PLoS ONE: Forbedret Hæm Funktion og mitokondrie Respiration Fremme udviklingen af ​​lungekræft Cells

Abstrakt

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald, og omkring 85% af tilfældene er ikke-små celle lungecancer (NSCLC). Vigtigere, nylige fremskridt i kræftforskning tyder på, at ændre kræftcelle bioenergetik kan give en effektiv måde at målrette sådanne avancerede kræftceller, der har erhvervet mutationer i flere cellulære regulatorer. Denne undersøgelse har til formål at identificere bioenergetic ændringer i lungekræft celler ved direkte at måle og sammenligne centrale metaboliske aktiviteter i et par af cellelinier, der repræsenterer normale og NSCLC celler udviklet fra den samme patient. Vi fandt, at satserne for iltforbrug og hæm biosyntesen blev intensiveret i NSCLC celler. Derudover NSCLC-celler udviste væsentligt forøgede niveauer i et array af proteiner fremmer hæm syntese, optagelse og funktion. Disse proteiner omfatter det hastighedsbegrænsende hem biosyntetiske enzym Ak, transportproteiner HRG1 og HCP1 der er involveret i hæm optagelse, og forskellige typer af ilt-udnytte hæmoproteiner såsom cytoglobin og cytochromer. Flere typer af humane tumorxenografter vises også forhøjede niveauer af sådanne proteiner. Desuden fandt vi, at sænke hæm biosyntese og optagelse, ligesom sænke mitokondrielle respiration, reduceres effektivt iltforbrug, kræft celleproliferation, migration og kolonidannelse. I modsætning hertil sænkning hæm nedbrydning ikke har en virkning på lungecancerceller. Disse resultater viser, at øget hæm flux og funktion er et centralt element i NSCLC celler. Endvidere øget produktion og forsyning af hæm og ilt-udnytte hæmoproteiner i kræftceller vil føre til øget iltforbrug og cellulær energiproduktion ved mitokondrie respiration, hvilket ville give næring kræft celledeling og progression. Resultaterne viser, at inhibering af hæm og respiratoriske funktion effektivt kan standse progressionen af ​​lungecancerceller. Derfor, forståelse hæm-funktion kan have en positiv indflydelse på forskningen i lungekræft biologi og terapi

Henvisning:. Hooda J, Cadinu D, Alam MM, Shah A, Cao TM, Sullivan LA, et al. (2013) Øget Hæm Funktion og mitokondrie Respiration Fremme Progression af Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (5): e63402. doi: 10,1371 /journal.pone.0063402

Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Februar 2, 2013; Accepteret: 31 Marts 2013; Udgivet: 21. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Hooda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cecil H. og Ida Green midler (LZ) og NCI SPORE P50CA70907 tilskud (RB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumorceller har en øget efterspørgsel efter næringsstoffer, som giver cellulær energi og metaboliske byggesten. Øget metabolisk efterspørgsel i tumorceller ofte ledsager ændret metabolisme. I 1920’erne Otto Warburg påvist, at tumorceller metabolisere glucose og generere lactat ved højere niveauer på trods af tilstedeværelsen af ​​rigelig oxygen, et fænomen kaldet Warburg virkning [1], [2]. Nyere undersøgelser har afdækket de molekylære begivenheder underliggende mange metaboliske ændringer i kræftceller [3] – [5]. For eksempel Anastasiou et al. [5] viste for nylig, at enzymet pyruvatkinase M2 (PKM2), som er den dominerende pyruvatkinase fundet i cancerceller, er afgørende for opretholdelse af cellulær redox homeostase. Endvidere nyere undersøgelser tyder på, at metaboliske enzymer kan fungere som tumorsuppressorer (fx fumarat hydratase og succinatdehydrogenase), eller onkogener (fx mutant isocitratdehydrogenase 1 og 2) [6] – [8]. Disse nylige undersøgelser har bekræftet, at ændret stofskifte er faktisk kendetegnende for kræft, og foreslog, at ændringerne i stofskiftet i kræftceller er meget mere kompleks end det blev foreslået i første omgang.

