PLoS ONE: aldehyddehydrogenase 1, en potentiel markør for Cancer Stamceller i human Sarcoma

Abstrakt

Tumorer indeholder en lille population af kræft stamceller (CSC) foreslået at være ansvarlig for tumor vedligeholdelse og tilbagefald. Aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1) aktivitet er blevet anvendt som en funktionel stamcellemarkør at isolere CSCS i forskellige typer cancer. Denne undersøgelse anvendte Aldefluor® assay og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -analyse til isolering ALDH1

høje celler fra fem humane sarcoma cellelinjer og én primær chordom cellelinie. ALDH1

høje celler spænder fra 0,3% (MUG-Chor1) til 4,1% (SW-1353) i gated celler. Immunhistokemisk farvning, analyse af klon dannelse effektivitet og xCELLigence mikroelektronik sensorteknologi afslørede, at ALDH1

høje celler fra alle sarkom cellelinjer har en øget spredning sats sammenlignet med ALDH1

lave celler. Ved at undersøge vigtige regulatorer af stamcellebiologi viste realtid RT-PCR-data en øget ekspression af c-myc, β-catenin, og SOX-2 i ALDH1

stor befolkning og en betydelig højere grad af ABCG2. Statistisk analyse af data viste, at ALDH1

høje celler af SW-982 og SW-1353 udviste højere resistens mod almindeligt anvendte kemoterapeutiske stoffer som doxorubicin, epirubicin, og cisplatin end ALDH1

lave celler. Denne undersøgelse viser, at i forskellige sarkom cellelinier, kan høj ALDH1 aktivitet anvendes til at identificere en subpopulation af celler, der er kendetegnet ved en signifikant højere proliferationshastighed, øget kolonidannende, forøget ekspression af ABC-transportørprotein gener og stemness markører sammenlignet med kontrolceller. Desuden blev forbedret resistens demonstreret

Henvisning:. Lohberger B, Rinner B, Stuendl N, Absenger M, Liegl-Atzwanger B, Walzer SM, et al. (2012) aldehyddehydrogenase 1, en potentiel markør for Cancer Stamceller i Human Sarkom. PLoS ONE 7 (8): e43664. doi: 10,1371 /journal.pone.0043664

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: 19. april, 2012; Accepteret: 23, 2012; Udgivet: August 23, 2012 |

Copyright: © Lohberger et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte ved det medicinske universitet i Graz (START tilskud), er OeNB tilskud (# 14356) og “EccoCell” tilskud taknemmeligt anerkendt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cellepopulation fleste tumorer er heterogen med hensyn til dens proliferation kapacitet og evnen til at initiere tumordannelse i immun-deficiente mus. En cancer stamceller (CSC) er defineret som en celle i en tumor, der besidder evnen til at forny sig selv og til at generere de heterogene afstamninger af cancerceller, der omfatter tumoren [1], [2]. Talrige undersøgelser har dokumenteret, at der findes CSCS i en række humane tumorer såsom hæmatopoietiske maligniteter, hjernesvulster, brystkræft og gastroenterologisk kræft [3], [4], [5], [6].

cytosoliske aldehyddehydrogenaser (ALDHs) er en gruppe af enzymer involveret i at oxidere en lang række intracellulære aldehyder til de tilsvarende carboxylsyrer [7]. Blandt afhandlinger enzymer, ALDH1 er fortegningen at have en vigtig rolle i oxidation af alkohol og vitamin A og i cyclophosphamid kemoresistens. Ginestier et al. [8] viste, at ALDH1 var en markør for normale og maligne humane mammae stamceller og en prædiktor for dårlig klinisk resultat af brystkræftpatienter. Høj ALDH1 aktivitet er blevet anvendt til at definere stamcellepopulationer i mange cancertyper, herunder human myelomatose, akut myeloid leukæmi [8], pancreascancer [9], og brystkræft [10]. Derfor kan ALDH1 aktivitet kunne bruges som en fælles markør for maligne stamcellepopulationer [11]. Svigt i cancer kemoterapi kan ske gennem øget udstrømning af kemoterapeutiske midler, hvilket fører til en reduktion af intracellulære narkotika niveauer og deraf følgende stof ufølsomhed. ABC transportører har kapacitet til at eksportere mange cytotoksiske lægemidler og nye oplysninger tyder på, at kræft stamceller fænotype er forbundet med højt niveau udtryk for ABCG2 transportør [12], [13], [14].

