PCR-reaktionerne blev udført under anvendelse af KAPA SYBR FAST qPCR Kit Optimeret til Light Cycler 480 (KAPA). Alle resultater blev normaliseret til ekspressionen af ​​endogene

β-actin

mRNA og blev udtrykt som relative stigninger eller fald i udtryk sammenlignet med kontrollerne.

Western blotting

Proteiner var ekstraheret fra celler under anvendelse cellelyse-buffer (1% Triton X-100, 100 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM HEPES, 500 mM saccharose og en proteasehæmmer cocktail [MBL International]). Proteinkoncentrationerne af cellelysaterne blev bestemt under anvendelse af et Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo). Lige store mængder protein blev elektroforesebehandlet på 12% SDS-polyacrylamidgeler, og derefter overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Bio-Rad). For immunoblotting blev følgende antistoffer og fortyndinger anvendes: polyklonalt kanin-anti-BBF2H7 C-terminus (Abcam; 1: 1,000), polyklonalt muse-anti-BBF2H7 N-terminus (den genererede antistof [15]; 1: 1,000), monoklonalt muse- anti-β-actin (Sigma; 1: 3.000), polyklonale kanin-anti-interleukin 6 (IL-6) (Abcam; 1: 250), alkalisk phosphatase-konjugeret anti-kanin IgG (Sigma; 1: 3.000) og alkalisk phosphatase-konjugeret anti-muse IgG (Enzo, 1: 3.000). Mærkede proteiner blev påvist ved anvendelse nitro-blue tetrazolium chlorid (Wako) og 5-brom-4-chlor-3′-indolylphosphatase p-toluidin-salt (Roche).

Immunopræcipitation

Til påvisning BBF2H7 C-terminus i dyrkningsmediet, blev kultursupernatanter inkuberet med anti-BBF2H7 N-terminus, anti-BBF2H7 C-terminalen, eller anti-IL-6-antistoffer natten over. Prøverne blev derefter udfældet med protein G agaroseperler (Life Technologies) efterfulgt af western blotting. IL-6 blev anvendt som en loading kontrol.

Immunhistokemi

Tumor-prøver blev indsamlet under kirurgi af Hiroshima University Hospital, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Snit blev fikseret i kold acetone ved -20 ° C og derefter i en 4% paraformaldehyd phosphatbufferopløsning. For immunfarvning af BBF2H7 C-terminus, anvendte vi et anti-BBF2H7 C-terminus antistof som det primære antistof og Dako Envision Kit (Agilent) til påvisning ifølge fabrikantens anbefalinger. Alle procedurer var i overensstemmelse med de etiske udvalg for Human Genome Research i Hiroshima Universitet.

plasmider og transfektion

Menneskelig BBF2H7 fuld længde, N- og C-terminale cDNA blev opnået ved blunt- ligering af PCR-produkter svarende til aminosyrerne 1-520, 1-377 og 431-520 (Genbank, NP_919047.2) med en BiP (bindende immunoglobulin protein) signalpeptidsekvens (aminosyrerne 1-16, Genbank , NP_005338.1) ved N-terminus. Den BBF2H7 fuld længde, blev N- og C-terminale cDNA’er klonet ind i en pcDNA3.1 (+) vektor. HEK293T celler og

Bbf2h7

– /-. MEF’er blev transficeret med hvert plasmid under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies) ifølge fabrikantens protokol

Bioassays af celleproliferation

U251MG-celler (1 x 10

5) blev udpladet på 6 cm-skåle, dyrket ved 37 ° C i 24 timer, og derefter transficeret med røræg eller

Bbf2h7

lille interfererende RNA (siRNA) under anvendelse af lipofectamin 2000 ifølge fabrikantens protokol. For

Bbf2h7

knockdown, de følgende sekvenser blev anvendt: 5′-GGAAGAAGGUAGAGGUUCU-3 ‘(siBBF2H7-1) og 5′-CCAGAAACCUGCUGAUCUA-3’ (siBBF2H7-2). U251MG-celler blev inkuberet ved 37 ° C i 24 timer efter transfektion, og derefter blev dyrkningsmediet udskiftet. Celleantal blev talt på de angivne dage efter transfektion. siRNA’er blev købt fra Bioneer (Daejeon, Sydkorea).