Nylige undersøgelser viste, at øget glykolytisk flux i kræftceller er ikke afhængig af formindsket iltforbrug eller mitochondrial respiration [9] – [11]. For eksempel, to separate undersøgelser [12], [13] viste, at mitokondriel respiration forstærkes i humane brystkræftceller. En anden undersøgelse viste, at cancerceller kan opretholde oxidativ phosphorylering ved en formindsket, men stadig væsentlig hastighed, selv ved 1% oxygen niveau [14]. Disse resultater fremhæver, at mitokondrielle respiration og funktion er afgørende for kræft cellemetabolisme og bioenergetik. Især hæm er en central faktor i mitokondrie-funktion og ilt metabolisme [15], [16]. Hæm spiller kritiske roller i næsten enhver proces involveret i ilt stofskiftet. Hæm tjener som en prostetisk gruppe i hæmoglobin, myoglobin og andre globiner at transport eller opbevares ilt, i mitokondrie respiratoriske kæde komplekser, i cytochrom P450’er og andre oxygenaser der bruger ilt til biosyntetiske og nedbrydningsreaktioner, og i andre enzymer, der bruger eller afgifte ilt sådan som peroxidaser og catalaser [15], [17]. Ligeledes hæm biosyntesen kræver oxygen som et substrat, skønt Km af hæm biosyntetiske enzymer til oxygen er meget lav [18]. Derfor er hæm og ilt tæt forbundet og indbyrdes afhængige.

Her undersøger vi funktionen af ​​hæm og mitokondrier i udvikling lungekræft. Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed i USA og i hele verden, og omkring 85% af tilfældene er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [19], [20]. De fleste patienter har lokalt fremskreden stadie III /IV tumorer på tidspunktet for præsentationen [21]. Udnyttelse af metaboliske sårbarheder kan give effektive alternative strategier til bekæmpelse af lungekræft progression. Vi har derfor karakteriseret og sammenlignet stofskifte ilt og hæm funktion i HBEC30KT og HCC4017 celler [22], [23]. Dette par cellelinjer repræsenterer normale nonmalignant HBEC (HBEC30KT) og NSCLC (HCC4017) celler udviklet fra den samme patient. Vi sammenlignede den metaboliske og molekylære profiler af dette par tilpassede cellelinjer dyrket under identiske betingelser. Vi var interesserede i at bestemme, om og i hvilket omfang ilt metabolisme og hæm niveauer er ændret, og hvis sådanne ændringer bidrage til at bevare og spredning af lungekræft celler. Vores data indikerer, at oxygen forbrug og hæm syntese intensiveres betydeligt i lungecancerceller, sammenlignet med de normale celler. Derudover er niveauerne af proteiner involveret i intracellulær hæm syntese og optagelsen væsentligt forøget i lungecancerceller. Endvidere er niveauerne af oxygen-udnyttende hæmoproteiner såsom cytoglobin blev dramatisk forøget i cancerceller. Hæmning af hæm eller mitokondrie funktion fortrinsvis undertrykt ilt forbrug, kræft celledeling, kolonidannelse og migration. Disse resultater viser, at forøget syntese af hæm og hæmoproteinerne i lungekræft celler resulterer i øget iltforbrug og mitokondrielle respiration, at kræft brændselscelle udvikling.

Materialer og metoder

Lunge Cell Vedligeholdelse, Behandling og Cell Grev

HBEC30KT og HCC4017 cellelinier, der repræsenterer normale og NSCLC celler [22], [23] blev leveret af Dr. John Minna laboratorium (UTSW) som en gave. De blev udviklet fra den samme patient og blev holdt i ACL4 suppleret med 2% FBS under 5% CO

2 ved 37 ° C [23]. Til behandling med inhibitoren af ​​hæm syntese, succinyl acetone blev celler dyrket i medium indeholdende hæm-depleteret serum. Hæm depleteret serum blev fremstillet som tidligere [24] beskrevne. Til måling af effekten af ​​reagenser på lunge celleproliferation blev celler podet i 48-brønds plade med en tæthed på 10

3 celler /brønd. Efter dyrkning i 24 timer blev cellerne behandlet med 0,5 mM succinyl acetone eller med 10 pM carbonyl cyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP). Hver 24 timer efter behandling, blev antallet af levende celler tælles ved hjælp af trypanblå farvning og et hæmocytometer.