I dette studie, brugte vi den Aldefluor® assay og fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse for at isolere ALDH1

høje celler fra fem menneskelige sarkom cellelinjer og en nyligt etablerede chordom cellelinie. Vi analyserede ALDH1

høje celler

in vitro

for deres repopulation kapacitet, clonogenicity, celleproliferation egenskaber, udtryk for stamcelle markører og ABC transportører, og deres multiresistens kapacitet.

Materialer og metoder

Cell Culture

Alle humane sarkom cellelinier (SW-684, SW-872, SW-982, SW-1353, og TE-671 blev indhentet fra CLS ( Eppelheim, Tyskland) og dyrkes i Dulbecco-modificeret Eagle-medium (DMEM-F12) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 0,25 ug amphotericin B. MUG-Chor1 celler blev dyrket i IMDM /RPMI 1649 (4:01) (PAA, Pasching, Østrig) suppleret med 1% L-glutamin og 1% ITS (PAA). Alle celle inkubationen blev udført ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og kulturer periodisk kontrolleres for mycoplasma. Dyrkningsmedium og supplementer blev indkøbt fra Gibco @, Invitrogen (Darmstadt, Tyskland).

Fluorescens versus fremadrettet spredning blev vist i en densitet blot ud fra (a ) DEAB kontrolceller og (B) ALDH1-udtrykkende celler (kaldet ALDH1

høj). (C) ALDH1 ekspression i% af gatede celler. Den højeste andel af ALDH1

høje celler er repræsenteret ved SW-684-celler (1,77 ± 0,9%, n = 12), SW-982-celler (2,23 ± 1,0%, n = 11), og SW-1353 celler (2,69 ± 1,3%, n = 8). (D) Efter to uger dyrket den ALDH1

stor befolkning genereret en betydelig højere højde for ALDH1

høje celler. (E) Den forbedrede ALDH aktivitet blev også demonstreret ved western blot.

Aldefluor® Assay og Adskillelse af ALDH1

+ Cell Befolkning ved FACS analyse

Aldehyd dehydrogenase (ALDH) enzymaktivitet i levedygtige celler blev bestemt under anvendelse af et fluorogent farvestof baseret Aldefluor® assay (Stem Cell Technologies, Grenoble, Frankrig) ifølge producentens anvisninger. 1 × 10

6 /ml celler blev suspenderet i Aldefluor® assaybuffer indeholdende ALDH substrat (Bodipy-aminoacetaldehyd) og inkuberet i 45 minutter ved 37 ° C. Som reference kontrol blev cellerne suspenderet i puffer indeholdende Aldefluor® substrat i nærvær af diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en specifik ALDH1 enzyminhibitor. De lyst fluorescerende ALDH1-udtrykkende celler (ALDH1

høj) blev påvist i den grønne fluorescens kanal (520-540 nm) af FACSAria (BD Biosciences, San Diego, CA) og dataene blev analyseret under anvendelse af FACS DIVA software (BD Biosciences ). At udelukke ikke-levedygtige celler propidiumiodid. (PI, Sigma-Aldrich, Wien, Østrig) blev tilsat ved en slutkoncentration på 2 ug /ml

immunhistokemisk analyse ved anvendelse af anti-Ki-67 proliferationsmarkør afslørede en nedsat proliferation niveau af (A) SW-1353 ALDH1

lave celler og i forhold til (B) SW-1353 ALDH1

høje celler. (C-E) Dynamiske spredning kurver for ALDH1

høj og ALDH1

lave celler podet ved 10.000 celler per brønd målt med xCELLigence systemet.

Genbefolkning Assay

at sammenligne genoprettelse evne sarkom ALDH1

høje celler med ALDH1

lave celler

in vitro

, frisk sorteret celler blev dyrket separat under den samme kultur tilstand. Efter 2 uger blev cellerne re-farvet med Aldefluor® assay analyseres igen via FACSAria (BD Biosciences).

