PLoS ONE: Den GADD45A (1506T & gt; C) Polymorfi er forbundet med kræft i æggestokkene modtagelighed og Prognosis

Abstrakt

GADD45A (

vækst anholdelse og DNA-skader 45 A) er den første stress- inducerbart gen identificeret til at være et mål af

p53

. Imidlertid har ingen undersøgelser til dato vurderede varianter af

GADD45

gen og deres potentielle forhold til tumor modtagelighed. Vi undersøgte foreningen af ​​

GADD45A

(1506T C) polymorfi med æggestokkene udvikling af kræft i 258 æggestokkene kræftpatienter og 332 aldersmatchede raske kvinder som kontrol ved hjælp sekvensanalyse. Vi fandt en statistisk signifikant forskel i

GADD45A

(1506T C) genotype fordelinger mellem case og kontrolgrupper (TT vs TC vs CC, P = 0,0021), og fandt, at variant 1506T C var signifikant forbundet med en øget risiko for ovariecancer (P 0,001, OR = 1,71, 95% CI [1,28-2,29]). Vi observerede en statistisk signifikant virkning mellem tumorhistologi (P = 0,032) og CA125 status (P = 0,021). Regnskabsmæssig C-allelen (TC + ​​CC) var forbundet med en øget risiko for positiv CA125 (OR = 3,20, 95% CI [1,15-8,71). Regnskabsmæssig T-allelen (TT + TC) viste en signifikant sammenhæng med både højere

GADD45A

mRNA-ekspression og længere kræft i æggestokkene RFS (tilbagefald overlevelse) og OS (samlet overlevelse). Vi er den første gruppe til at påvise, at

GADD45A

(1506T C) polymorfi er associeret med kræft i æggestokkene modtagelighed og prognose. Disse data tyder på, at

GADD45A

(1506T C) er en ny tumor modtagelighed gen og kunne være en nyttig molekylær markør til vurdering ovariecancer risiko og til at forudsige kræft i æggestokkene patient prognose

Henvisning:. yuan C, Liu X, Liu X, Yang N, Liu Z, Yan S, et al. (2015)

GADD45A

(1506T C) Polymorfi er forbundet med kræft i æggestokkene modtagelighed og Prognose. PLoS ONE 10 (9): e0138692. doi: 10,1371 /journal.pone.0138692

Redaktør: Da-Tian Bau, Kina Medical University, TAIWAN

Modtaget: Januar 12, 2015; Accepteret: September 2, 2015; Udgivet den 30. september, 2015

Copyright: © 2015 Yuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National High Technology Research og Development Program ( “863” Program) Kina (2014AA020605, 2012AA02A507), National Natural Science Foundation of China (81.272.857), Kina Postdoc Science Foundation (2014M551918), Videnskab og Teknologi Development Project i Shandong-provinsen (2014GSF118071, 2013GNC11306, 2013GSF12202), Natural Science Foundation of Shandong-provinsen (ZR2014JL019) og Foundation of Shandong Public Health Department (2014WS0123). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest dødelige kræft i kvindelige reproduktive system, med over 21.980 nye tilfælde og over 14.270 dødsfald i USA i 2014 [1]. Svarende til andre maligniteter, ovariecancer forekommer som et resultat af vekselvirkninger mellem miljø og genetiske faktorer

En akkumulering af genetiske varianter i mange gener kan være involveret i processen for ovarie carcinogenese [2].; for eksempel,

BRCA1

,

BRCA2

,

RAD51C

,

RAD51D

,

MLH1

,

MSH2

,

RB1 ​​

,

CASP8

,

LIN28B

,

SMAD6

,

ERCC4

og PRG har været impliceret i denne proces [3 -12]. For nylig har genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS) fundet flere fælles modtagelighed alleler i fire loci med stærke associationer [13-15]. Braem et al. revideret 147 kandidatgener og 3 GWAS udgivet fra 1990 til oktober 2010, herunder ca. 1100 genetiske varianter i mere end 200 kandidatgener og 20 intergeniske regioner [8]. Men kun nogle få genetiske varianter udstillet stærke beviser for en forbindelse med kræft i æggestokkene, og identifikation af gener, der er forbundet med en disposition til kræft i æggestokkene kræver yderligere undersøgelser [8].