Derudover efter transfektion med røræg eller

Bbf2h7

siRNAs,

Bbf2h7

-knockdown U251MG celler blev udsat for konditioneret medium indsamlet fra HEK293T celler transficeret med en tom vektor (Mock) eller BBF2H7 C-terminus (C-Sup.), eller til C-Sup. hvori BBF2H7 C-terminus blev trukket ned ved immunfældning under anvendelse af et anti-BBF2H7 C-terminus antistof (C-Sup. + Ab.). Celleantal blev talt på de angivne dage efter transfektion. For celleproliferationsassay anvendte vi også en celletælling kit (WST-8 assay DOJINDO) ifølge producentens protokol.

For at bekræfte aktivering af Hh-signalering ved BBF2H7 C-terminus, U251MG-celler blev behandlet med rekombinant Shh (R 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

Udtrykket af BBF2H7 i tumorer og sekretion af sin spaltede C-terminalen fra cancerceller

Bbf2h7

gen blev først identificeret som partner i

FUS

i en kimære gen findes i LGFMS [25]. Derfor er det muligt, at BBF2H7 kan være involveret i kræft celleproliferation. Vi undersøgte ekspressionsniveauerne af

Bbf2h7

i forskellige typer af tumorer ved hjælp af ONCOMINE Cancer profilering Database (Fig 1A). Datasættene omfattede 37, 61, 5, 28, 94, 94 og 8 normale vævsprøver, og 582, 389, 40, 59, 52, 173 og 32 maligne vævsprøver af glioblastom, invasivt duktalt brystkarcinom, cervical pladecarcinom, prostata adenocarcinom, colon adenocarcinom, gastrisk adenocarcinom og pancreas adenocarcinom, hhv. Som vist i fig 1A,

Bbf2h7

ekspressionsniveauer udviste en signifikant stigning på 1,070-2,567 gange i flere tumortyper sammenlignet med dem i deres respektive normale væv. I modsætning hertil var der ingen signifikant opregulering af

Bbf2h7

ekspression i gastriske eller pancreas-adenocarcinomer, hvilket indikerer, at genekspressionen af ​​

Bbf2h7

specifikt forøget i visse tumortyper.

(A) Øget udtryk for

Bbf2h7

i humane kræftformer. Microarray datasæt tumorer blev tilgås i ONCOMINE Cancer profilering Database (version 4.4.4.4, www.oncomine.org). Box plots viser øget ekspression af

Bbf2h7

under tumorigenese af forskellige kræftformer blev konstrueret fra ONCOMINE. Y-aksen repræsenterer loggen

2 median-centreret intensitet (normaliseret udtryk). Linjen i boksen repræsenterer medianen udtryk for hver gruppe, og de øvre og nedre kanter af kassen angiver 75

th og 25

th percentiler af distribution, hhv. Linjerne (whiskers) fra hver boks strække sig til 90

th og 10

th percentiler af distributionen. De sorte prikker uden enderne af whiskers repræsenterer de største og mindste datapunkter. Box plots afbilder fordelingen af ​​