(A) Kvantificeringen af ​​klonen dannelse effektivitet fra SW-684, SW-982, og SW -1353 celler. Data fra fem uafhængige forsøg repræsenterer gennemsnitlige kimtal /godt efter 14 dage. (B) repræsentant kolonidannende enheder fra alle tre cellelinier.

Western blot-analyse

For total proteinanalyse, celler blev resuspenderet i lysepuffer (50 mM Tris-HCL pH 7,4, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM EDTA, 10% NP-40, 1% Triton-X og proteasehæmmere), inkuberet på is i 10 minutter og centrifugeret ved 15.000 rpm i 15 min. Alikvoter af proteinekstrakter (20 ug) blev separeret på 12% SDS-PAGE og elektro-blottet på 0,45 um Hybond ECL nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Membranen blev blokeret med 3% mælk blokerende buffer i 1 time og derefter inkuberet med de primære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur. Som det primære antistof, kanin polyklonalt ALDH1 /2-antistof (# sc50385; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) blev anvendt. Den største liver isoform ALDH1 lokaliseret til cytosolisk rum, mens ALDH2 lokaliseret til mitokondrierne. Blottene blev fremkaldt under anvendelse peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (Dako, Wien, Østrig) ved stuetemperatur i 1 time, og SuperSignal® West Pico kemoluminescerende substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL) i overensstemmelse med fabrikantens protokol.

ekspressionsniveauet blev normaliseret (ΔC

t) til ekspressionen af ​​mRNA for GAPDH, ACTB, og HPRT-n som en intern kontrol og i forhold til den tilsvarende ΔC

t (ΔΔC

t) i kontrollerne. De normaliserede ekspressionsniveauer fra (A) c-myc, (B) β-catenin, og (C) SOX-2 blev vist. (D) ABCG2 blev mere stærkt udtrykt i ALDH1

højt end i ALDH1

lave celler, mens p-værdier for (E) ABCA2 ikke var signifikant. (F) ALDH1

høje SW-1353 celler viste også en signifikant højere udtryk for ABCB1.

Immunhistokemi

Hver 1 × 10

4 ALDH

høj og ALDH

lave celler blev podet i polystyren kultur slides (BD Biosciences), fikseret med 4% formalin /PBS-opløsning, og dehydreres i en stigende serie af alkohol. Immunhistokemiske (IHC) undersøgelser ved hjælp af streptavidin-biotin peroxidase kompleks metode blev udført ansætte antistof mod anti Ki-67 (klon 30-9) kanin monoklonalt primært antistof (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) ved hjælp af den BenchMark Ultra instrument ( Ventana Medical Systems). Celler blev afbildet under anvendelse af et Olympus BX51 mikroskop med Olympus DP71 mikroskop digitalkamera. De farvede objektglas blev digitalt scannet og positive og negative celler blev kvantificeret under anvendelse af ImageScope software (ImageScope Virtual Slide, udgave 6.25, Aperio Technol., Vista, CA). Den positivitet = N positive celler /N totale celler.

Begge subopulations blev behandlet med 0-5,0 uM doxorubicin, 0-5,0 uM epirubicin, 1-100 uM cisplatin, og måles efter 48 timer. Middelværdi ± SD af alle målinger var udstyret ifølge Hill-ligningen. Signifikante forskelle på de enkelte koncentrationer blev indarbejdet i kurverne.

xCELLigence System

xCELLigence DP enhed fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland) kan anvendes til kvantitativ og dynamisk overvåge celle proliferation i realtid [15]. Henholdsvis 1 × 10

4 frisk sorteres ALDH1

høj og ALDH1

lave celler blev podet i elektroniske mikrotiterplader (E-Plate ™, Roche Diagnostic) og målt i 72 timer med xCELLigence systemet i overensstemmelse med instruktionerne i manualen. Anvendelse af en lav spænding (mindre end 20 mV) AC-signal fører til generering af et elektrisk felt, der interagerer med den ioniske miljø inde brøndene af E-Plader og differentielt moduleres med antallet af celler i brønden, den cellernes morfologi, og styrken af ​​cellebinding. målinger celledensitet blev udført i fire eksemplarer med en programmeret detekteringssignal hver 20 min og blev normaliseret til 6 timer tidspunkt. Dataindsamling og -analyse blev udført med RTCA software (version 1.2, Roche Diagnostics).