Væksten arrestation og DNA-skader 45 (

GADD45

) familie består af tre medlemmer,

GADD45A

, –

B

, og-

G

. Den menneskelige

GADD45A

gen er placeret på kromosom 1 (1p31.2-31.1), indeholder 4 exons og 3 introns, koder et 165 aminosyrer surt protein (18,4 kDa), og er stærkt bevaret i alle arter [ ,,,0],16]. Som bekræftet mål af p53 [17, 18],

GADD45A

kan reguleres af både p53-afhængige (ioniserende stråling) og p53-uafhængig (ikke-ioniserende stråling) veje [19] og spiller en vigtig rolle i G2 /M checkpoint og i genomstabilitet [18]. Flere transkriptionsfaktorer, såsom

BRCA1

,

WT1

,

Oct-1

,

NF-YA

,

ATF4

,

AP-1

,

c-myc

,

ZBRK1

, og

Juni D

kan regulere

GADD45A

udtryk ved at binde til intron eller promoter region på det transkriptionelle niveau [16, 18, 20, 21].

Tidligere undersøgelser har vist, at nedregulering af

GADD45A

og

GADD45G

muliggør tumor celler at undslippe programmeret celledød i flere forskellige tumortyper [22].

GADD45

udtryk ofte faldt i ikke-småcellet lungecancer [23], hepatocellulært carcinom [22], og glioblastom [24]. Nedreguleringen af ​​

GADD45

ekspression giver dårlig tumor prognose og er korreleret med differentiering status. Unormal methylering af

GADD45A

genpromotorregion er blevet fundet i flere brystcancercellelinier og brystkræft prøver, men ikke i lymfeknuder eller normal brystepitel [25].

GADD45A

overekspression er forbundet med en gunstig prognose, hvilket tyder på, at den unormale methylering af

GADD45

kan bidrage til risikoen for brystkræft [25]. Der er imidlertid ikke

GADD45A

polymorfi forbundet med tumor modtagelighed blevet rapporteret. En variant

GADD45A

(1506T C) placeret på intron regioner blev fundet i vores undersøgelse. Således har vi en hypotese, at denne variant kan forstyrre transkriptionsfaktorbindingssites og derved ændre

GADD45A

udtryk og påvirker tumor tilblivelse. Således har vi undersøgt

GADD45A

(1506T C). Polymorfi,

GADD45A

udtryk, og kræft i æggestokkene risiko og prognose

Materialer og Metoder

patienter og prøver

Denne undersøgelse omfattede 258 patienter diagnosticeret med kræft i æggestokkene (gennemsnitsalder på 52,1 ± 13,9 år, fra 21 til 81 år) i Qilu Hospital (Shandong, Kina) fra september 2008 og september 2012. Klinisk karakteristika, herunder alder ved diagnose, graden af ​​differentiering, FIGO stadie, histologisk type, lymfeknude metastaser, CA125 status, og tumorstørrelse, blev indhentet fra de patienternes journaler. Desuden 332 aldersmatchede raske kvinder (gennemsnitsalder på 50,2 ± 13,4 år, fra 21 til 82 år) blev rekrutteret som kontroller blandt patienter, der gennemgår en fysisk undersøgelse i vores hospital. Vi beregnede

GADD45A

genotype med hensyn til tilbagefald overlevelse (RFS) og samlet overlevelse (OS) i 151 patienter æggestokkene baseret på vores evne til at kontakte patienterne.

De fleste af de emner var af Han kinesisk baggrund og bopæl i Shandong-provinsen, Kina. Alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse. Det Etiske Komité Shandong University godkendt denne forskning (IRB nummer: Kyll-2013-019). Alle deltagere (patienter og kontroller) vandt 2 ml perifert blod, som blev opbevaret ved -80 ° C i vores laboratorium.

DNA blev ekstraheret under anvendelse af en TIANamp Genomisk DNA Kit (Tiangen, Beijing, Kina) ifølge fabrikantens protokol. DNA-koncentrationen og renheden blev målt under anvendelse af en ultraviolet spektrofotometer (GE Healthcare, USA). DNA-prøver blev rutinemæssigt opbevaret ved -80 ° C

Genotvpebestemmelse Analyse af GADD45A (1506T C).