Bbf2h7

udtryk inden for hver prøve og en Students

t

-test giver en

P Drømmeholdet værdi til sammenligning af

Bbf2h7

udtryk mellem normale og maligne vævsprøver blev opnået direkte gennem ONCOMINE. Normale colon vævsprøver inkluderet colon ascendens, colon descendens og rectum. (B) Forudsagt peptid funktioner i menneskets BBF2H7. Transskription aktivering, er grundlæggende leucin-zipper (bzip) og transmembrane domæner, samt en site-1 protease (S1P) stedet angivet. (C) Under ER stress betingelser, er BBF2H7 transporteres fra ER til Golgi-apparatet og spaltes ved S1P site [9]. Den spaltede BBF2H7 N-terminus virker som en transkriptionsfaktor via binding til det cykliske AMP-responselementet (CRE) af målgener [15]. I modsætning hertil er det spaltede BBF2H7 C-terminus udskilles ekstracellulært [16]. (D) Western blotting af det endogene fuldlængde BBF2H7 og den N- eller C-terminalen af ​​BBF2H7 hjælp cellelysater (venstre panel) eller dyrkningsmedier (højre panel) af adskillige humane cancercellelinier. BBF2H7 N-terminus, BBF2H7 C-terminalen eller IL-6 i dyrkningsmedierne blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-BBF2H7 N-terminus (øverste panel), anti-BBF2H7 C-terminus (midterste panel), eller anti-IL-6-antistoffer ( bundpanel) hhv. β-actin eller IL-6 blev anvendt som indlæsning kontroller. (E) RT-PCR-analyse af

Xbp1

mRNA-ekspression i adskillige humane cancercellelinier.

Xbp1-s

Xbp1-u

indikerer splejset og ikke-splejsede former for

Xbp1

hhv. Bemærk, at

Xbp1-s

blev påvist i alle kræftceller, hvilket indikerer, at disse celler undergår ER stress. (F) RT-PCR-analyse af

Xbp1

mRNA-ekspression i U251MG-celler behandlet med 2 mM 4-PBA, en kemisk chaperon, i 3 timer. (G) Kvantificering af

Xbp1-s

ekspression i F. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD af fem uafhængige forsøg. **

P

0,01. (H) Western blotting af BBF2H7 i U251MG celler behandlet med 1 uM thapsigargin (TG), en inhibitor af ER Ca

2 + -ATPase, i 6 timer. (I) Immunhistokemi af hjernesnit fra glioblastom patienter, der anvender et anti-BBF2H7 C-terminus-specifikt antistof. Stærke signaler blev påvist både i cytosolen af ​​kræftceller (markeret med en pilespids) og i deres omgivende ekstracellulære rum (angivet med pile). Venstre panel viser en lav forstørrelse, og højre panel viser en højere forstørrelse af venstre panel. Scale søjler indikerer 50 um (venstre felt) og 10 um (højre panel).

BBF2H7 spaltes i transmembrandomænet som reaktion på ER stress (Fig 1B og 1C) [9]. Den N-terminalen fremmer ekspressionen af ​​målgener herunder

Sec23a

[15]. I modsætning hertil er den C-terminale ende udskilt fra celler og letter spredningen af ​​naboceller gennem aktivering af Hh-signalering i chondrocytter [16]. Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​fuldlængde BBF2H7 og dens spaltet N- og C-terminus i lysater fra følgende cancercellelinjer: glioblastom U251MG, brystcancer MCF7, livmoderhalskræft HeLa, prostatacancer LNCap og tyktarmskræft LS174T. Vi har registreret den 80 kDa fuldlængde BBF2H7 og dets spaltet N-terminalen (50 kDa) og C-terminus (20 kDa) i lysaterne af næsten alle cancercellelinier undtagen LS174T-celler (Fig 1D). BBF2H7 C-terminus, men ikke fuld længde BBF2H7 eller dets N-terminal, blev også påvist i dyrkningsmedierne af disse cellelinier, hvilket viser, at den spaltede C-terminus blev udskilt fra disse celler i dyrkningsmediet. Spaltningen af ​​BBF2H7 afhænger ER stress [9]. Derfor, vi kontrolleres, om kræft cellelinjer undergår ER stress. Som vist Fig 1E-1G, de splejsede former af

Xbp1

[8], en markør af ER stress, blev observeret i alle de cancercellelinjer. Behandling af U251MG-celler med 4-PBA [31], en kemisk chaperone, faldt de splejsede former af