Måling af glukose Forbrug, iltforbrug og hæmoglobinsyntese

Til måling glukose forbrug, celler (-90% konfluens) blev inkuberet i 24 timer med frisk medium. Glucose niveau i dyrkningsmediet blev målt under anvendelse af glucose (GO) Assay kit (Sigma). Iltforbrug blev målt, som tidligere [25] beskrevne. Kort fortalt blev celler med ca. 80% konfluens trypsinbehandlet og resuspenderet i frisk, luft-mættet medium. For hver måling, 10

6 celler (i 350 pi) blev indført i kammeret af et Oxygraph systemet (Hansatech Instruments), med en elektrode Clark-typen anbragt ved bunden af ​​det respiratoriske kammer. Under målingerne blev kammeret termostateret ved 37 ° C ved et cirkulerende vandbad. En elektromagnetisk omrører bar blev anvendt til at blande indholdet i kammeret. Hæmoglobinsyntese blev målt som beskrevet [24]. Kort fortalt blev cellerne behandlet med 0,5 mM succinyl acetone, eller 10 uM CCCP i 48 timer, og blev inkuberet med 0,3 uCi [4-

14C] 5-aminolevulinsyre (PerkinElmer Life og analytiske Sciences) i 24 timer. Hæm blev ekstraheret fra disse celler ved anvendelse af acetone-saltsyre og diethylether, og mængden af ​​radioaktivt mærket hæm blev målt som beskrevet [26]. Inkorporering af radioaktivitet i det udtagne hæm tillader måling af hæm biosyntesen. Mængden af ​​radioaktivt mærket hæm blev målt ved scintillationstælling.

Real-time PCR kvantificering og påvisning af mitokondrie-DNA

Oligonukleotidprimere til måling Udskriften niveauer af gener blev designet ved hjælp af Primer3 programmet ( https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). β-actin blev anvendt som en kontrol for den relative kvantificering af transkripter. Totalt RNA blev ekstraheret fra ubehandlede celler eller behandlet med 0,5 mM succinyl acetone i hæm-udtømte medium ved hjælp TRIzol-reagens (Invitrogen). RNA blev oprenset ved hjælp af RNeasy kittet (Qiagen). Revers transkription og PCR blev udført i et enkelt trin under anvendelse af LightCycler RNA Master SYBR Green I Kit (Roche Applied Science), ifølge producentens protokol. PCR blev udført ved anvendelse af en Roche LightCycler. Beregninger blev udført ved hjælp af Roche LightCycler softwaren. Primer sekvenser anvendes til real-time PCR var som følger: β-actin: frem 5’CACAGGGGAGGTGATAGCAT -3 ‘, omvendt 5’CACGAAGGCTCATCATTCAA -3 “. ALAS1: sende 5’-CACACACCCCAGATGATGAA -3 “, omvendt 5’CCTGCAGAAGTTGCACTCAG -3”. ALAS2: frem 5’TGTCACCACCTATGCCTGAG -3 ‘, omvendt 5’GGCACACAACAAAGCAGAAG -3’

mtDNA indhold blev målt og sammenlignet ved at kvantificere niveauet af mitokondrie 16S rRNA-genet og den nukleare GAPDH genet ved. ved hjælp af real-time PCR, som beskrevet tidligere [27]. Primer sekvenser anvendt var som følger (5′-3 ‘): GAPDH: fremad TTCAACAGCGACACCCACT, reverse CCAGCCACTACCAGGAAAT. 16S rRNA: frem CCAAACCCACTCCACCTTAC, omvendt TCATCTTTCCCTTGCGGTA. Real-time PCR-amplifikation blev udført ved anvendelse af LightCycler FastStart DNA Master

PLUS SYBR Green I kittet (Roche Applied Science), ifølge producentens protokol. Real-time PCR-amplifikation for hver prøve blev udført i tripletter. Data blev opsamlet og analyseret ved hjælp af LightCycler software. Forholdet mellem mitokondrie (16 rRNA) vs. nukleare DNA (GAPDH) blev beregnet.