Genotypning af

GADD45A

(1506T C) polymorfi var udført under anvendelse af PCR og sekventering. Sekvensen af ​​

GADD45A

genet blev opnået fra NCBI (Gene ID: 1647 GenBank-sekvens, AY135686.1, GI: 22.122.007). Primere blev konstrueret under anvendelse af Primer Premier 5 i henhold til sekvensen af ​​

GADD45A

som følger: fremadrettet primer 5′- AGTTTGCACAGGGCAACTCC-3 ‘og revers primer 5′- CCTGCTAAAGGAATTAGTCACG-3’. PCR-produktet størrelse var 1255 bp. PCR-amplifikation blev udført i et slutvolumen på 50 pi, der indeholdt 1 pi genomisk DNA (100 ng /pl), 4 pi 2,5 mM dNTP’er, 5 pi puffer, 2 pi af hver primer og 1 U af high fidelity Taq Polymerase (TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase, transgen, Beijing, Kina). PCR amplificeringen var som følger: 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 35 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder, 61 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min, og en endelig forlængelse trin på 72 ° C i 10 minutter. Alle sekventering blev udført af BioSune Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Kina), og sekvensen blev analyseret ved hjælp kulørtheder 2.31 og MegAlign 7.0 software.

RNA Isolation, Reverse Transcription PCR og kvantitativ Real-Time PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra cancer væv under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) baseret på foreslåede protokol. Revers transskription PCR blev udført under anvendelse af en PrimeScript RT-PCR kit (Takara, Dalian, Kina). QRT-PCR blev udført under anvendelse af Applied Biosystems 7900HT Real-time PCR System. MRNA-sekvens af

GADD45A

genet blev opnået fra NCBI (NM_001924.3 GI: 315.075.321). De følgende primere blev anvendt til at opformere

GADD45A

gen: 5′-GAAAGGGATGGATAAGGTGGG-3 ‘og revers primer 5′-CCTGGATCAGGGTGAAGTGGA-3’. GAPDH (fremadrettet primer 5′-GGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAAG-3 ‘og revers primer 5′-CCATGGGTGGAATCATATTGG-3’) blev anvendt som intern kontrol. Forsøgene blev gentaget tre gange for at bekræfte resultaterne.

Statistical Analysis

Statistiske analyser blev udført som tidligere beskrevet [26]. Hardy-Weinberg ligevægt blev testet for alle de SNPs ved hjælp af en offentlig web-baseret statistisk værktøj (https://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml), og grænsen for uligevægt var P 0,05. Allelen og genotype distributioner i ovariecancer gruppen og kontrolgruppen blev sammenlignet ved hjælp af chi-square test, og Fishers eksakte test blev anvendt, da den ene celletal var 5. Risikoen for ovarie cancerudvikling blev estimeret som en odds-ratio (OR) med en 95% konfidensinterval (CI) ved anvendelse ubetinget logistisk regressionsanalyse. Patienten overlevelsesrater blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Multivariat analyse af prognostiske faktorer blev udført ved hjælp af Cox regressionsanalyse. Alle p-værdier blev beregnet som tosidet, og grænsen for signifikans var P 0,05. Data blev analyseret ved hjælp af SPSS (Statistisk pakke for Social Sciences) 17,0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA)

Resultater

Forholdet mellem GADD45A (1506T C). Polymorfi og æggestokkene kræftrisiko

SNP

GADD45A

(1506T C) er en roman, der tidligere uidentificeret variant. Sekventering kromatogrammer fra tilfældigt udvalgte sager blev brugt til at illustrere varianter af

GADD45A

(figur 1).

A-C, de omvendte komplement sekventering chromatogramprofiler resultater af genotyperne TT, TC og CC henholdsvis. Prøverne blev tilfældigt udvalgt

Deltagerne i kræft i æggestokkene og kontrolgrupper var alle fra det kinesiske fastland.; Der var ingen signifikante kliniske forskelle (dvs. median alder, body mass index [BMI], menstruation historie eller andre relaterede parametre) mellem de 2 grupper. Hardy-Weinberg ligevægt blev testet. Chi-square værdier af sagen og kontrolgruppen var 0,51 og 0,47, henholdsvis. Som vist i tabel 1,

GADD45A

(1506T C) genotyper og allel fordelinger udviste en statistisk signifikant forskel mellem case og kontrolgrupper. Stærke foreninger med æggestokkene kræftrisiko blev fundet for SNP 1506T C i log-additive genetiske model (TT vs. TC vs CC, P = 0,0021), dominant genetisk model (TT + TC vs. CC, P = 0,0017, OR = 1,95, 95% CI [1,28-2,95]), og recessive genetiske model (TT vs. TC + CC, P = 0,0093, OR = 2,05, 95% CI [1,19-3,53]). Vi observerede en større forekomst af C alleler (P 0,001, OR = 1,71, 95% CI [1,28-2,29]) i æggestokkene kræftpatienter sammenlignet med kontrollerne