Colony Formation Assay

For at bestemme klon dannelse effektivitet (CFE) af sorterede celler

in vitro

, ALDH1

høj, ALDH1

lave celler og ufarvede celler (kontrol) blev talt, og 200 celler per brønd blev podet i seks brøndplader. Tredobbelte brønde blev anvendt til hver gruppe. Celler blev dyrket i DMEM-F12 med kosttilskud i 14 dage, fikseret i methanol i 10 min og farvet med krystalviolet (Sigma Aldrich, Hamburg, Tyskland). Klonen nummer, som bestod af mere end 50 celler blev talt. Den CFE blev beregnet efter formlen:. (Klonen nummer /the forgyldt celle nummer) × 100

Real-Time RT-PCR

Real-time RT-PCR blev udført i overensstemmelse med MIQE kriterier [16] for at bestemme den relative ekspression af ABC transporter-gener ABCG2 /BCRP1, ABCA2, og ABCB1 /MDR1 og stemness markører c-myc, β-catenin, og SOX-2. Totalt RNA blev isoleret med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge fabrikanternes anbefalede protokol. DNA blev fordøjet med 1 U DNase (Fermentas, St.Leon-Rot, Tyskland) pr ug RNA. 1 ug RNA blev revers transskriberet under anvendelse RevertAid cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Real-time PCR reaktioner blev udført i triplikater under anvendelse af Platinum SYBR Green Super Mix med ROX (Invitrogen) på AB7900HT (Applied Biosystems, Invitrogen). Husholdning gener glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), β-actin (ACTB) og hypoxanthin phosphoribosyltransferase (HPRT-n) tjente som en intern kontrol på grund af deres stabile udtryk i forskellige væv. Tabel 1 angiver de anvendte primere til real-time PCR. De Ekspressionsniveauerne blev beregnet på grundlag af 2

-ΔΔCT metode [17].

Drug Følsomhed Assay

Sorterede celler blev justeret til en tæthed på 5 × 10

3 celler /100 pi og inkuberet i 96-brønds mikroplader. Cellerne blev eksponeret for forskellige koncentrationer af kemoterapeutiske lægemidler (doxorubicinhydrochlorid, epirubicinhydrochlorid og

cis

-diammineplatinum (II) chlorid (cisplatin); Sigma-Aldrich) i 48 timer. Kemoterapeutisk lægemiddel følsomhed blev bestemt ved MTS assay (Promega, Mannheim, Tyskland) efter producentens anvisninger i quatruplicates bruger et fotometer (Spektramax;. BMG Labtech, Offenburg, Tyskland) ved en bølgelængde på 490 nm. IC

50 værdier blev bestemt ud fra væksten hæmning data.

Statistisk analyse

Resultatet variabler blev udtrykt som middel ± SD. Students uparrede

t

-test og den nøjagtige Wilcoxons test blev anvendt til at evaluere forskelle mellem grupper med PASW Statistics 18 software (IBM Corporation, Somers, NY). Tosidet

P

-værdier under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. IC

50 blev tilpasset efter den Hill-ligningen (sigmoideum, 3 parametre). Grafiske data blev forberedt med SigmaPlot® (Systat Software Inc., San Jose, CA).

Resultater

sarkom cellelinier Vis en Distinctive Fraktion af ALDH1

høje Cells

Aldefluor® assaysystemet er blevet udviklet til at påvise aktiviteten af ​​ALDH1 isoformen. Vi brugte denne analyse efterfulgt af FACS-analyse for at vurdere tilstedeværelsen og mængden af ​​ALDH1

høje cellepopulationer i fem menneskelige sarkom cellelinjer og én chordom cellelinje [18].