Udarbejdelse af Protein Ekstrakter, vestlige Blotting og immunfluorescensmikroskopi

HBEC30KT og HCC4017 celler blev behandlet, indsamlet og lyseret ved hjælp af RIPA-buffer (Cell Signaling Technology) indeholdende proteaseinhibitoren cocktail. Humane tumor xenografter blev opretholdt, og lysater fra humane tumor-xenotransplantater blev fremstillet som beskrevet [28]. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved anvendelse af BCA-assaykit (Thermo Scientific). 50 ug proteiner fra hver behandling betingelse blev elektroforesebehandlet på 9% SDS-polyacrylamidgeler og derefter overført til Immuno-Blot PVDF-membran (Bio-Rad). Membranerne blev probet med polyklonale antistoffer, efterfulgt af påvisning med en kemoluminescens Western blotting kit (Roche Diagnostics). Signalerne blev detekteret ved anvendelse af et Carestream billede station 4000mm Pro, og kvantificering blev udført ved hjælp af Carestream molekylær billeddannelse softwareversion 5.0.5.30 (Carestream Health, Inc.). Immunofluorescens-farvning blev udført ved at følge procedurerne af antistoffet fabrikanten. FITC og DAPI fluorescerende billeder blev taget til fange ved hjælp af en multi-kanal Zeiss Axio Observer.Z1 fluorescerende mikroskop. Polyklonalt anti-ALAS1, anti-HRG1, anti-cytochrom c, anti-cytoglobin, anti-CYP1B1, anti-Cox-2 og anti-HCP1 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. Monoklonalt anti-β-actin-antistof blev købt hos Cell Signaling Technology.

kolonidannelse og cellemigration assays Salg

I kolonidannelse assayet blev HCC4017 celler talt og podet med en tæthed på 1000 celler pr brønd på plader med 6 brønde. Celler blev behandlet med eller uden 0,5 mM succinyl acetone, succinyl acetone + hæm (10 uM), 10 uM carbonyl cyanid m-chlorphenyl-hydrazon (CCCP), eller 10 uM Tin protoporphyrin IX (SnPP). Medium blev genopfrisket hver fjerde dag. Efter 10-12 dage blev celler fikseret i 70% ethanol, farvet med 0,5% krystalviolet. Billederne blev erhvervet ved hjælp af HP Scanjet 8270.

Et in vitro scratch-assay blev anvendt til at undersøge effekten af ​​hæm og hæm mangel på HCC4017 cellemigration som beskrevet [29]. Kort fortalt blev HCC4017 celler behandlet med eller uden 0,5 mM succinyl acetone, succinyl acetone + hæm (10 uM), eller 10 uM Tin protoporphyrin IX (SnPP) i 6 dage. Derefter blev celler trypsineret og podet på dyrkningsplader ved 95% konfluens. Monolagene blev ridset med en 200 pi steril pipettespids og derpå vasket i flere gange med PBS for at fjerne cellerester. Celler blev derefter holdt i de tilsvarende medier, og migration af cellerne blev monitoreret ved anvendelse af et mikroskop. Repræsentative billeder blev taget til fange langs bunden på forskellige tidspunkter. Hver behandling blev udført i tre eksemplarer.

Resultater

NSCLC Cells Display Intensiveret Satser for iltforbrug

Vi måles og sammenlignes satserne for glucose og iltforbruget i en matchede par de normale, ikke-malign bronchieepithelceller (HBEC30KT) og NSCLC (HCC4017) celler [22], [23]. Tabel 1 viser, at satserne for både glucose og ilt forbrug i HCC4017 celler blev forhøjet, med elevation for iltforbrug nærmer 2,5 gange (Tabel 1). Imidlertid er forholdet mellem mitokondrie-DNA til kerne-DNA, målt som beskrevet [30], var ikke forskellig mellem cellelinierne. Disse data tyder på, at mens mitokondriefunktionen ikke forstyrres, er mitokondrie respiration væsentligt forbedret i NSCLC celler.

hastigheden af ​​Hæm biosyntese og ekspressionsniveauerne af Hæm biosyntetisk Enzymer Markant Øget i Lung Cancer Cells