Sammenfattende variant 1506T C er korreleret med en stigning i æggestokkene kræftrisiko

Forholdet mellem GADD45A (1506T C). Polymorfi og klinisk-patologisk variabler

Som vist i tabel 2, der er en sammenslutning af TT og TC + CC genotyper med klinisk-patologiske karakteristika, herunder alder ved diagnose, graden af ​​tumor differentiering, klinisk fase, lymfeknude metastaser, CA125 udtryk, tumorstørrelse og tumor histologi. Vi observerede en statistisk signifikans virkning mellem tumorhistologi (P = 0,032) og CA125 status (P = 0,021). Regnskabsmæssig C-allelen (TC + ​​CC) var forbundet med en øget risiko for positiv CA125 (OR = 3,20, 95% CI [1,15-8,71)

Forholdet mellem GADD45A. (1506T C) polymorfi og GADD45A Expression niveauer

Vi yderligere testet den potentielle sammenhæng mellem

GADD45A

(1506T C) polymorfi og

GADD45A

mRNA-ekspressionsniveauer in vivo. Som vist i figur 2A, niveauerne af

GADD45A

mRNA i 22 ovariecancer væv var væsentligt lavere end de observerede niveauer i 15 normale væv (P 0,001). Som vist i fig 2B,

GADD45A

mRNA-ekspression var højere hos patienter med TT eller TC genotyper sammenlignet med patienter med CC-genotypen (P 0,001). Som vist i figur 2C,

GADD45A

mRNA-ekspression var højere i kontrollen med TT eller TC genotyper end med CC-genotypen, (P 0,001). Disse resultater tyder på, at SNP 1506T . Kan C væsentlig indflydelse på ekspressionen af ​​

GADD45A

gen

A, Relative niveauer af GADD45A mRNA-ekspression i kræft i æggestokkene væv sammenlignet med normale æggestokkene væv. B, Relative niveauer af GADD45A mRNA-ekspression i kræft i æggestokkene væv af patienter med forskellige 1506T C genotyper. C, Relative niveauer af GADD45A mRNA-ekspression i de normale kontrolprocedurer væv af individer med forskellig 1506T C genotyper. En plet repræsenterer middelværdien af ​​tre uafhængige målinger opnået fra et emne. Fordelinger af de tre genotyper var tilfældigt mellem grupperne. N repræsenterer antallet af prøver i hver respektive gruppe. Søjler repræsenterer standardafvigelsen. Studerendes

t

-test blev anvendt til at vurdere forskellene i ekspressionsniveauerne af forskellige konstruktioner

Forholdet mellem GADD45A (1506T C). Polymorfi og kræft i æggestokkene Prognose

for at teste den prognostiske effekt af

GADD45A

polymorfi i kræft i æggestokkene, vi beregnet

GADD45A

genotype med hensyn til æggestokkene tilbagefald overlevelse (RFS) og samlet overlevelse (OS). Som vist i figur 3, viste TT + TC genotype signifikant korrelation med både længere ovariecancer RFS og OS i 151 patienter (P = 0,018, P = 0,0093, henholdsvis).

A, Genotype TT + TC af

GADD45A

havde længere tilbagefald overlevelse (P = 0,018). B, Genotype TT + TC af

GADD45A

havde længere samlet overlevelse (P = 0,0093).

Diskussion

En lang række genetiske varianter i kandidatgener involveret i processen for ovarie carcinogenese er blevet rapporteret [8]. Tre GWAS med overlappende sæt undersøgelsens deltagere for kræft i æggestokkene er blevet udført [13-15]. Der blev fundet i alt 18 SNPs i 5 regioner at være forbundet med ovariecancer i 3 GWAS undersøgelser. Men der var ingen overlapning mellem de genetiske varianter identificeret gennem GWAS undersøgelser og varianterne er identificeret ved hjælp af en kandidat gen søgning [8]. Vi mener, at beviset for en forbindelse med kræft i æggestokkene er utilstrækkelig, og at det er nødvendigt yderligere at undersøge kandidatgener forbundet med kræft i æggestokkene.