For at indstille en markør for ALDH1

høje celler DEAB kontrol celler blev brugt til at sikre nøjagtigheden af ​​analysen. De repræsentative SW 1353-celler blev behandlet i nærvær af ALDH1 inhibitoren DEAB (figur 1A) eller farvet med Aldefluor® reagens, der er defineret som ALDH1

høje celler (Figur 1B). Sortering forsøg er blevet udført mindst fem gange på hver cellelinie. Mængden af ​​ALDH1

høje celler givet i gennemsnit ± SD var 1,77 ± 0,9% for fibrosarcoma cellelinien SW-684 (n = 12), 0,77 ± 0,4% for liposarkom cellelinien SW-872 (n = 5) , 2,23 ± 1,0% for synovial sarkom-cellelinjen SW-982 (n = 11), og 2,69 ± 1,3% for chondrosarcoma cellelinien SW 1353 (n = 8) hhv. Den chordom cellelinje MUG-Chor 1 viste kun en lille del af 1,11 ± 0,5% ALDH1

høje celler (n = 9) (figur 1C). Vi fokuserede derfor på de tre sarkom cellelinjer SW-684, SW-982, og SW-1353 i de følgende forsøg. I genoprettelse assay den ALDH1

stor befolkning genereret en statistik signifikant højere hensyn til 41,73 ± 18,5% (* p = 0,0039) ALDH1

høje celler i SW-684 celler, 52,5 ± 8,75% (* p = 4,39 E-07) i SW-982-cellelinien, og 31,7 ± 11,1% (* p = 0,0025) (n = 5) i SW-1353 chondrosarcoma celler (figur 1D). Yderligere vores observationer af forøget ALDH1 udtryk kan yderligere underbygges af western blot analyse (figur 1E, tabel 2).

ALDH1

høje Celler Vis Højere spredning og Clonogenicity

Brug af ImageScope software Ki-67 positive og negative celler blev kvantificeret efter immunhistokemisk farvning. ALDH1

høje celler fra alle tre cellelinier har en øget spredning niveau i forhold til ALDH1

lave celler. Repræsentativt farvning af SW-982 ALDH1

høj (figur 2A) og ALDH1

Lav celler (figur 2B) er vist og sammenfattet i tabel 2 (n = 5). Desuden ALDH1

høj og ALDH1

lave celler afveg betydeligt i logaritmisk vækst hastighed målt med xCELLigence-system (Figur 2C-E).

Figur 3A viser den klonogene aktivitet ALDH1

høje og ALDH1

lave celler. Data fra fem uafhængige forsøg repræsenterer gennemsnitlige kimtal /brønd efter 14 dage, og alle værdier er anført i tabel 2. klon dannelse effektivitet var signifikant højere i SW-1353 ALDH1

høje celler sammenlignet med tilsvarende ALDH1

lave celler ( * p = 0,0005). For de andre to cellelinjer disse virkning også kunne påvises, men i mindre omfang. Det højere antal kolonier i SW-684, SW-982, og SW-1353 ALDH

høje celler præsenteres (figur 3B).

mRNA Angivelse af ABCG2, c-myc, β- catenin, og SOX-2 er opreguleret i ALDH1

høje Cells

Vi undersøgte, om ALDH1

høje celler er beriget til ekspression af gener, der er blevet postuleret at spille nøgleroller i stamcellebiologi, såsom som c-myc, β-catenin, og SOX-2 [19]. Kvantitativ RT-PCR viste forøget ekspression af c-myc i ALDH1

stor befolkning, mens usorterede kontrolceller (CTRL) og ALDH1

lave celler havde kun minimal ekspression (figur 4A). Tilsvarende vil en svag, men ikke signifikant stigning i ekspressionen af ​​β-catenin, og SOX-2 i ALDH1

høj fraktion kunne observeres (n = 6) (figur 4B-C).

relative udtryk for de tre store narkotika transportører ABCG2 /BCRP1, ABCA2, og ABCB1 /MDR1 blev bestemt ved real-time RT-PCR (n = 5). Interessant ALDH1

stor befolkning af alle sarkom cellelinjer demonstrerede, med statistisk signifikans, øget ekspressionsniveauer for ABCG2 forhold til at styre eller ALDH1

lave celler (figur 4D), mens p-værdi for ABCA2 ikke var signifikant (figur 4E). Desuden kunne i ALDH1

høje SW-1353 celler en statistik signifikant højere ekspression af ABCB1 (p = 0,0302) observeres (figur 4F). De 2

-ΔΔCT værdier og de tilsvarende p-værdier er angivet i tabel 2.