Hæm tjener som en prostetisk gruppe i mange proteiner og enzymer, transport, lagre og bruge ilt og kan direkte regulere mange processer involveret i ilt metabolisme [15], [16]. Derfor vi begrundet, at den forbedrede ilt forbrug i NSCLC celler kan skyldes øget hæm og hæmoproteiner. For at teste denne mulighed, vi først målt og sammenlignet niveauerne af hæm syntese i NSCLC og normale celler. Vi fandt, at antallet af hæm-syntese blev øget markant i de NSCLC HCC4017 celler, sammenlignet med de normale HBEC30KT celler (Figur 1A). Den potent hæmmer af hæm syntese, succinyl acetone (SA) [24], [31], inhiberede hæm syntese i NSCLC og normale celler, som forventet. Succinyl acetone har tidligere vist sig at være en specifik og potent inhibitor af hæm syntese i forskellige celler i området fra HeLa-celler, PC12 celler til primære muse neuronale celler [32] – [37]. Interessant mitokondrierne afkobler CCCP (carbonyl cyanid meta-chlorphenylhydrazon) reducerede også antallet af hæm syntese, om end i mindre grad (figur 1A). CCCP afkobler oxidative fosforylering med ATP generation i mitokondrierne [38]. Fordi antallet af iltforbruget er meget høj, i forhold til hvad der er brug for hæm biosyntese (tabel 1), mængden af ​​ilt, der anvendes til hæm biosyntesen er ubetydelig [18].

Den normale HBEC30KT lunge epitel (HBEC ) og NSCLC HCC4017 (HCC) celler blev dyrket, RNA og proteiner blev udvundet. Transkriptniveauer blev påvist ved anvendelse af kvantitativ real-time RT-PCR, og proteinniveauer blev påvist ved hjælp af Western blotting. (A) Niveauerne af hæm biosyntesen i normale og NSCLC celler. (B) Udskriften niveau af hæm biosyntetiske enzym ALAS1 i normale og NSCLC celler. (C) Den transkript niveau af hæm biosyntetisk enzym ALAS2 i normale og NSCLC-celler. (D) Proteinet niveau af hæm biosyntetisk enzym ALAS1 i normale og NSCLC-celler. Proteinet niveau af β-actin i prøverne blev anvendt til normalisering. Til statistisk analyse blev niveauerne i cancerceller sammenlignet med niveauerne i normale celler, ved anvendelse af Welch 2-prøve t-test. *, P-værdi 0,05; **, P-værdi. 0,005

Næste, vi målte ekspressionsniveauet af ALAS1 (5-aminolevulinsyre-syntase-1), som er det hastighedsbegrænsende enzym til hæm syntese i nonerythorid celler, herunder lungeceller [39]. Vi målte oprindeligt de ALAS1 transkriptniveauer i NSCLC og normale celler under anvendelse real time RT-PCR. Figur 1B viser, at transkriptet af den nonerythroid ALAS1 genet faktisk blev forøget i cancercellerne. Som forventet ud fra tidligere studier [[40], [41] og referencer deri], inhibering af ALAS aktivitet ved succinyl acetone forårsagede induktion af ALAS1 i både cancer og normale celler, selv om omfanget af induktion viste sig at være større i cancerceller. Erythroid-specifik ALAS2 gen menes ikke at blive udtrykt i normale lungeceller; Men data fra det humane protein Atlas (www.proteinatlas.org) foreslog, at ALAS2 udtrykkes i 16% af lungekræft væv. Derfor målte vi også ALAS2 udskrift niveauet i lungeceller (Figur 1C). Faktisk blev ALAS2 udskrift niveau steg i HCC4017 celler med næsten fem gange. Succinyl acetone havde ikke en målbar effekt på ALAS2 niveau, som forventet, fordi udtryk for ALAS2 modsætning ALAS1, er ikke reguleret af hæm-niveau [40]. Vi yderligere bekræftet stigningen i ALAS proteinniveau i kræft vs normale celler. Figur 1D viser, at ALAS1 proteinniveauet blev signifikant forøget i cancercellerne, og det blev yderligere forøget med succinyl acetone. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at hæm kan negativt regulere ALAS1 transkriptionelt og posttranscriptionally [40], [41]. Vi var ikke i stand til at detektere ALAS2 protein, måske på grund af dets lave niveau i lungeceller. Selv om dens udskrift niveau detekteres i lungekræft celler, vises dets niveau til at være væsentligt lavere sammenlignet med ALAS1.