GADD45

udtryk ofte faldt i nogle kræftformer [22 -24]. Unormal

GADD45

udtryk er blevet forbundet med tumor prognose [25], og unormal

GADD45

methylering kan bidrage til kræft risiko [25]. En undersøgelse viste, at 1,25-dihydroxyvitamin D3 forårsager standsning af cellecyklus ved G2 /M overgang gennem p53-uafhængig induktion af GADD45 i ovariecancerceller [27]. Induktionen af ​​GADD45A ekspression kan spille en rolle ved mediering den apoptotiske respons af ovariecancerceller til det syntetiske retinoid CD437 [28]. Foreningen af ​​

GADD45A

polymorfier med tumor modtagelighed og prognose er aldrig blevet rapporteret

I denne undersøgelse

GADD45A

(1506T C). Polymorfi viste sig at være forbundet med kræft i æggestokkene risiko, klinisk-patologiske karakteristika,

GADD45A

ekspressionsniveauerne og kræft i æggestokkene prognose. Så vidt vi ved,

GADD45A

er en roman kræft i æggestokkene modtagelighed gen, og denne undersøgelse er den første til at rapportere en sammenhæng mellem germlinie mutationer i

GADD45A

og tumor risiko og prognose. Vi forventer

GADD45A

at være en nyttig molekylær markør til vurdering ovariecancer risiko og prognose

SNP 1506T . C ligger i introns og kan derfor ikke ændre rækkefølgen eller struktur af proteinet. vi forstår imidlertid, at varianten 1506T C var forbundet med og øget risiko for ovariecancer og nedsat overlevelse af patienten. Desuden

GADD45A

funktioner nedstrøms for

BRCA1

p53

i DNA-skader vej.

GADD45A

udtryk er reguleret af flere transkriptionsfaktorer, såsom

p53

,

BRCA1

,

WT1

,

Oct-1

,

NF-YA

,

ATF4

,

AP-1

,

c-myc

, og

ZBRK1

, som typisk bindes til promotor eller intron regioner af

GADD45A

[16, 20, 21, 29]. Således har vi en hypotese, at denne variant kan forstyrre transkriptionsfaktorbindingssites og derved ændre

GADD45A

udtryk og påvirker tumor tilblivelse. I overensstemmelse med resultater opnået i andre undersøgelser kræft [22-24],

GADD45A

mRNA-ekspression var lavere hos patienter æggestokkene end kontrol. Desuden

GADD45A

mRNA-ekspression var lavere hos patienter med CC genotype sammenlignet med patienter, der bærer T-allelen (TT + TC), og overlevelsen af ​​patienter med CC-genotypen var dårligere. Således bærer C-allelen (TC + ​​CC) var forbundet med en øget risiko for positiv CA125. Disse resultater var i overensstemmelse med funktionen af ​​

GADD45A

.

GADD45A

er impliceret i aktiv DNA demethylering, bortset fra opretholdelse af genomisk stabilitet, DNA-reparation og undertrykkelse af cellevækst [29,30].

Som tidligere angivet deltagerne involveret i vores undersøgelsen var primært beboere i Shandong-provinsen, Kina. Fordi den kinesiske befolkning er generelt mere genetisk homogen end andre etniske befolkningsgrupper, forudser vi, at disse resultater vil være konsekvent i større stikprøvestørrelser på tværs af Kina, men at bestemme anvendeligheden af ​​vores resultater til andre etniske befolkningsgrupper (både inden for og uden Asien) kræver yderligere undersøgelser i forskellige patientgrupper, og større stikprøvestørrelser er nødvendige, før disse data kan ekstrapoleres til andre etniske grupper [30].

som konklusion, fandt vi, for første gang, at den

GADD45A

(1506T C) polymorfi kan være korreleret med æggestokkræft modtagelighed, klinisk-patologiske karakteristika,

GADD45A

ekspressionsniveauerne og kræft i æggestokkene prognose. Fordi

GADD45A

har vist sig at være et centralt regulator i et komplekst netværk af onkogene veje, er der behov for yderligere undersøgelser for at belyse den funktionelle rolle af dette gen og dets samarbejde med æggestokkene carcinogenese og udvikling. De varianter af

GADD45A

kan vise sig at være nyttige markører til identifikation af kræft i æggestokkene-modtagelige patienter eller prognostiske indikatorer for sygdomsprogression, og de kan også tjene som potentielle mål for fremtidige behandlinger.

i denne undersøgelse, for første gang, vi viser, at

GADD45A

(1506T C) polymorfi er associeret med kræft i æggestokkene modtagelighed og prognose. Der blev observeret en sammenhæng mellem den

GADD45A

(1506T C) polymorfi og

GADD45A

ekspressionsniveauerne. Disse data tyder på, at

GADD45A

(1506T C) er en ny tumor modtagelighed gen og kunne være en nyttig molekylær markør til vurdering ovariecancer risiko og til at forudsige kræft i æggestokkene patient prognose

.