ALDH1

høje Celler Vis Enhanced Drug Resistance

kræft stamceller hypotese foreslår, at uoverensstemmelse mellem behandlingsrespons og patientoverlevelse noteret i de fleste cancertyper afspejler en iboende modstand af kræft stamceller til kemoterapi. For at undersøge eventuelle forskelle i resistens ALDH1

høje og ALDH1

lav sorteres SW-982 og SW-1353 celler blev behandlet med stigende doser af tre almindeligt anvendte kemoterapeutiske stoffer efter en to ugers opsving fase. ALDH1

høje SW-982 celler behandlet i 48 timer med 1,0 pM (p = 0,016) og 5,0 pM (p = 0,001) doxorubicin var signifikant forøget sammenlignet med ALDH1

lave celler (figur 5A). Behandling med 1,0 pM epirubicin (p = 0,045) inducerede en forbedret lægemiddelresistens (figur 5B). SW 1353 ALDH1

høje celler viste en lignende signifikant virkning efter behandlingen med 5,0 uM doxorubicin (p = 2.77E-05) (figur 5D) og 0,5 uM epirubicin (p = 0,039) og 1,0 uM epirubicin (p = 0,021 ) (figur 5E). Behandlingen med cisplatin forårsagede kun små forskelle mellem ALDH1

høje og ALDH1

lav SW-982 og SW-1353 celler (figur 5C og 5F). I fibrosarcom-cellelinie kunne detekteres SW-684 ingen signifikante forskelle. Middelværdi ± SD af alle forsøg var udstyret ifølge Hill-ligningen. Den tilsvarende beregnede IC

50 værdier er anført i tabel 2.

Diskussion

Baseret på den nuværende cancer stamceller (CSC) hypotese, kun en lille delpopulation i heterogene tumor befolkning er kan igangsætte og re-initierende tumorer. Begrebet CSCS var baseret på den iagttagelse, at når kræftceller af mange forskellige typer blev analyseret for deres proliferative potentiale i forskellige assays

in vitro

in vivo

, kun et mindretal af celler viste omfattende spredning [20]. CSCS er blevet identificeret i en række forskellige maligniteter [21], [22], [23]. En widly accepteret fremgangsmåde til identifikation CSCS er baseret på den enzymatiske aktivitet af aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1), en afgiftende enzym ansvarligt for oxidation af intracellulære aldehyder [8], [21]. Der er forskellige isoformer af ALDH. Den Aldefluor® assaysystemet er blevet udviklet til at påvise aktiviteten af ​​ALDH1 isoformen. ALDH1 aktivitet viste øges i CSCS og er blevet anvendt til at isolere CSCS i forskellige cancere [24], [25], [26]. Derfor ALDH1

høje celler vise flere funktioner, der typisk ses i CSCS, herunder evnen til selv-fornyelse, generering af differentieret afkom, og forøget ekspression af stamceller celle markørgener. Studiet af CSC biologi er baseret på evnen til præcist at vurdere CSC repræsentation i kræft celle populationer. Som foreslået af nyere fund CSC repræsentation kan være en funktion af den celletype, oprindelsesland, stromale mikromiljø, akkumuleret somatiske mutationer og stadium af malign progression nås med en tumor [27], [28].