Niveauerne af hæm Optagelse Proteiner HCP1 og HRG1 og Oxygen-udnytte hæmoproteiner er Øget i Lung Cancer Cells

for yderligere at fastslå funktionen af ​​hæm i NSCLC celler, vi sammenlignet niveauerne af to hæm transportører HCP1 (hæm carrier protein 1) og HRG1 (hæm responsive gen 1) [42], [43]. De udtrykkes og involveret i hæm optagelse i forskellige ikke-polariserede celler [43] – [46]. Vi fandt, at niveauerne af HCP1 og HRG1 dramatisk blev forøget i HCC4017 celler, sammenlignet med de normale celler (figur 2A 2B). Inhibering af hæm syntese ved succinyl acetone påvirkede ikke signifikant HCP1 og HRG1 niveauer, i overensstemmelse med tidligere resultater i pattedyrceller [44].

Den normale HBEC30KT lunge epitel (HBEC) og NSCLC HCC4017 (HCC) celler blev dyrket og behandles som anført. Proteinekstrakter blev fremstillet og niveauerne af HCP1 og HRG1 blev påvist ved Western blotting. Proteinet niveau af β-actin i prøverne blev anvendt til normalisering. (A) Proteinet niveau af hæm transportør HCP1 i normale og NSCLC-celler. (B) Proteinet niveau af hæm transportør HRG1 i normale og NSCLC-celler. Til statistisk analyse blev niveauerne i cancerceller sammenlignet med niveauerne i normale celler, ved anvendelse af Welch 2-prøve t-test. **, P-værdi. 0,005

Stigningen i hæm uptake proteiner HCP1 og HRG1 kan give yderligere hæm til produktion af hæmoproteiner. Vi har detekteret derfor niveauerne af flere hæmoproteiner involveret i transport og udnyttelse af ilt. Cytoglobin er en hæmoprotein udtrykt i fibroblaster og sandsynligvis letter ilt transport og udnyttelse [47], [48]. I normale lunge epitelceller, blev cytoglobin ikke detekteret, men blev udtrykt håndfast i HCC4017 celler (figur 3A). Ligeledes niveauerne af tre andre hæmoproteiner involveret i oxygenudnyttelse, cytochrom c, CYP1B1 og Cox-2, blev også signifikant forøget (figur 3B-3D). Åbenbart, mens niveauerne af cytoglobin og cytochrom c blev reduceret, når intracellulært hæm forsyning blev sænket ved at dyrke celler i hæm-udtømte medium og ved behandling med hæm syntese inhibitor succinyl acetone, påvirket af hæm niveauer, niveauerne af CYP1B1 og Cox-2 var ikke. Dette kan skyldes de forskellige mekanismer, der styrer reguleringen af ​​disse proteiner. Måske hæm direkte regulerer ekspressionen af ​​cytoglobin og cytochrom c, mens en hæm-uafhængig mekanisme bidrager til øgede niveauer af CYP1B1 og Cox-2 i kræftceller. Alternativt kan hæm regulere ekspressionen af ​​CYP1B1 og Cox-2, men hæm regulatoriske koncentration kan være meget lavere end for ekspressionen af ​​cytoglobin og cytochrom c. Derfor kan lavere hæm niveau i succinylgrupper acetone-behandlede celler reducere niveauerne af cytoglobin og cytochrom c, men ikke CYP1B1 og Cox-2.

Den normale HBEC30KT lunge epitel (HBEC) og NSCLC HCC4017 (HCC) celler blev dyrket og behandlet som angivet. Proteinekstrakter blev fremstillet og niveauerne af hæmoproteiner blev detekteret ved Western blotting. Proteinet niveau af β-actin blev anvendt til normalisering. (A) Proteinet niveau af cytoglobin i normale og NSCLC-celler. (B) Proteinet niveau af cytochrom c i normale og NSCLC-celler. (C) Proteinet niveau af CYP1B1 i normale og NSCLC-celler. (D) Proteinet af cox-2 i normale og NSCLC-celler. Til statistisk analyse blev niveauerne i cancerceller sammenlignet med niveauerne i normale celler, ved anvendelse af Welch 2-prøve t-test. *, P-værdi 0,05; **, P-værdi. 0,005