Xbp1 Salg In basale niveauer og afhjælpes ER stress, hvilket indikerer, at cancercellerne vi kontrolleres var under ER stressbetingelser. Endvidere bekræftede vi, at BBF2H7 blev spaltet som reaktion på ER stress i cancerceller (fig 1H). Disse data viste, at BBF2H7 blev spaltet og dets C-terminus blev ekstracellulært udskilles som respons til ER stress under homeostase i disse cancercellelinier, undtagen for LS174T-celler. Dernæst at bekræfte, at BBF2H7 proteinet udtrykkes i tumorer, udførte vi immunhistokemi under anvendelse hjernesnit fra glioblastom patienter og et anti-BBF2H7 C-terminus-specifikt antistof (Fig 1I). Stærke signaler blev påvist både i cytosolen af ​​cancerceller og i deres omgivende ekstracellulære rum. Disse resultater viste, at BBF2H7 blev højt udtrykt i glioblastom og at det spaltede C-terminus ekstracellulært blev udskilt fra cancerceller.

Cancer celleproliferation i en Shh-afhængig måde

Det er kendt, at BBF2H7 C-terminus binder til både Hh ligand og dens receptor, Ptch1, og fremmer Hh-signalering [16]. At undersøge, om cancercellelinier med forhøjet BBF2H7 ekspression show forøget cellevækst og aktivering af Hh signalvejen i en ligand-afhængig måde, vi behandlede disse cancercellelinier med rekombinant Shh (fig 2A-2C). Behandling med rekombinant Shh resulterede i signifikant opregulering af Hh target gener såsom

Gli1

Foxl1

i BBF2H7-udtrykkende cancer cellelinjer og øget cellevækst. Imidlertid LS174T celler, som ikke udtrykte BBF2H7, viste ingen respons på behandling med rekombinant Shh. Disse resultater antyder, at de fire cancercellelinier, der secernerer BBF2H7 C-terminalen har forbedret cellevækst i et Shh-afhængig måde.

(A) RT-PCR-analyse af Hh målgener i flere cancercellelinier behandlet med 500 ng /ml rekombinant Shh i 48 timer. (B) Kvantitativ realtids-PCR-analyser af Hh målgener ekspression i A. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD af fem uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01. (C) Den cancercellelinier dyrkedes i 5 dage efter behandling med 500 ng /ml rekombinant Shh og analyseret ved WST-8-assays på dag 5. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD af fem uafhængige forsøg. *

P

0.05.

BBF2H7 C-terminalen øger Hh-signalering i kræftceller

Som vist i figur 1A og 1D, BBF2H7 blev forhøjet i nogle tumorer og cancer cellelinjer. Vi undersøgte roller BBF2H7 N-terminus og C-terminus i celleproliferation ved transfektion af ekspressionsvektorerne ind i kræftceller. BBF2H7 N-terminus næppe påvirket celleproliferation, hvilket indikerer, at N-terminalen ikke har potentiale til at fremme celleproliferation i cancerceller. I modsætning hertil BBF2H7 fuld længde og C-terminus lidt forøget celleproliferation sammenlignet med kontrollen, men forskellene var ikke signifikant (data ikke vist). Produktionen af ​​BBF2H7 fuld længde og C-terminus af ekspressionsvektorerne kan ikke være høj nok til væsentligt at fremme celleproliferation. Vi mener, at den producerede BBF2H7 fuldlængde og C-terminus af ekspressionsvektorerne havde en mindre virkning på celleproliferation, fordi endogen BBF2H7 blev højt udtrykt i U251MG-celler. Derfor har vi transficeret human BBF2H7 fuld længde, N- eller C-terminalen i

Bbf2h7

– /- MEF’er [15], hvis celledeling blev svækket i forhold til vildtype MEF’er, at fjerne virkninger af endogen BBF2H7 på celleproliferation (fig 3A og 3B). Transfektion af BBF2H7 fuld længde eller C-terminus i

Bbf2h7

– /- MEF’er gendannet celleproliferation imidlertid transfektion af BBF2H7 N-terminus alene ikke forbedrer celleproliferation, hvilket indikerer, at den humane BBF2H7 C terminalen, men ikke N-terminalen, har potentiale til at fremme celledeling

(A, B)