Til dato eksistensen af ​​sådan en stilk-lignende cellepopulation i human osteosarkom og Ewings sarkom cellelinjer har været baseret på ekspressionen af ​​stamcelle markørgener samt deres evne til at danne sfæroider

in vitro

[29], [30], [31]. Det er blevet foreslået, at identifikation af CSC ikke udelukkende kan påberåbe sig side befolkning (SP) sortering ved anvendelse udstrømning af Hoechst 33342 farvestof. Men SP fænotype ikke er præsenteret i alle CSCS og der kan findes andre forsvarsmekanismer for CSCS at unddrage sig lægemiddelbehandlinger, som ikke kan identificeres af Hoechst farvestof farvning [32]. Derfor valgte vi markøren ALDH1. Vores resultater viser, at alle fem sarkom cellelinjer indeholdt forskellige procentdel af ALDH1

høje celler, med den højeste procentdel i fibrosarkom, synovial sarkom, og chondrosarcoma cellelinjer. Den lille ALDH1 ekspression af ALDH

Lav celler i Western blot-analyse kan forklares ved anvendelse af ALDH1 /2 primære antistof. Spredningen sats og clonogenicity af SW-684, SW-982, og SW-1353 ALDH1

høje celler

in vitro

var væsentligt højere end for ALDH1

lave celler, i overensstemmelse med de særlige kendetegn ved den høje ALDH1 aktivitet fænotype i andre kræftceller [33], [34], hvilket kan indikere, at ALDH1

høje celler fra sarkom er delvist ansvarlig for tumor metastase og tilbagefald og bør være fokuseret under kræftbehandlingen. C-Myc er for nylig blevet anerkendt som en vigtig regulator stamcellebiologiske, kan den tjene som et link forbinder malignitet og “stemness” [35]. Introduktion af c-Myc med andre transkriptionsfaktorer (herunder SOX-2) genererer induceret pluripotente stamceller fra differentierede celler [36]. Wnt /β-catenin signalering spiller en vigtig rolle, ikke kun i kræft, men også i cancer stamceller [37]. Vores kvantitative RT-PCR-data viste øget ekspression af c-myc, β-catenin, og SOX-2 i ALDH1

stor befolkning, mens usorterede kontrol celler (Ctrl) og ALDH1

lave celler havde kun minimal udtryk.

En foreslået mekanisme for kemoterapi modstand cancerstamceller er baseret på den forøgede ekspression af ATP-bindende kassette (ABC) transportproteiner, som er ansvarlige for drug efflux. Højere ekspression af ABC transportproteiner i stamceller sammenlignet med ikke-stamceller resulterer i relativ modstand af stamcellerne til de toksiske virkninger af kemoterapi narkotika [12], [13]. Vi analyserede mRNA ekspressionen af ​​tre store narkotika transportører (ABCG2 /BCRP1, ABCA2, ABCB1 /MDR1) ABC transporter familie. I den foreliggende undersøgelse blev ABCG2 opreguleret i ALDH1

høje celler fra alle tre sarkom cellelinier. Desuden blev en anden ABC transporter ABCB1 /MDR1 også fundet med højere mRNA ekspressionsniveauet i SW-1353 ALDH1

høje celler sammenlignet med ALDH1

lave celler. Disse gener kan være ansvarlige for multiresistens af kræftceller og bør være ideelle mål for klinisk kræftbehandling.

Yderligere, ALDH1

høje celler viste øget resistens over for almindeligt anvendte kemoterapeutiske stoffer. ALDH1

høje celler af SW-982 og SW-1353 viste signifikant lavere følsomhed over for både doxorubicin og epirubicin sammenlignet med ALDH1

lave celler. Den cisplatin behandling viste kun små forskelle. Sammen vi med succes isoleret ALDH1

høje celler fra forskellige sarkom cellelinjer ved hjælp af Aldefluor® analysen. ALDH1

høje celler udviste

in vitro

en signifikant højere spredning rente øget klon dannelse effektivitet, forhøjet udtryk for ABC transportvirksomheder og stemness markør, samt øget kemoterapeutiske resistens i forhold til ALDH1

lave celler .

som konklusion, kunne tilstedeværelsen af ​​stamceller-lignende celler med forøget ALDH1 udtryk være en af ​​de mulige bidragydere til udvikling af resistens i sarkomer. Yderligere undersøgelser vil være forpligtet til at definere sarkom stamceller og mekanismerne for resistens, men ALDH1

stor befolkning kan tjene som

in vitro

model til at søge efter nye terapeutiske behandlingsmuligheder.

tak

forfatterne vil gerne takke Heike Kaltenegger og Alexandra Novak for fremragende teknisk bistand.