kan også ses Effekten af ​​at sænke intracellulære hæm udbud på disse proteiner ved hjælp af immunfluorescensfarvning. F.eks Figur 4A viser, at ALAS1 udviste et mitokondrie lokalisering mønster, især når niveauet blev forøget i celler behandlet med succinyl acetone. Når baggrunden fluorescens var lav i panel SA (figur 4A), FITC fluorescens klart colocalized med fluorescensen fra MitoTracker, og mitokondrie mønster var meget klarere. Mønstret i panelet Ingen er mindre klar, sandsynligvis på grund af baggrundsfluorescens forårsaget af lavere ALAS1 og baggrund antistoffarvning. Figur 4B viser, at cytochrom c udviste en mitokondrie lokalisering mønster, men dens niveau blev reduceret i celler behandlet med succinyl acetone, og dens mitokondrie lokalisering blev også svækket. Resultaterne fra indirekte immunfluorescensfarvning er konsistente med resultaterne fra Western blotting. Tilsammen viser disse resultater, at øget hæm syntese og optagelsen er forbundet med forøget produktion af forskellige oxygen-udnyttende hæmoproteiner i cancerceller.

NSCLC HCC4017 (HCC) celler blev dyrket i regulære medium (ingen) eller i heme- depleteret medium indeholdende 0,5 mM succinyl acetone (SA). Celler blev farvet først med anti-ALAS1 eller anti-cytochrom C-antistoffer, og derefter med FITC-konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof, MitoTracker, samt DAPI. FITC, MitoTracker og DAPI fluorescerende billeder blev taget til fange og er vist her. Skalaen bar angiver 10 pm.

niveauerne i Hæm biosyntetisk Enzyme Ak, Hæm Optagelse Proteiner HCP1 og HRG1, og Oxygen-udnytte hæmoproteiner er Øget i forskellige menneskelige tumorxenoplantater

for at bestemme, om stigningen i det hastighedsbegrænsende hem biosyntetiske enzym Ak, hæm uptake proteiner og forskellige ilt-udnytte hæmoproteiner forekommer i lungetumorer, vi evaluerede niveauerne af disse proteiner i fem forskellige humane tumorxenoplantater (Figur 5). Figur 5A viser, at i alle xenotransplantattumorer blev ALAS1 protein udtrykt på niveauer sammenlignelig med den i HCC4017 celler, men væsentligt højere end i de normale HBEC30KT celler (se figur 1D). På samme måde blev niveauerne af hæm transportører HCP1 (figur 5B) og HRG1 (figur 5C) forhøjet i de xenotransplantattumorer. Niveauerne af hæm-holdige, oxygen-bindende proteiner cytoglobin (figur 5D) og cytochrom P450 CYP1B1 (figur 5E) blev også forøget i tumorerne. Disse resultater viser, at øget hæm syntese, optagelse og syntesen af ​​oxygen-udnyttende hæmoproteiner forekomme i forskellige lungeceller og tumorer.

Lysater fra de angivne humane tumor xenografter blev fremstillet, og blev påvist niveauerne af de angivne proteiner ved Western blotting. Proteinet niveau af β-actin blev anvendt til normalisering. (A) Proteinet niveau af ALAS1 i HCC4017 celler og i forskellige humane tumor-xenotransplantater. (B) Proteinet niveau af HCP1 i HCC4017 celler og i forskellige humane tumor-xenotransplantater. (C) Proteinet niveau af HRG1 i HCC4017 celler og i forskellige humane tumor-xenotransplantater. (D) Proteinet niveau cytoglobin i HCC4017 celler og i forskellige menneskelige tumorxenoplantater. (E) Proteinet niveau af CYP1B1 i HCC4017 celler og i forskellige menneskelige tumorxenoplantater. Til statistisk analyse blev niveauerne i HCC4017 celler og tumorer i forhold til niveauet i normale celler, ved anvendelse af Welch 2-prøve t-test. *, P-værdi 0,05; **, P-værdi. 0,005