Bbf2h7

-. /- MEF’er blev dyrket i 5 dage efter transfektion med BBF2H7 fuld længde (Full), N-terminus (N), C-terminus (C) eller en tom vektor (Mock), og analyseret ved celletælling på dag 5 (A) og WST-8 assay på det angivne tidspunkt point (B). WT og KO angiver vildtype MEF’er og

Bbf2h7

– /- MEF’er hhv. Fejlsøjler repræsenterer middel ± SD af fem uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01. (C) RT-PCR-analyse af Hh målgener i flere cancercellelinier udsat for konditioneret medium opsamlet fra HEK293T celler transficeret med BBF2H7 C-terminus (C-Sup. +) Eller en tom vektor (C-Sup.-) i 48 h. (D) Kvantitativ realtids-PCR-analyser af Hh målgener ekspression i C. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD af fem uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01. (E) RT-PCR-analyse af Hh målgener i U251MG celler behandlet med C-Sup., C-Sup. depleteret for BBF2H7 C-terminus ved immunfældning under anvendelse af et anti-BBF2H7 C-terminus antistof (C-Sup. + Ab.), eller C-Sup. i nærvær af 5 pM cyclopamin (C-Sup. + CPN). Mock indikerer konditioneret medium opsamlet fra HEK293T celler transficeret med en tom vektor. (F) Kvantitativ realtids-PCR-analyser af Hh målgener ekspression i E. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD af fem uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01. (G, H) U251MG-celler blev dyrket i 5 dage efter konditioneret medium behandling og analyseret ved celletælling på dag 5 (G) og WST-8-assays på de angivne dage (H). Fejlsøjler repræsenterer middel ± SD af fem uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01.

Det secernerede BBF2H7 C-terminus er blevet rapporteret at fremme celleproliferation af chondrocytter ved aktivering af Hh-signalering [16]. For yderligere at undersøge virkningerne af secerneret BBF2H7 C-terminus på cancercelleproliferation blev cancercellelinier udsat for konditioneret medium opsamlet fra HEK293T celler transficeret med humant BBF2H7 C-terminus (C-Sup.) Indeholdende en BiP signalpeptidsekvens på sit N-terminus, således at dets sekretion fra celler. Behandling af kræft cellelinjer med C-Sup. resulterede i signifikant opregulering af Hh target gener, såsom

Gli1

Foxl1

, i alle cellelinjer med undtagelse af LS174T-celler (fig 3C og 3D). Navnlig viste U251MG og LNCaP-celler mere signifikant induktion af Hh målgener, hvilket indikerer, at virkningerne af C-Sup. på Hh-signalering var forskellige blandt de cancercellelinjer. For at bekræfte, at den udskilte BBF2H7 C-terminus fremmes celleproliferation gennem aktivering af Hh-signalering, undersøgte vi, om Hh-signalering i U251MG-celler ville stadig blive aktiveret efter udtømning af BBF2H7 C-terminus fra C-Sup. ved immunopræcipitation anvendelse af et anti-BBF2H7 C-terminus antistof (C-Sup. + Ab .; Fig 3E-3H). Som forventet, udtømning af BBF2H7 C-terminalen fra C-Sup. forårsagede et signifikant fald i ekspressionen af ​​Hh målgener og i celleproliferation. Derudover behandling med cyclopamin (CPN) [32], en Smo antagonist som hæmmer Smo og dens nedstrøms Hh signalering, annullerede virkningerne af C-Sup. på induktion af Hh target gener såsom

Gli1

Foxl1

(fig 3E og 3F). Desuden fremme af celleproliferation med C-Sup. blev undertrykt ved behandling med CPN (Fig 3G og 3H), hvilket tyder på, at den udskilte BBF2H7 C-terminalen virker opstrøms for Smo og forbedrer Hh ligand-afhængig proliferation.

Virkninger af

Bbf2h7

siRNA på spredning af kræftceller

Vi næste afgøres, om knockdown af

Bbf2h7

undertrykker cellevækst ved at nedregulere Hh-signalering i kræftceller. Til dette formål har vi brugt to forskellige siRNA’er (siBBF2H7-1 og siBBF2H7-2). 0,001. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001. *

P

*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001. *

P