Reduktion Hæm Tilgængelighed til NSCLC Cells Fortrinsvis Undertrykker iltforbrug

Øget syntese af ilt-udnytte hæmoproteiner sandsynligvis kan bidrage til øget iltforbrug i kræft celler. For at teste denne idé, vi undersøgte effekten af ​​nedbrydende hæm på ilt forbrug sats i kræft og normale lungeceller. Vi fandt, at iltforbrug i NSCLC-celler selektivt blev reduceret, når celler blev dyrket i hæm-udtømte medium (se figur 6, HD). I modsætning hertil hæm udtømning i mediet ikke påvirke oxygenforbrug i normale celler. Hæmning af endogen hæm syntese af succinyl acetone (HD + SA, figur 6) yderligere reduceret iltforbruget i kræftceller til et niveau svarende til niveauet i celler behandlet med mitokondrie afkobler CCCP. Succinyl acetone havde en mindre virkning på de normale celler samt (figur 6). Åbenbart, inhibering af hæm-oxygenase, det enzym der er involveret i hæm nedbrydning ved Tin protoporphyrin (SnPP, figur 6) ikke fortrinsvis rammer kræftceller. Især disse behandlinger har de samme virkninger på lungekræft A549 celler (ikke vist). Disse resultater viser, at rigelig forsyning af hæm er afgørende for at opretholde iltforbrug i NSCLC celler med en højere hastighed end i normale celler. De foreslår kraftigt, at forbedret hæm syntese og optagelse er nødvendige for øget iltforbrug i NSCLC celler.

Den normale HBEC30KT lunge epitel (HBEC) og NSCLC HCC4017 (HCC) celler blev dyrket og behandlet i normalt medium (Ingen) , i medium med hæm forarmet (HD), i medium med hæm forarmet og succinyl acetone (HD + SA), og i medium med CCCP. Celler blev opsamlet og forbrug oxygen satser blev detekteret og plottet her. Værdierne plottede var gennemsnit fra mindst tre eksperimenter. Til statistisk analyse blev niveauerne i cancerceller sammenlignet med niveauerne i normale celler, ved anvendelse af Welch 2-prøve t-test. *, P-værdi 0,05; **, P-værdi. 0,005

Hæmning af Hæm Syntese og mitokondriefunktionen Undertrykker kraftigste NSCLC Cell Proliferation, Colony Dannelse og Migration

For at vurdere effekten af ​​at hæmme hæm syntese og mitokondrie-funktionen på kræft celledeling og funktion, vi undersøgte lungekræft vækstrate, kolonidannelse og migration. Figur 7A viser, at inhibering af hæm syntese afbrudt væksten af ​​cancer HCC4017 celler hårdere end de normale HBEC30KT celler. Ligeledes mitokondrie afkobler CCCP afbrudt HCC4017 cellevækst mere alvorligt end HBEC30KT celler (Figur 7A). I modsætning hertil inhibering af hæm nedbrydning med SnPP ikke selektivt påvirke HCC4017 celleproliferation. De samme effekter blev observeret, når vi målte HCC4017 kolonidannelse. Som vist i figur 7B, både succinyl acetone og CCCP helt stoppet cancercelle kolonidannelse. Tilsætning af hæm stort set vendt virkningen af ​​inhibering af hæm syntese. Som forventet var hæmning af hæm nedbrydning af Tin protoporphyrin IX (SnPP) ikke væsentligt påvirker cancerceller kolonidannelse. Endvidere undersøgte vi effekten af ​​hæmmende hæm biosyntese og optagelse på HCC4017 celle migration. HCC4017 migration celle blev væsentligt hæmmet i medium med hæm forarmet og med succinyl acetone (Figur 7C). Tilsætning af hæm vender hæmning om migration. Vi forsøgte også at undersøge effekten af ​​banker ned hæm biosyntetiske enzymer i lungekræft celler ved hjælp shRNAs, der blev brugt til at banke ned hæm biosyntese i HeLa-celler [33]. Men vi var ikke i stand til at opnå kloner, der udviser lavere niveauer af hæm biosyntesen, sandsynligvis fordi de HCC4017 celler har en øget efterspørgsel efter højere niveauer af hæm, sænke hæm biosyntese ville formindske deres overlevelse. Disse resultater viser, at inhibering af hæm tilgængelighed og funktion væsentligt formindsker cancercelleproliferation, kolonidannelse, og migration. Salg

Celler behandlet med succinyl acetone blev også opretholdt i hæm-udtømte medium. (A) Reduktion hæm tilgængelighed eller mitokondrie funktion fortrinsvis reducerer NSCLC kræft celleproliferation. % levende celler blev beregnet ved at dividere antallet af behandlede celler med antallet af ubehandlede celler (podet med det samme antal celler). Det viser de relative proliferative satser behandlede celler (SA eller SNPP) vs. ubehandlede celler (Ingen). (B) Reduktion hæm tilgængelighed eller mitokondrie funktion reducerer fortrinsvis NSCLC celle kolonidannelse. (C) Reduktion hæm tilgængelighed reducerer fortrinsvis NSCLC celle migration.